LINK TẢI LUẬN VĂN MIỄN PHÍ CHO AE KET-NOI
Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phương pháp HPLC
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỤC LỤC...................................................................................................................i
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN.....................................................................................2
1.1. Giới thiệu về họ Hoa môi (Lamiaceae) 2 1.2. Chi Rosmarinus 2 1.3. Loài Hương thảo (R. officinalis L.) 3
1.3.1. Đặc điểm thực vật .....................................................................................3 1.3.2. Nguồn gốc phân bố ...................................................................................4 1.3.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học ...........................................4 1.3.4. Công dụng và hoạt tính sinh học loài R. officinalis ..................................9
1.4. Tổng quan về các phương pháp phân tích thành phần hóa học của loài R. officinalis 11 1.4.1. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu..............11 1.4.2. Các nghiên cứu về xác định thành phần hóa học trong loài R. officinalis
.....................................................................................12 1.4.3. Các phương pháp chiết tách chất phân tích ra khỏi mẫu dược liệu ........14
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM .............................................................................16
2.1. Đối tượng nghiên cứu 16 2.2. Hoá chất, công cụ và thiết bị 16 2.2.1. Chất chuẩn...............................................................................................16 2.2.2. Các hoá chất khác....................................................................................17 2.2.3. Dụng cụ, thiết bị......................................................................................18 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Phương pháp phân tách các dịch chiết và phân lập các hợp chất ...........18 2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc các chất .................................................21 2.3.3. Tối ưu hóa điều kiện hệ thống sắc ký .....................................................21 2.3.4. Phương pháp xử lý mẫu ..........................................................................22 2.4. Đánh giá phương pháp phân tích 25 2.4.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký.........................................................25
i
2.4.2. Tính chọn lọc, tính đặc hiệu....................................................................25 2.4.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ........................................................26 2.4.4. Độ lặp lại của phương pháp ....................................................................26 2.4.5. Độ đúng (đánh giá qua độ thu hồi)..........................................................27
2.5. Phân tích mẫu thực tế 28
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................29
3.1. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được 29 3.2. Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện đo của hệ thống sắc ký 33 3.2.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện tách trên hệ sắc ký HPLC..........................33 3.2.2. Xây dựng các phương trình đường chuẩn...............................................37 3.3. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu dược liệu R. officinalis 42 3.3.1. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết..................................................................42 3.3.2. Khảo sát phương pháp chiết....................................................................43 3.4. Đánh giá phương pháp phân tích 46 3.4.1. Đánh giá tính phù hợp của hệ thống sắc ký ............................................46 3.4.2. Độ đặc hiệu..............................................................................................47 3.4.3. Độ lặp lại của phương pháp ....................................................................48 3.4.4. Độ đúng của phương pháp ......................................................................49 3.5. Định lượng bốn hoạt chất chính trên mẫu thực 51
KẾT LUẬN ..............................................................................................................54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................55
PHỤ LỤC
ii
13C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy
1H-NMR Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy
ACN Acetonitrile
CDL Limit of detection of calibration CDQ Limit of quantitation of
calibration
DAD Diod Array Detector
EtOH Ethanol
EtOAc Ethyl acetate
HPLC High Performance Liquid
Chromatography MeOH Methanol
R2 Correlation coefficient
RO1 7α-methoxyrosmanol
RO2 Carnosol
RO3 Demethylsalvicanol
RO4 Rosmarinoside A
RO5 Sageone
RO6 20-deoxocarnosol
RO7 11,12,20-trihydroxy-abieta- 8,11,13-triene
RO8 Rosmanol
RO9 7 -methoxyrosmanol
RO10 7α-ethoxyrosmanol
RSD Relative standard deviation SD Standard deviation
SKĐ
v/v Volume/volume
Phổ cộng hưởng t 13
Phổ cộng hưởng t
hạt nhân carbon hạt nhân proton
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu
Tiếng Anh
Diễn giải
iii
Acetonitrile
Giới hạn phát hiện của đường chuẩn
Giới hạn định lượng của đường chuẩn
Detector mảng diod Ethanol
Ethyl acetate
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Methanol
Hệ số tương quan
7α-methoxyrosmanol
Carnosol
Demethylsalvicanol
Rosmarinoside A
Sageone
20-deoxocarnosol
11,12,20-trihydroxy-abieta-8,11,13- triene
Rosmanol
7 -methoxyrosmanol 7α-ethoxyrosmanol
Độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn
Sắc ký đồ
Thể tích/thể tích
DANH MỤC BẢNG
Trang Bảng 2. 1. Các mẫu R. officinalis dùng trong nghiên cứu .............................................................. 16 Bảng 3. 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất RO1 và hợp chất tham khảo..................................... 30 Bảng 3. 2. Các hợp chất RO1-RO5 phân lập t loài R. officinalis ................................................ 31 Bảng 3. 3. Các hợp chất RO6-RO10 phân lập t loài R. officinalis..............................................32 Bảng 3. 4. Hệ gradient với pha động MeOH/H2O và ACN/ H2O. ............................................... 35 Bảng 3. 5. Thông số đánh giá pic các chất định phân trong các điều kiện rửa giải.....................35 Bảng 3. 6. Ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột đến thông số pic các chất ........................ 36 Bảng 3. 7. Hệ gradient chạy HPLC ................................................................................................... 37 Bảng 3. 8. Khoảng tuyến tính RO1, RO3, RO9, RO10 ................................................................. 38 Bảng 3. 9. Giá trị hệ số b’ .................................................................................................................... 40 Bảng 3. 10. Các đại lượng thống kê...................................................................................................40 Bảng 3. 11. Phương trình đường chuẩn của các chất......................................................................41 Bảng 3. 12. CDL và CDQ của RO1, RO3, RO9 và RO10 bằng HPLC-DAD..........................41 Bảng 3. 13. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống.............................................................. 46 Bảng 3. 14. Thời gian lưu mẫu đối chiếu và mẫu thử ..................................................................... 48 Bảng 3. 15. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu RO1.................................. 49 Bảng 3. 16. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu thực................................... 49 Bảng 3. 17. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp ............................................................... 50 Bảng 3. 18. Kết quả định lượng bốn hoạt chất trong một số mẫu lá và thân R. officinalis ........ 52
iv
DANH MỤC HÌNH
Trang Hình 1. 1. Cây Bạc hà (Mentha arvensis) ........................................................................................... 2 Hình 1. 2. Cây Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis) ........................................................................ 2 Hình 1. 3. Loài Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) .................................................................. 3 Hình 1. 4. Cấu trúc của một số terpene phân lập t loài R. officinalis............................................. 6 Hình 1. 5. Cấu trúc của một số flavonoid phân lập t loài R. officinalis......................................... 8 Hình 1. 6. Cấu trúc của một số phenolic phân lập t loài R. officinalis .......................................... 8
Hình 3. 2. Khảo sát bước sóng phát hiện tối ưu của các chất.........................................................33
Hình 3. 3. Sắc ký đồ ứng với điều kiện sắc ký lựa chọn được ....................................................... 37
Hình 3. 4. Đường chuẩn các chất RO1, RO3...................................................................................38
Hình 3. 5. Đường chuẩn các chất RO9, RO10................................................................................. 39
Hình 3. 6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng RO1, RO3, RO9 và RO10 ...................................................................................................................................................... 42
Hình 3. 7. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ chiết siêu âm đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10.................................................................................................................................43
Hình 3. 8. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết siêu âm đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10.................................................................................................................................44
Hình 3. 9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dung môi chiết/khối lượng dược liệu đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10.....................................................................................45
Hình 3. 10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết hồi lưu đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10.................................................................................................................................46
Hình 3. 11. SKĐ của chất đối chiếu RO1, RO3, RO9, RO10.......................................................47 Hình 3. 12. SKĐ của mẫu thử ............................................................................................................ 48
Hình 2. 1. Sơ đồ phân lập các hợp chất t loài R. officinalis................................... 20 Hình 3. 1. Công thức cấu tạo chất RO1 .................................................. 29
v
MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới ẩm gió mùa nên có nguồn dược liệu rất phong phú và đa dạng. Nhân dân ta t lâu đã biết dùng cây cỏ để chữa bệnh và phòng bệnh, nhưng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian tùy theo t ng địa phương. Phần lớn các cây thuốc Việt Nam chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, nhất là về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và hàm lượng các hoạt chất do đó chưa có được các cơ sở khoa học để tạo được các sản phẩm ứng dụng mới trong các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm và nông nghiệp. Trong số đó có cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) là một loại cây có nhiều ứng dụng trong cuộc sống. Nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng nó có các khả năng như chống oxi hóa, kháng viêm và chống ung thư, ức chế mạnh sự tăng trưởng tế bào trong tất cả các dòng tế bào ung thư thử nghiệm, có tác dụng hạ đường huyết, kích thích hệ thần kinh.... Với mong muốn tìm hiểu về chất lượng cây Hương thảo, chúng tui lựa chọn đề tài: ―Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây Hƣơng thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phƣơng pháp HPLC‖.
Mục tiêu nghiên cứu:
- Phân lập được một số hoạt chất chính trong cây Hương thảo dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lượng các hoạt chất đó.
- Xây dựng được quy trình định lượng các hoạt chất chính trong cây Hương thảo bằng phương pháp HPLC.
- Ứng dụng xác định, đánh giá hàm lượng các hoạt chất chính trong một số mẫu Hương thảo ở các vùng khác nhau.
1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về họ Hoa môi (Lamiaceae)
Họ Hoa môi (Lamiaceae) còn được gọi bằng nhiều tên khác như họ Húng, họ Bạc hà...là một họ thực vật có hoa [32]. Chúng phân bố rộng khắp trên toàn cầu nhưng tập trung chủ yếu ở Địa Trung Hải. Một số loài là cây bụi hay cây gỗ, hiếm gặp hơn là các dạng dây leo. Chúng có lá đối xứng và xếp chồng chéo hình chữ thập hay mọc vòng, thân cây thường hình vuông, có nhiều lông tuyến, nơi giải phóng những hợp chất thơm mà ta ngửi thấy.
Các loài thực vật trong họ này nói chung có hương thơm trong mọi phần của cây và nhiều loại cây thân thảo được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực và dùng làm thuốc như: Húng quế, Bạc hà (hình 1.1), Hoàng cầm (hình 1.2) Hương thảo (hình 1.3), Xô thơm, Tía tô... Bên cạnh những loài lấy lá để ăn, làm gia vị còn một số loài được trồng làm cảnh như húng chanh. Một số loài khác được trồng vì mục đích lấy hạt (chứ không phải lá) làm thực phẩm như hạt cây chia [32].
Trên thế giới, Lamiaceae có khoảng 245 chi và 7886 loài khác nhau. Ở Việt Nam có trên 40 chi và khoảng 145 loài. Chi Rosmarinus có khoảng 40 loài, chi Thymus có khoảng 350 loài và hầu hết chúng sống ở Châu Á. Có khoảng 150 loài điển hình của chi Ocimum được biết đến sinh sống ở Ấn Độ, còn ở Châu Âu có 15- 20 loài, Có hơn 100 loài thuộc chi Phlonis, 40-50 loài thuộc chi Lamuim,...[30, 31].
Hình 1. 1. Cây Bạc hà Hình 1. 2. Cây Hoàng cầm (Mentha arvensis) (Scutellaria baicalensis)
1.2. Chi Rosmarinus
Rosmarinus là một chi trong họ hoa môi Lamiaceae, nhóm thực vật có hoa.
Là loại cây bụi sống lâu năm có bộ lá thơm và hoa màu xanh tím. 2
Chi Rosmarinus được tìm thấy ở vùng Địa Trung Hải, một phần ở phía nam bờ biển Châu Âu, Bắc Mĩ và phía đông Ai Cập, cũng như Cilicia. Chúng được biết đến với mục đích dùng làm thuốc, nấu nướng, mỹ phẩm và trang trí. Chúng được sử dụng t rất sớm bởi người La Mã, Hy Lạp và Ai Cập. Rosmarinus được xem là một trong những loài thực vật có ích nhất vùng Địa Trung Hải.
Có khoảng 40 loài trong chi Rosmarinus, tuy nhiên chỉ có 6 loài được chấp nhận tên: R. officinalis L., R. eriocalyx Jord. & Fourr., R. eriocalyx var. pallescens (Maire) Upson & Jury, R. x lavandulaceus Noë, R. x mendizaballii Sagredo ex Rosua, R. tomentosus Hub. -Mor. & Maire. Mỗi loài có đặc điểm khác nhau nhưng quan trọng nhất, nhiều lợi ích nhất là R. officinalis L. [16, 31].
1.3. Loài Hƣơng thảo (R. officinalis L.) 1.3.1. Đặc điểm thực vật
a) Cây Hương thảo b) Lá Hương thảo khô c) Thân Hương thảo khô Hình 1. 3. Loài Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.)
Họ: Lamiaceae
Chi: Rosmarinus
Tên khoa học: Rosmarinus officinalis L.
Tên thƣờng gọi: Cây Hương thảo, cây Dương chổi
Mô tả về thực vật: Cây nhỏ cao 1- 2 m, phân nhánh và mọc thành bụi. Lá R. officinalis nhiều, hẹp, hình dải, dai, có mép gập xuống, không cuống, màu xanh sẫm và nhẵn ở trên, phủ lông rải rác màu trắng ở mặt dưới. Hoa xếp 2 - 10 ở các vòng lá, dài cỡ 1 cm, màu lam nhạt hơi có màu hoa cà với những chấm tím ở phía trong các
3
thùy. Toàn cây có mùi rất thơm. Mùa nở hoa vào khoảng t tháng 3 đến tháng 5 [10].
1.3.2. Nguồn gốc phân bố
R. officinalis là loài cỏ thơm ở vùng Địa Trung Hải, được trồng nhiều ở Nam Âu, Tây Á và Bắc Phi trước đây. Nó mọc hoang dại dọc theo phía bắc và phía nam bờ biển Địa Trung Hải và cũng trong khu vực tiểu vùng Himalaya. Nó được trồng t những ngày xa xưa ở nước Anh, Đức, Pháp, Trung Mỹ, Venezuela .
Tại Việt Nam, cây được nhập trồng ở một số tỉnh miền núi trung du phía Bắc, miền Trung và miền Nam.Thường trồng bằng cách giâm cành hay gieo hạt. Cây thích hợp với khí hậu khô ráo, nhiều nắng nhưng không quá nóng. Đất trồng phải thoát nước tốt.
1.3.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học
Qua nghiên cứu, các nhà khoa học thấy rằng trong loài R. officinalis chứa chủ yếu các thành phần là terpene, flavonoid, tinh dầu và các phenolic acid. Ngoài ra cây còn chứa các acid hữu cơ (citric, glyconic,...)
Các hợp chất terpene là nhóm hợp chất tự nhiên mà phân tử của nó được cấu tạo bởi một hay nhiều đơn vị isoprene (C5H8) và có chung 1 gốc sinh tổng hợp. Có thể chia thành terpenoid mạch vòng và terpenoid mạch th ng. Ngoài ra dựa vào số đơn vị isoprene, người ta chia thành monoterpene (C10), sesquiterpene (C15), diterpene (C20), triterpene (C30), tetraterpene (C40).
Cấu trúc của một số loại terpene như diterpene, triterpene, phenolic diterpene,... trong loài R. officinalis đã được xác định như: 7-methoxyrosmanol (1), betulin (2) [9]; oleanolic acid (3), ursolic acid (4) [27]; carnosic acid (5), carnosol (6), 12-O-methylcarnosic acid (7) [21]; 12-methoxy-trans-carnosic acid (8), 12- methoxy-cis-carnosic acid (9) [45]; seco-hinokiol (10) [17]; 7β-methoxy-abieta- 8,13-diene-11,12-dione-(20,6β)-olide (11), 7α-methoxyabieta-8,13-diene-11, 12- dione-(20,6β)-olide (12), royleanolic acid (13), rosmanol (14), betulinic acid (15), 23-hydroxybetulinic acid (16), rofficerone (17) [39]; epirosmanol (18), methyl carnosate (19) [59]; rosmariquinone (20) [29]; rosmadial (21) [43]; isorosmanol (22), 11,12-di-O-methoxy isorosmanol (23) [42]. Cấu trúc của các chất này xem trong hình 1.4.
4
5
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phương pháp HPLC
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỤC LỤC...................................................................................................................i
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN.....................................................................................2
1.1. Giới thiệu về họ Hoa môi (Lamiaceae) 2 1.2. Chi Rosmarinus 2 1.3. Loài Hương thảo (R. officinalis L.) 3
1.3.1. Đặc điểm thực vật .....................................................................................3 1.3.2. Nguồn gốc phân bố ...................................................................................4 1.3.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học ...........................................4 1.3.4. Công dụng và hoạt tính sinh học loài R. officinalis ..................................9
1.4. Tổng quan về các phương pháp phân tích thành phần hóa học của loài R. officinalis 11 1.4.1. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của dược liệu..............11 1.4.2. Các nghiên cứu về xác định thành phần hóa học trong loài R. officinalis
.....................................................................................12 1.4.3. Các phương pháp chiết tách chất phân tích ra khỏi mẫu dược liệu ........14
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM .............................................................................16
2.1. Đối tượng nghiên cứu 16 2.2. Hoá chất, công cụ và thiết bị 16 2.2.1. Chất chuẩn...............................................................................................16 2.2.2. Các hoá chất khác....................................................................................17 2.2.3. Dụng cụ, thiết bị......................................................................................18 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Phương pháp phân tách các dịch chiết và phân lập các hợp chất ...........18 2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc các chất .................................................21 2.3.3. Tối ưu hóa điều kiện hệ thống sắc ký .....................................................21 2.3.4. Phương pháp xử lý mẫu ..........................................................................22 2.4. Đánh giá phương pháp phân tích 25 2.4.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký.........................................................25
i
2.4.2. Tính chọn lọc, tính đặc hiệu....................................................................25 2.4.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ........................................................26 2.4.4. Độ lặp lại của phương pháp ....................................................................26 2.4.5. Độ đúng (đánh giá qua độ thu hồi)..........................................................27
2.5. Phân tích mẫu thực tế 28
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................29
3.1. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được 29 3.2. Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện đo của hệ thống sắc ký 33 3.2.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện tách trên hệ sắc ký HPLC..........................33 3.2.2. Xây dựng các phương trình đường chuẩn...............................................37 3.3. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu dược liệu R. officinalis 42 3.3.1. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết..................................................................42 3.3.2. Khảo sát phương pháp chiết....................................................................43 3.4. Đánh giá phương pháp phân tích 46 3.4.1. Đánh giá tính phù hợp của hệ thống sắc ký ............................................46 3.4.2. Độ đặc hiệu..............................................................................................47 3.4.3. Độ lặp lại của phương pháp ....................................................................48 3.4.4. Độ đúng của phương pháp ......................................................................49 3.5. Định lượng bốn hoạt chất chính trên mẫu thực 51
KẾT LUẬN ..............................................................................................................54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................55
PHỤ LỤC
ii
13C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy
1H-NMR Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy
ACN Acetonitrile
CDL Limit of detection of calibration CDQ Limit of quantitation of
calibration
DAD Diod Array Detector
EtOH Ethanol
EtOAc Ethyl acetate
HPLC High Performance Liquid
Chromatography MeOH Methanol
R2 Correlation coefficient
RO1 7α-methoxyrosmanol
RO2 Carnosol
RO3 Demethylsalvicanol
RO4 Rosmarinoside A
RO5 Sageone
RO6 20-deoxocarnosol
RO7 11,12,20-trihydroxy-abieta- 8,11,13-triene
RO8 Rosmanol
RO9 7 -methoxyrosmanol
RO10 7α-ethoxyrosmanol
RSD Relative standard deviation SD Standard deviation
SKĐ
v/v Volume/volume
Phổ cộng hưởng t 13
Phổ cộng hưởng t
hạt nhân carbon hạt nhân proton
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu
Tiếng Anh
Diễn giải
iii
Acetonitrile
Giới hạn phát hiện của đường chuẩn
Giới hạn định lượng của đường chuẩn
Detector mảng diod Ethanol
Ethyl acetate
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Methanol
Hệ số tương quan
7α-methoxyrosmanol
Carnosol
Demethylsalvicanol
Rosmarinoside A
Sageone
20-deoxocarnosol
11,12,20-trihydroxy-abieta-8,11,13- triene
Rosmanol
7 -methoxyrosmanol 7α-ethoxyrosmanol
Độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn
Sắc ký đồ
Thể tích/thể tích
DANH MỤC BẢNG
Trang Bảng 2. 1. Các mẫu R. officinalis dùng trong nghiên cứu .............................................................. 16 Bảng 3. 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất RO1 và hợp chất tham khảo..................................... 30 Bảng 3. 2. Các hợp chất RO1-RO5 phân lập t loài R. officinalis ................................................ 31 Bảng 3. 3. Các hợp chất RO6-RO10 phân lập t loài R. officinalis..............................................32 Bảng 3. 4. Hệ gradient với pha động MeOH/H2O và ACN/ H2O. ............................................... 35 Bảng 3. 5. Thông số đánh giá pic các chất định phân trong các điều kiện rửa giải.....................35 Bảng 3. 6. Ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột đến thông số pic các chất ........................ 36 Bảng 3. 7. Hệ gradient chạy HPLC ................................................................................................... 37 Bảng 3. 8. Khoảng tuyến tính RO1, RO3, RO9, RO10 ................................................................. 38 Bảng 3. 9. Giá trị hệ số b’ .................................................................................................................... 40 Bảng 3. 10. Các đại lượng thống kê...................................................................................................40 Bảng 3. 11. Phương trình đường chuẩn của các chất......................................................................41 Bảng 3. 12. CDL và CDQ của RO1, RO3, RO9 và RO10 bằng HPLC-DAD..........................41 Bảng 3. 13. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống.............................................................. 46 Bảng 3. 14. Thời gian lưu mẫu đối chiếu và mẫu thử ..................................................................... 48 Bảng 3. 15. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu RO1.................................. 49 Bảng 3. 16. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu thực................................... 49 Bảng 3. 17. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp ............................................................... 50 Bảng 3. 18. Kết quả định lượng bốn hoạt chất trong một số mẫu lá và thân R. officinalis ........ 52
iv
DANH MỤC HÌNH
Trang Hình 1. 1. Cây Bạc hà (Mentha arvensis) ........................................................................................... 2 Hình 1. 2. Cây Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis) ........................................................................ 2 Hình 1. 3. Loài Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) .................................................................. 3 Hình 1. 4. Cấu trúc của một số terpene phân lập t loài R. officinalis............................................. 6 Hình 1. 5. Cấu trúc của một số flavonoid phân lập t loài R. officinalis......................................... 8 Hình 1. 6. Cấu trúc của một số phenolic phân lập t loài R. officinalis .......................................... 8
Hình 3. 2. Khảo sát bước sóng phát hiện tối ưu của các chất.........................................................33
Hình 3. 3. Sắc ký đồ ứng với điều kiện sắc ký lựa chọn được ....................................................... 37
Hình 3. 4. Đường chuẩn các chất RO1, RO3...................................................................................38
Hình 3. 5. Đường chuẩn các chất RO9, RO10................................................................................. 39
Hình 3. 6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng RO1, RO3, RO9 và RO10 ...................................................................................................................................................... 42
Hình 3. 7. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ chiết siêu âm đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10.................................................................................................................................43
Hình 3. 8. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết siêu âm đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10.................................................................................................................................44
Hình 3. 9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dung môi chiết/khối lượng dược liệu đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10.....................................................................................45
Hình 3. 10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian chiết hồi lưu đến hiệu suất chiết RO1, RO3, RO9, RO10.................................................................................................................................46
Hình 3. 11. SKĐ của chất đối chiếu RO1, RO3, RO9, RO10.......................................................47 Hình 3. 12. SKĐ của mẫu thử ............................................................................................................ 48
Hình 2. 1. Sơ đồ phân lập các hợp chất t loài R. officinalis................................... 20 Hình 3. 1. Công thức cấu tạo chất RO1 .................................................. 29
v
MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới ẩm gió mùa nên có nguồn dược liệu rất phong phú và đa dạng. Nhân dân ta t lâu đã biết dùng cây cỏ để chữa bệnh và phòng bệnh, nhưng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian tùy theo t ng địa phương. Phần lớn các cây thuốc Việt Nam chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, nhất là về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và hàm lượng các hoạt chất do đó chưa có được các cơ sở khoa học để tạo được các sản phẩm ứng dụng mới trong các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm và nông nghiệp. Trong số đó có cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) là một loại cây có nhiều ứng dụng trong cuộc sống. Nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng nó có các khả năng như chống oxi hóa, kháng viêm và chống ung thư, ức chế mạnh sự tăng trưởng tế bào trong tất cả các dòng tế bào ung thư thử nghiệm, có tác dụng hạ đường huyết, kích thích hệ thần kinh.... Với mong muốn tìm hiểu về chất lượng cây Hương thảo, chúng tui lựa chọn đề tài: ―Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây Hƣơng thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phƣơng pháp HPLC‖.
Mục tiêu nghiên cứu:
- Phân lập được một số hoạt chất chính trong cây Hương thảo dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lượng các hoạt chất đó.
- Xây dựng được quy trình định lượng các hoạt chất chính trong cây Hương thảo bằng phương pháp HPLC.
- Ứng dụng xác định, đánh giá hàm lượng các hoạt chất chính trong một số mẫu Hương thảo ở các vùng khác nhau.
1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về họ Hoa môi (Lamiaceae)
Họ Hoa môi (Lamiaceae) còn được gọi bằng nhiều tên khác như họ Húng, họ Bạc hà...là một họ thực vật có hoa [32]. Chúng phân bố rộng khắp trên toàn cầu nhưng tập trung chủ yếu ở Địa Trung Hải. Một số loài là cây bụi hay cây gỗ, hiếm gặp hơn là các dạng dây leo. Chúng có lá đối xứng và xếp chồng chéo hình chữ thập hay mọc vòng, thân cây thường hình vuông, có nhiều lông tuyến, nơi giải phóng những hợp chất thơm mà ta ngửi thấy.
Các loài thực vật trong họ này nói chung có hương thơm trong mọi phần của cây và nhiều loại cây thân thảo được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực và dùng làm thuốc như: Húng quế, Bạc hà (hình 1.1), Hoàng cầm (hình 1.2) Hương thảo (hình 1.3), Xô thơm, Tía tô... Bên cạnh những loài lấy lá để ăn, làm gia vị còn một số loài được trồng làm cảnh như húng chanh. Một số loài khác được trồng vì mục đích lấy hạt (chứ không phải lá) làm thực phẩm như hạt cây chia [32].
Trên thế giới, Lamiaceae có khoảng 245 chi và 7886 loài khác nhau. Ở Việt Nam có trên 40 chi và khoảng 145 loài. Chi Rosmarinus có khoảng 40 loài, chi Thymus có khoảng 350 loài và hầu hết chúng sống ở Châu Á. Có khoảng 150 loài điển hình của chi Ocimum được biết đến sinh sống ở Ấn Độ, còn ở Châu Âu có 15- 20 loài, Có hơn 100 loài thuộc chi Phlonis, 40-50 loài thuộc chi Lamuim,...[30, 31].
Hình 1. 1. Cây Bạc hà Hình 1. 2. Cây Hoàng cầm (Mentha arvensis) (Scutellaria baicalensis)
1.2. Chi Rosmarinus
Rosmarinus là một chi trong họ hoa môi Lamiaceae, nhóm thực vật có hoa.
Là loại cây bụi sống lâu năm có bộ lá thơm và hoa màu xanh tím. 2
Chi Rosmarinus được tìm thấy ở vùng Địa Trung Hải, một phần ở phía nam bờ biển Châu Âu, Bắc Mĩ và phía đông Ai Cập, cũng như Cilicia. Chúng được biết đến với mục đích dùng làm thuốc, nấu nướng, mỹ phẩm và trang trí. Chúng được sử dụng t rất sớm bởi người La Mã, Hy Lạp và Ai Cập. Rosmarinus được xem là một trong những loài thực vật có ích nhất vùng Địa Trung Hải.
Có khoảng 40 loài trong chi Rosmarinus, tuy nhiên chỉ có 6 loài được chấp nhận tên: R. officinalis L., R. eriocalyx Jord. & Fourr., R. eriocalyx var. pallescens (Maire) Upson & Jury, R. x lavandulaceus Noë, R. x mendizaballii Sagredo ex Rosua, R. tomentosus Hub. -Mor. & Maire. Mỗi loài có đặc điểm khác nhau nhưng quan trọng nhất, nhiều lợi ích nhất là R. officinalis L. [16, 31].
1.3. Loài Hƣơng thảo (R. officinalis L.) 1.3.1. Đặc điểm thực vật
a) Cây Hương thảo b) Lá Hương thảo khô c) Thân Hương thảo khô Hình 1. 3. Loài Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.)
Họ: Lamiaceae
Chi: Rosmarinus
Tên khoa học: Rosmarinus officinalis L.
Tên thƣờng gọi: Cây Hương thảo, cây Dương chổi
Mô tả về thực vật: Cây nhỏ cao 1- 2 m, phân nhánh và mọc thành bụi. Lá R. officinalis nhiều, hẹp, hình dải, dai, có mép gập xuống, không cuống, màu xanh sẫm và nhẵn ở trên, phủ lông rải rác màu trắng ở mặt dưới. Hoa xếp 2 - 10 ở các vòng lá, dài cỡ 1 cm, màu lam nhạt hơi có màu hoa cà với những chấm tím ở phía trong các
3
thùy. Toàn cây có mùi rất thơm. Mùa nở hoa vào khoảng t tháng 3 đến tháng 5 [10].
1.3.2. Nguồn gốc phân bố
R. officinalis là loài cỏ thơm ở vùng Địa Trung Hải, được trồng nhiều ở Nam Âu, Tây Á và Bắc Phi trước đây. Nó mọc hoang dại dọc theo phía bắc và phía nam bờ biển Địa Trung Hải và cũng trong khu vực tiểu vùng Himalaya. Nó được trồng t những ngày xa xưa ở nước Anh, Đức, Pháp, Trung Mỹ, Venezuela .
Tại Việt Nam, cây được nhập trồng ở một số tỉnh miền núi trung du phía Bắc, miền Trung và miền Nam.Thường trồng bằng cách giâm cành hay gieo hạt. Cây thích hợp với khí hậu khô ráo, nhiều nắng nhưng không quá nóng. Đất trồng phải thoát nước tốt.
1.3.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học
Qua nghiên cứu, các nhà khoa học thấy rằng trong loài R. officinalis chứa chủ yếu các thành phần là terpene, flavonoid, tinh dầu và các phenolic acid. Ngoài ra cây còn chứa các acid hữu cơ (citric, glyconic,...)
Các hợp chất terpene là nhóm hợp chất tự nhiên mà phân tử của nó được cấu tạo bởi một hay nhiều đơn vị isoprene (C5H8) và có chung 1 gốc sinh tổng hợp. Có thể chia thành terpenoid mạch vòng và terpenoid mạch th ng. Ngoài ra dựa vào số đơn vị isoprene, người ta chia thành monoterpene (C10), sesquiterpene (C15), diterpene (C20), triterpene (C30), tetraterpene (C40).
Cấu trúc của một số loại terpene như diterpene, triterpene, phenolic diterpene,... trong loài R. officinalis đã được xác định như: 7-methoxyrosmanol (1), betulin (2) [9]; oleanolic acid (3), ursolic acid (4) [27]; carnosic acid (5), carnosol (6), 12-O-methylcarnosic acid (7) [21]; 12-methoxy-trans-carnosic acid (8), 12- methoxy-cis-carnosic acid (9) [45]; seco-hinokiol (10) [17]; 7β-methoxy-abieta- 8,13-diene-11,12-dione-(20,6β)-olide (11), 7α-methoxyabieta-8,13-diene-11, 12- dione-(20,6β)-olide (12), royleanolic acid (13), rosmanol (14), betulinic acid (15), 23-hydroxybetulinic acid (16), rofficerone (17) [39]; epirosmanol (18), methyl carnosate (19) [59]; rosmariquinone (20) [29]; rosmadial (21) [43]; isorosmanol (22), 11,12-di-O-methoxy isorosmanol (23) [42]. Cấu trúc của các chất này xem trong hình 1.4.
4
5
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links