Download Luận văn Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật real-Time PCR
Trình tự của các primer và probe phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng ADV của HBV
đã được trình bày trong bảng 3.1 ở chương 3.
Vì các đột biến kháng thuốc trong đề tài nghiên cứu thuộc dạng đột biến điểm, do vậy trình tự
hoang dại và trình tự đột biến chỉ khác nhau bởi một nucleotide. Để phân biệt sự khác nhau này chúng
tôi thiết kế các đoạn mồi ngược bắt cặp hoàn toàn với trình tự đột biến và có một mismatch ở
nucleotide thứ nhất tính từ đầu 3’-OH khi bắt cặp với trình tự hoang dại. Các mồi này đi kèm với các
mồi xuôi bắt cặp hoàn toàn với cả trình tự hoang dại lẫn trình tự đột biến.
Trình tự của mồi F181 và R236 có một số nucleotide thay thế vì tại các vị trí này có thể có hai
hay nhiều loại nucleotide chiếm tỷ lệ tương đương nhau. Các mồi này còn gọi là các mồi suy biến, vì
có nhiều lựa chọn khác nhau ở một số vị trí base trên trình tự. Mồi F181 chỉ có một vị trí sử dụng
nucleotide thay thế và nó không nằm trong số 5 nucleotide ở mỗi đầu của mồi nên không ảnh hưởng
đến sự nhân bản và độ đặc hiệu của mồi. Mồi R236 có 5 vị trí sử dụng base thay thế. Nó cho một hỗn
hợp 256 oligonucleotide khác nhau. Nếu làm như thế thì rất tốn kém vì giá mồi rất đắt. Mồi suy biến
được chứng minh là một công cụ rất hữu hiệu dùng để nhân bản hầu hết các gen của cùng một họ
tương đồng về cấu trúc [17]
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
- Taq DNA polymerase;
- Dung dịch MgCl2.
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Thiết kế các cặp primer và TaqMan probe đặc hiệu với các vị trí đột biến kháng ADV của HBV
bằng phần mềm chuyên dụng và các công cụ trên NCBI và IDT.
- Tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng real-time PCR, tiến hành khảo sát các thông số sau: khả
năng nhân bản của hệ primer-probe, nhiệt độ lai, nồng độ primer và probe, nồng độ Mg2+, độ nhạy của
phản ứng, độ đặc hiệu của hệ primer và probe.
- Thiết lập quy trình phản ứng phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng ADV của HBV
bằng kỹ thuật real-time PCR.
- Tiến hành chạy trên một số mẫu bệnh phẩm.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp thiết kế và kiểm tra các oligonucleotide (mồi và mẫu dò) bằng cơ sở dữ liệu
trên IDT và các phần mềm sinh học chuyên dụng như ClustalX và Annhyb
2.3.1.1 Các bước tiến hành
Vì đột biến kháng ADV nằm trên vùng RT của gen HBV polymerase, do vậy, chúng tui thu thập
tất cả các trình tự về vùng gen HBV Polymerase đã được xác định cho đến nay từ ngân hàng dữ liệu
gen NCBI (National Center for Biology Information).
Sau đó, chúng tui tiến hành so hàng (alignment) trên tất cả các trình tự tải về bằng phần mềm
ClustalX. Dựa trên sự so hàng và kết quả công bố của các bài báo trước đó, chúng tui chọn các vùng
gen để thiết kế các cặp mồi (primer) và mẫu dò (probe) tương ứng với các đột biến kháng ADV tại hai
vị trí là rt181 và rt236.
Đặc tính của các oligonucleotide thiết kế được kiểm tra và chỉnh sửa để phù hợp với tiêu chuẩn
(%GC, Tm…) bằng phần mềm trực tuyến OligoAnalyzer (IDT) và Annhyb.
Sau khi đã thiết kế được các cặp mồi và mẫu dò có các thông số phù hợp, tui tiến hành Blast
search với các trình tự DNA có trên Ngân hàng dữ liệu gen của NCBI để xác định các trình tự mồi và
mẫu đã thiết kế là đặc hiệu cao với DNA đích của HBV.
2.3.1.2 Các nguyên tắc thiết kế các oligonucleotide
* Nguyên tắc thiết kế mồi [10,17,21]
- Chúng tui thiết kế các mồi ngược bắt cặp đặc hiệu với các vị trí đột biến, mồi xuôi bắt cặp hoàn
toàn với cả bản mẫu hoang dại và đột biến.
- Mồi thường dài từ 15-30 nucleotide. Hàm lượng GC cho phép khoảng 20-80% (tốt nhất là 50-
60%). Nucleotide G và C phải được phân bố đều khắp trình tự thiết kế. Thiết kế mồi sao cho base G và
C nằm ở hai đầu của mồi. Tránh trường hợp đầu 3’ của mồi có nhiều hơn 3 nucleotide G hay C, vì
mồi không đặc hiệu có thể được tạo ra.
- Nhiệt độ nóng chảy của các mồi xuôi và ngược chênh nhau không quá 50C, và kiểm soát nhiệt
độ nóng chảy (Tm) của các mồi nằm trong khoảng 50-65
0C.
- Mồi không được tự bắt cặp bổ sung hay bắt cặp bổ sung với mồi khác trong hỗn hợp phản ứng
tạo thành các cấu trúc thứ cấp như:
Self-dimer: Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base của các mồi
giống nhau.
Hairpin loop (Cấu trúc kẹp tóc): Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các
base trong cùng một mồi, đặc biệt nên tránh cấu trúc kẹp tóc chìm sâu ở đầu 3’ của mồi.
Hetero-dimer: Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base của
oligonucleotide khác nhau.
- Năng lượng tự do (∆G) giữa các cấu trúc thứ cấp không vượt quá -9kcal.mol-1.
* Nguyên tắc thiết kế mẫu dò [17,21]
Nguyên tắc thiết kế mẫu dò cũng tương tự như nguyên tắc thiết kế mồi:
- Mẫu dò bắt cặp đặc hiệu với cả bản mẫu hoang dại và đột biến, nằm giữa hai mồi xuôi và ngược.
- Thành phần GC trong trình tự nucleotide của mẫu dò phải nằm trong khoảng 30-80%.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mẫu dò phải lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của các mồi từ 5-10
0C
nhằm đảm bảo cho việc bắt cặp hoàn toàn với sợi DNA khuôn trong bước bắt cặp và kéo dài của chu
kỳ PCR.
- Không nên có G ở đầu 5’ của mẫu dò vì G có thể hấp thu ánh sáng huỳnh quang ngay cả khi
mẫu DNA bị phân giải bởi Taq polymerase.
2.3.1.3 Các phần mềm máy tính sử dụng
- ClustalX 1,83;
- Annhyb 4,930 (Olivier Friard, Hoa Kỳ);
- Phần mềm trực tuyến BLAST (NCBI, Hoa Kỳ);
- Phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3,0 (IDT, Hoa Kỳ);
- Phần mềm trực tuyến thiết kế primer:
2.3.2 Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu từ bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng.
- Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vòng/phút trong 15 phút.
- Thu khoảng 0,5ml huyết thanh chuyển vào 1 eppendorf 1,5ml sạch.
- Giữ eppendorf huyết thanh ở -200C cho đến khi tiến hành xét nghiệm.
2.3.3 Phương pháp tách chiết HBV DNA
Để tách chiết HBV DNA, chúng tui sử dụng phương pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987).
2.3.3.1 Nguyên tắc
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dùng các tác nhân biến tính mạnh để phá vỡ vỏ bao
của virus và loại bỏ các thành phần không mong muốn (protein…). Để thu nhận DNA tinh sạch, ta cần
loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. DNA sẽ được tủa bởi isopropanol ở
điều kiện lạnh và thu lại qua các lần ly tâm. Sau đó, cặn DNA được huyền phù trong TE 1X và bảo
quản ở -20oC.
2.3.3.2 Cách tiến hành
- Đánh dấu các tube vô trùng bằng ký hiệu mẫu.
- Cho 200μl mẫu (huyết thanh) vào 1 tube vô trùng có sẵn 900μl dung dịch 1, vortex 30 giây, để
yên 10 phút. Thêm vào 200μl dung dịch 2, trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10
phút.
- Thu 600μl dịch nổi có chứa DNA (chú ý chỉ thu dịch nổi) vào 1 tube vô trùng khác có sẵn 600μl
dung dịch 3 (trộn đều trước khi sử dụng). Sau đó, trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút
trong 10 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (tránh loại bỏ phần cặn). Cho từ từ 900μl dung dịch 4 vào.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ hết dịch nổi (dùng pipet 200μl hút sạch phần dịch nổi), thu cặn (tránh loại bỏ luôn phần
cặn). Để khô ở 600C trong 10-15 phút. Cho vào 50μl dung dịch 5.
- Bảo quản mẫu DNA ở -200C.
2.3.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp tạo
dòng in vitro (không cần sự hiện diện của tế bào) tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích
DNA ban đầu, nhờ hoạt động của DNA polymerase và một cặp mồi đặc hiệu.
Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho
loài vi sinh vật mục tiêu. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của
mạch khuôn. Nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới
có trình tự bổ sung ngược chiều với mạch khuôn. Nếu có hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung ở hai đầu
của một trình tự DNA, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR, số
lượng bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được nhân lên (khuếch đại) đến mức có thể thấy
được vạch DNA sau khi nhuộm bằng ethidium bromide. Vậy để khuếch đại một trình tự DNA xác
định, cần có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn
DNA ...
Download miễn phí Luận văn Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật real-Time PCR
Trình tự của các primer và probe phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng ADV của HBV
đã được trình bày trong bảng 3.1 ở chương 3.
Vì các đột biến kháng thuốc trong đề tài nghiên cứu thuộc dạng đột biến điểm, do vậy trình tự
hoang dại và trình tự đột biến chỉ khác nhau bởi một nucleotide. Để phân biệt sự khác nhau này chúng
tôi thiết kế các đoạn mồi ngược bắt cặp hoàn toàn với trình tự đột biến và có một mismatch ở
nucleotide thứ nhất tính từ đầu 3’-OH khi bắt cặp với trình tự hoang dại. Các mồi này đi kèm với các
mồi xuôi bắt cặp hoàn toàn với cả trình tự hoang dại lẫn trình tự đột biến.
Trình tự của mồi F181 và R236 có một số nucleotide thay thế vì tại các vị trí này có thể có hai
hay nhiều loại nucleotide chiếm tỷ lệ tương đương nhau. Các mồi này còn gọi là các mồi suy biến, vì
có nhiều lựa chọn khác nhau ở một số vị trí base trên trình tự. Mồi F181 chỉ có một vị trí sử dụng
nucleotide thay thế và nó không nằm trong số 5 nucleotide ở mỗi đầu của mồi nên không ảnh hưởng
đến sự nhân bản và độ đặc hiệu của mồi. Mồi R236 có 5 vị trí sử dụng base thay thế. Nó cho một hỗn
hợp 256 oligonucleotide khác nhau. Nếu làm như thế thì rất tốn kém vì giá mồi rất đắt. Mồi suy biến
được chứng minh là một công cụ rất hữu hiệu dùng để nhân bản hầu hết các gen của cùng một họ
tương đồng về cấu trúc [17]
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
TTP;- Taq DNA polymerase;
- Dung dịch MgCl2.
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Thiết kế các cặp primer và TaqMan probe đặc hiệu với các vị trí đột biến kháng ADV của HBV
bằng phần mềm chuyên dụng và các công cụ trên NCBI và IDT.
- Tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng real-time PCR, tiến hành khảo sát các thông số sau: khả
năng nhân bản của hệ primer-probe, nhiệt độ lai, nồng độ primer và probe, nồng độ Mg2+, độ nhạy của
phản ứng, độ đặc hiệu của hệ primer và probe.
- Thiết lập quy trình phản ứng phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng ADV của HBV
bằng kỹ thuật real-time PCR.
- Tiến hành chạy trên một số mẫu bệnh phẩm.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp thiết kế và kiểm tra các oligonucleotide (mồi và mẫu dò) bằng cơ sở dữ liệu
trên IDT và các phần mềm sinh học chuyên dụng như ClustalX và Annhyb
2.3.1.1 Các bước tiến hành
Vì đột biến kháng ADV nằm trên vùng RT của gen HBV polymerase, do vậy, chúng tui thu thập
tất cả các trình tự về vùng gen HBV Polymerase đã được xác định cho đến nay từ ngân hàng dữ liệu
gen NCBI (National Center for Biology Information).
Sau đó, chúng tui tiến hành so hàng (alignment) trên tất cả các trình tự tải về bằng phần mềm
ClustalX. Dựa trên sự so hàng và kết quả công bố của các bài báo trước đó, chúng tui chọn các vùng
gen để thiết kế các cặp mồi (primer) và mẫu dò (probe) tương ứng với các đột biến kháng ADV tại hai
vị trí là rt181 và rt236.
Đặc tính của các oligonucleotide thiết kế được kiểm tra và chỉnh sửa để phù hợp với tiêu chuẩn
(%GC, Tm…) bằng phần mềm trực tuyến OligoAnalyzer (IDT) và Annhyb.
Sau khi đã thiết kế được các cặp mồi và mẫu dò có các thông số phù hợp, tui tiến hành Blast
search với các trình tự DNA có trên Ngân hàng dữ liệu gen của NCBI để xác định các trình tự mồi và
mẫu đã thiết kế là đặc hiệu cao với DNA đích của HBV.
2.3.1.2 Các nguyên tắc thiết kế các oligonucleotide
* Nguyên tắc thiết kế mồi [10,17,21]
- Chúng tui thiết kế các mồi ngược bắt cặp đặc hiệu với các vị trí đột biến, mồi xuôi bắt cặp hoàn
toàn với cả bản mẫu hoang dại và đột biến.
- Mồi thường dài từ 15-30 nucleotide. Hàm lượng GC cho phép khoảng 20-80% (tốt nhất là 50-
60%). Nucleotide G và C phải được phân bố đều khắp trình tự thiết kế. Thiết kế mồi sao cho base G và
C nằm ở hai đầu của mồi. Tránh trường hợp đầu 3’ của mồi có nhiều hơn 3 nucleotide G hay C, vì
mồi không đặc hiệu có thể được tạo ra.
- Nhiệt độ nóng chảy của các mồi xuôi và ngược chênh nhau không quá 50C, và kiểm soát nhiệt
độ nóng chảy (Tm) của các mồi nằm trong khoảng 50-65
0C.
- Mồi không được tự bắt cặp bổ sung hay bắt cặp bổ sung với mồi khác trong hỗn hợp phản ứng
tạo thành các cấu trúc thứ cấp như:
Self-dimer: Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base của các mồi
giống nhau.
Hairpin loop (Cấu trúc kẹp tóc): Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các
base trong cùng một mồi, đặc biệt nên tránh cấu trúc kẹp tóc chìm sâu ở đầu 3’ của mồi.
Hetero-dimer: Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base của
oligonucleotide khác nhau.
- Năng lượng tự do (∆G) giữa các cấu trúc thứ cấp không vượt quá -9kcal.mol-1.
* Nguyên tắc thiết kế mẫu dò [17,21]
Nguyên tắc thiết kế mẫu dò cũng tương tự như nguyên tắc thiết kế mồi:
- Mẫu dò bắt cặp đặc hiệu với cả bản mẫu hoang dại và đột biến, nằm giữa hai mồi xuôi và ngược.
- Thành phần GC trong trình tự nucleotide của mẫu dò phải nằm trong khoảng 30-80%.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mẫu dò phải lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của các mồi từ 5-10
0C
nhằm đảm bảo cho việc bắt cặp hoàn toàn với sợi DNA khuôn trong bước bắt cặp và kéo dài của chu
kỳ PCR.
- Không nên có G ở đầu 5’ của mẫu dò vì G có thể hấp thu ánh sáng huỳnh quang ngay cả khi
mẫu DNA bị phân giải bởi Taq polymerase.
2.3.1.3 Các phần mềm máy tính sử dụng
- ClustalX 1,83;
- Annhyb 4,930 (Olivier Friard, Hoa Kỳ);
- Phần mềm trực tuyến BLAST (NCBI, Hoa Kỳ);
- Phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3,0 (IDT, Hoa Kỳ);
- Phần mềm trực tuyến thiết kế primer:
2.3.2 Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu từ bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng.
- Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vòng/phút trong 15 phút.
- Thu khoảng 0,5ml huyết thanh chuyển vào 1 eppendorf 1,5ml sạch.
- Giữ eppendorf huyết thanh ở -200C cho đến khi tiến hành xét nghiệm.
2.3.3 Phương pháp tách chiết HBV DNA
Để tách chiết HBV DNA, chúng tui sử dụng phương pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987).
2.3.3.1 Nguyên tắc
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dùng các tác nhân biến tính mạnh để phá vỡ vỏ bao
của virus và loại bỏ các thành phần không mong muốn (protein…). Để thu nhận DNA tinh sạch, ta cần
loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. DNA sẽ được tủa bởi isopropanol ở
điều kiện lạnh và thu lại qua các lần ly tâm. Sau đó, cặn DNA được huyền phù trong TE 1X và bảo
quản ở -20oC.
2.3.3.2 Cách tiến hành
- Đánh dấu các tube vô trùng bằng ký hiệu mẫu.
- Cho 200μl mẫu (huyết thanh) vào 1 tube vô trùng có sẵn 900μl dung dịch 1, vortex 30 giây, để
yên 10 phút. Thêm vào 200μl dung dịch 2, trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10
phút.
- Thu 600μl dịch nổi có chứa DNA (chú ý chỉ thu dịch nổi) vào 1 tube vô trùng khác có sẵn 600μl
dung dịch 3 (trộn đều trước khi sử dụng). Sau đó, trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút
trong 10 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (tránh loại bỏ phần cặn). Cho từ từ 900μl dung dịch 4 vào.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ hết dịch nổi (dùng pipet 200μl hút sạch phần dịch nổi), thu cặn (tránh loại bỏ luôn phần
cặn). Để khô ở 600C trong 10-15 phút. Cho vào 50μl dung dịch 5.
- Bảo quản mẫu DNA ở -200C.
2.3.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp tạo
dòng in vitro (không cần sự hiện diện của tế bào) tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích
DNA ban đầu, nhờ hoạt động của DNA polymerase và một cặp mồi đặc hiệu.
Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho
loài vi sinh vật mục tiêu. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của
mạch khuôn. Nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới
có trình tự bổ sung ngược chiều với mạch khuôn. Nếu có hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung ở hai đầu
của một trình tự DNA, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR, số
lượng bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được nhân lên (khuếch đại) đến mức có thể thấy
được vạch DNA sau khi nhuộm bằng ethidium bromide. Vậy để khuếch đại một trình tự DNA xác
định, cần có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn
DNA ...