LINK TẢI LUẬN VĂN MIỄN PHÍ CHO AE KET-NOI
Môc lôc
Mục
Phần A: Tóm tắt kết quả nổi bật của đề tài (chủ nhiệm ĐT tự đánh giá) 8
1. Kết quả nổi bật của đề tài 8 1.1. Đóng góp mới của đề tài 8 1.2. Kết quả cụ thể (các sản phẩm cụ thể) 8 1.3. Hiệu quả về kinh tế 9 1.4. Hiệu quả về xã hội 9 1.5. Hiệu quả khác 10
2. Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội 10
3. Đánh giá thực hiện ĐT (đối chiếu với ĐCNC được phê duyệt ) 10 (a) Tiến độ 10 (b) Thực hiện mục tiêu nghiên cứu 10 (c) Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cương 11 (d) Đánh giá việc sử dụng kinh phí 11
4. Các ý kiến đề xuất 11 Phần B: Nội dung báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ 12
1. Đặt vấn đề 12 1.1. Tình hình chung - Tính cấp thiết 12 1.2. Giả thiết nghiên cứu của đề tài 13 1.3. Mục tiêu nghiên cứu 13
2. Tổng quan đề tài 14 2.1. Một số kết quả nghiên cứu DHC ở nước ngoài 14 2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 18
3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 24 3.1. Thiết kế nghiên cứu 24 3.2. Mẫu và đối tượng nghiên cứu 24 3.3. Phương pháp nghiên cứu 24
3.3.1. Chỉ tiêu nghiên cứu 24 3.3.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu 25 3.3.3. Một số thiết bị hóa chất vật tư chính 30
Trang
5
3.3.4. Xây dựng Quy trình sản xuất cao đặc qui mô pilot 31
4. Kết quả nghiên cứu 32 4.1. Nguồn dược liệu DHC 32 4.1.1. Chi DHC (Phyllanthus) 32 4.1.2. Phyllanthus amarus Schum. et Thonn. 32 4.1.3. Phyllanthus urinaria Linn 33 4.1.4. Nguồn dược liệu DHC ở nước ta 34 4.2. Thu hái sơ chế và bảo quản dược liệu 38 4.2.1. Mùa thu hái 38 4.2.2. Nguồn dược liệu 38 4.2.3. Quy trình thu hái, sơ chế 38 4.2.4. Quy trình bảo quản dược liệu 39 4.3. Nhu cầu dược liệu DHC 42 4.4. Nghiên cứu cây DHC đắng 45 4.4.1. Định tính hóa học DHC đắng 45 4.4.2. Hàm lượng tro DHC đắng 50 4.4.3. Nghiên cứu chiết DHC đắng bằng nước quy mô PTN 50 4.4.4. Chiết DHC đắng bằng cồn/nước 30/70 trong PTN 53 4.4.5. Chiết DHC đắng bằng cồn/nước 50/50 trong PTN 56 4.4.6. Chiết DHC đắng bằng cồn 94o trong PTN [12,25] 58 4.4.7. Hàm lượng hoạt chất trong DHC đắng 59 4.5. Nghiên cứu DHC (P.u) 60 4.5.1. Định tính thành phần hóa học DHC (P.u) 60 4.5.2. Định lượng một số hoạt chất DHC (P.u) 61 4.6. Bàn luận kết quả nghiên cứu phòng thí nghiệm 61 4.6.1. So sánh định tính thành phần hóa học 61 4.6.2. So sánh định lượng thành phần hóa học hai loài P.a và P.u 62 4.6.3. So sánh hiệu quả chiết của dung môi 63 4.6.4. Bàn luận về quy trình chiết phòng thí nghiệm 64 4.6.5. Lựa chọn dung môi và quy trình chiết pilot 65 4.7. Điều chế cao đặc hai loài P.a và P.u qui mô pilot 66 4.7.1. Kết quả chiết pilot tạo cao đặc 66 4.7.2. Kết quả phân tích kiểm tra cao đặc chiết pilot 67 4.7.3. Bảo quản cùng kiệt oxi hai loài cao đặc p.a và p.u 72 4.8. Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot 74 4.8.1. Nguyên phụ liệu dung môi hoá chất 74
4.8.2. Thiết bị, máy móc 4.8.3. An toàn lao động
75 76
6
4.8.4. Sơ đồ Quy trình sản xuất 77 4.8.5. Mô tả Quy trình sản xuất qui mô pilot cao đặc DHC 78 4.8.6. Kiểm tra chất lượng 80 4.8.7. Bã chiết – bảo vệ môi truờng 80 4.8.8. Các hồ sơ và sổ ghi chép cần thiết cho sản xuất cao 81 4.8.9. Quản lý chất lượng 82
4.9. Sản xuất 200 kg cao đặc DHC đắng 83
4.9.1. Nguyên liệu 83 4.9.2. Tiến hành 83 4.9.3. Hiệu suất chiết – tạo cao đặc 83
4.10. Đánh giá chất lượng cao đặc sản xuất được 84
4.10.1. Tính chất và thành phần hóa học 84 4.10.2. Hàm lượng kim loại nặng và thuốc BVTV 85 4.10.3. Vi khuẩn, men mốc 87 4.10.4. Độc tính cấp LD50 87 4.10.5. Tác dụng bảo vệ gan 89 4.10.6. Phiếu kiểm nghiệm 92
4.11. Tiêu chuẩn cơ sở về chất lượng cao đặc DHC 92
4.11.1. Tiêu chuẩn nguyên liệu DHC đắng P.a 93
4.11.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cao đặc DHC 96
4.12. Xây dựng mẫu mã thương hiệu cao đặc DHC 100
4.12.1. Yêu cầu chung 100 4.12.2. Nội dung xây dựng mẫu mã thương hiệu 100 4.12.3. Kết quả xây dựng mẫu mã thương hiệu 101
5. Bàn luận
6. Kết luận và kiến nghị 7. Tài liệu tham khảo
103 105 108
7
Phần A
Tóm tắt kết quả nổi bật của đề tài
1. Kết quả nổi bật của đề tài 1.1. Đóng góp mới của đề tài
• Đã xác định được không chỉ có 1 loài Phyllanthus amarus Schum. et Thonn (P.a) duy nhất. Nước ta có ít nhất 2 phân loài (giống) P.a
• Đã đề xuất phương pháp hong khô dược liệu thay thế cho phơi nắng
• Đã định lượng được nhóm chất có hoạt tính trong cao đặc là Alcaloid và Lignan
• Đã xây dựng được Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot
• Đã áp dụng phương pháp bảo quản chống oxy hóa, kín khí cùng kiệt oxy, cho
bảo quản dược liệu và cao đặc DHC đắng
1.2. Kết quả cụ thể (các sản phẩm cụ thể) * Về xác định tiêu chuẩn hóa dược liệu
Thu thập đ ược dược liệu DHC tại các địa điểm Thái Nguyên, Bắc Giang, Cát Bà, Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Yên Bài..., phân biệt được loài P.a và loài P.u.
* Về thành phần hóa học
Đã định lượng ba nhóm chất chính là Alcaloid, Flavonoid và Lignan trong cây và trong cao đặc hai loài DHC.
* Về Quy trình sản xuất
Đã xây dựng Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot, hàm luợng Alcaloid, Flavonoid và Lignan trong cao thành phẩm đạt TCCS.
* Về bao gói bảo quản
Đã bảo quản thử nghiệm trong điều kiện cùng kiệt oxy cho dược liệu và cao đặc thành phẩm, đạt chất lượng và kéo dài được thời gian lưu kho.
8
* Về xây dựng thương hiệu
Đã xây dựng tiêu chuẩn dược liệu DHC đắng, tiêu chuẩn chất lượng cao đặc thành phẩm.
Đã sản xuất hơn 200kg cao đặc DHC, và ổn định Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot, bước đầu cung ứng sản phẩm cao đặc cho thị trường.
* Về đào tạo
Góp phần đào tạo 01 cao học với luận văn ‘Nghiên cứu hóa học thực vật cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) mọc hoang tại Thái Nguyên’, kết quả tốt.
* Về công trình công bố
- 01 bài báo trên tạp chí Hóa học : Nguyễn Văn Phong, Nguyễn Mạnh Hùng, Nguyễn Văn Thông, Đinh Văn Thịnh, Đỗ Thị Lan Hương, Lê Xuân Quế, Nghiên cứu chế tạo cao diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum. et Thonn. qui mô pilot, TC Hóa học, T.46, 5A, 2008, tr.454-457
- 01 tham gia Hội thảo ‘Nghiên cứu và phát triển các sản phẩm tự nhiên’ 14/11/2008, ĐHBK Hà Nội.
1.3. Hiệu quả về kinh tế
Đã sản xuất 2000kg cao đặc thành phẩm và tính theo giá thị trường có thể thu hồi vốn đầu tư sản xuất pilot sau 1 - 2 năm.
1.4. Hiệu quả về xã hội
• Giải quyết việc làm cho nông dân thu hái cây DHC đắng mọc tự nhiên và gieo trồng loại cây này.
9
• Cung cấp nguyên liệu cao ổn định chất lượng cho sản xuất thuốc điều trị bệnh gan, hạn chế thấp nhất sự phụ thuộc mùa vụ.
• Góp phần cung cấp thuốc điều trị bệnh gan hiệu quả cao, giá phù hợp, đáp ứng yêu cầu của đông đảo nhân dân.
1.5. Hiệu quả khác
• Góp phần phát triển ngành công nghệ hóa dược
• Từng bước đưa công nghệ sản xuất có tính công nghiệp trong việc khai
thác nguồn thảo mộc cho đông dược.
2. Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội
• Đã phối hợp với công ty dược phẩm Đà Nẵng bào chế thuốc điều trị bệnh gan từ cao đặc DHC đắng sản xuất tại CTCP Hóa Dược Việt Nam.
• Một phần nhỏ sản phẩm cao đặc DHC đắng đã được sử dụng trực tiếp không cần bào chế, thay thế cho việc ‘sắc’ thuốc truyền thống hay ‘hãm’ chè từ DHC khô.
3. Đánh giá thực hiện đề tài so với đề cương đã được phê duyệt (a) Tiến độ: Đúng theo tiến độ
(b) Thực hiện mục tiêu nghiên cứu
Thực hiện đầy đủ các mục tiêu nghiên cứu đề ra
(c) Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cương
• Tạorađầyđủcácsảnphẩmđãdựkiếntrongđềcương
• Chấtlượngsảnphẩmđạtyêucầunhưđãghitrongđềcương
• Khốilượngcaođặcsảnxuấtđượcvượtnhiềulầnsovớidựkiến.
10
(d) Đánh giá việc sử dụng kinh phí
Kinh phí đã được thực hiện theo định mức, nội dung và đối tượng chi như đã được phê duyệt trong đề cương, đã thanh quyết toán xong.
4. Các ý kiến đề xuất
4.1. Trân trọng đề nghị Bộ xét duyệt dự án sản xuất cao Diệp hạ châu làm thuốc điều trị bệnh gan
Nước ta có khoảng 3 - 4 triệu người bị viêm gan B mãn tính. Trong khi thuốc tây y điều trị bệnh gan chưa nhiều, giá rất cao, thuốc bào chế từ DHC đắng có tác dụng tốt, lại không có tác dụng phụ, giá thành chỉ bằng 1/20 – 1/30 giá thuốc tây. Nhu cầu về thuốc trị bệnh gan bào chế từ DHC sẽ tăng nhanh khoảng 20% năm, số lượng sẽ rất lớn. Đến 2015, nhu cầu cao DHC lên đến 200 - 250 tấn/năm.
4.2. Đề nghị Bộ Y tế xem xét cho phép xây dựng một dự án ‘‘Công nghệ hóa thảo dược Việt Nam phòng chống và điều trị bệnh gan’’, cơ quan chủ trì xây dựng Dự án sẽ là Công Ty Cổ Phần Hóa Dược Việt Nam, ngoài ra còn có các cơ quan phối hợp các bộ các ngành.
Theo Tổ chức Y tế Thế giới, trên thế giới hiện có đến trên 350 triệu người (khoảng 5% dân số thế giới) viêm gan B mãn tính. Châu Á có số người mắc bệnh mãn tính nhiều nhất, trên 200 triệu. Hàng năm có đến 2 triệu người nhiễm virus viêm gan B bị chết do ung thư gan, viêm xơ gan. Chưa kể đến số bệnh gan do phơi nhiễm đối với hoá chất, thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, các loại ô nhiễm môi trường khác. Vì vậy nhu cầu thực tế về thuốc trị bệnh gan sẽ rất lớn.
11
Phần B
Nội dung báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ
1. Đặt vấn đề
1.1. Tình hình chung – tính cấp thiết
Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, có hệ thực vật rất phong phú, đa dạng, với khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài đã được nhân dân ta dùng làm thuốc [3, 4], là nguồn tài nguyên thiên nhiên quí báu, nguồn gen vô giá không phải quốc gia nào cũng có.
Hệ thực vật phong phú là tiền đề cho sự phát triển ngành hoá học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta, là nguồn nguyên liệu có giá trị cho ngành hóa dược đang trên đà phát triển.
Các phương thuốc y học cổ truyền, các nguồn đông dược có những ưu thế nhất định, đối với nhiều lĩnh vực y tế có tính vượt trội cao, nhất là độc tính thấp, hiếm khi có tác dụng không mong muốn, và dễ sử dụng. Nguồn tài nguyên sinh học này có thể tái tạo tự nhiên hay nhân giống và sinh khối nhân tạo, không gây ô nhiễm môi trường, không làm tổn hại đến môi sinh. Hiện có tới 60%-70% các loại thuốc chữa bệnh đang lưu hành hay đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên [3].
DHC là một cây thuốc quí, được nhiều nước trên thế giới sử dụng, ngày càng đuợc quan tâm nghiên cứu. DHC có tác dụng bảo vệ gan, chống viêm gan, làm phục hồi chức năng gan và ức chế virus viêm gan B phát triển. Nhiều chế phẩm bào chế từ DHC đã được lưu hành ở nước ta, thay thế một phần thuốc nhập đắt tiền, mang lại lợi ích hết sức thiết thực về y tế, xã hội, và đặc biệt về kinh tế cho bệnh nhân bị bệnh gan ở nông thôn.
Tuy nhiên việc sản xuất thuốc còn phụ thuộc thời vụ thu hái, việc chế biến nguyên liệu, bào chế bán thành phẩm còn thủ công, nhỏ lẻ, chất lượng sản phẩm chưa ổn định.
12
Để sản xuất qui mô lớn, có tính công nghiệp, cần có nguồn nguyên liệu ổn định, cả về chất lượng và số lượng, không bị ảnh hưởng bởi thời vụ thu hái. Vì vậy việc chiết hoạt chất tạo cao đặc qui mô đủ lớn, làm nguồn nguyên liệu ổn định đảm bảo chất lượng cao cung ứng cho bào chế thuốc là hết sức cần thiết.
1.2. Giả thiết nghiên cứu của đề tài
Từ nhu cầu cấp thiết trên đây và thực tế sử dụng đông dược nói chung và DHC nói riêng, có thể giả thiết xây dựng được Quy trình sản xuất qui mô pilot cao đặc DHC, tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng, và đảm bảo tính ổn định lâu dài của sản phẩm.
1.3. Mục tiêu của đề tài là
Xuất phát từ nhu cầu thực tế, giả thiết trên đây, đề tài đề ra mục tiêu sau: •Xây dựng quy trình sản xuất cao đặc qui mô pilot.
Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn. ) và Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.).
•Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng hai loại cao này. • Theo dõi độ ổn định của cao.
13
2. Tæng quan ®Ò tμi
2.1. Một số kết quả nghiên cứu DHC ở nước ngoài
2.1.1. Nghiên cứu về DHC
DHC là cây thuốc tự nhiên, nên chỉ quốc gia nào có nguồn tài nguyên này mới có quá trình sử dụng lâu đời. Các nước nghiên cứu về DHC đều có nguồn nguyên liệu DHC tự nhiên, điển hình nhất là Ấn Độ, một số nước Nam Mỹ, Trung Quốc ... Trong số đó, Ấn Độ là nước có nhiều kết quả ứng dụng Diệp hạ châu, và có những nghiên cứu cơ bản có hệ thống. Ngoài ra một số nước phát triển như Mỹ, Nhật, Pháp mới đây đều có những công trình nghiên cứu về Diệp hạ châu theo phương pháp của y học hiện đại.
2.1.1.1. Về thực vật học
DHC từ lâu được sử dụng làm thuốc ở nhiều nước : Trung Quốc, Ấn độ, các nước Nam Mỹ (Peru, Achentina,...). Trên thế giới đã phát hiện trên 700 loài Diệp hạ châu, với tên gọi dân gian rất khác nhau, nhưng trong số được nghiên cứu nhiều nhất vẫn là hai loài Phyllanthus amarus Schum et Thonn. và Phyllanthus urinaria L.
Có thể liệt kê một số tài liệu khoa học nghiên cứu về hai loài DHC này:
1. NghiêncứuvềloàiPhyllanthusurinariaL.[28,34,37,38,50]
2. NghiêncứuvềloàiPhyllanthusamarusSchum.etThonn.[25,29,33,36,41,42,
49, 59, 62].
Ngoài ra còn có một số loài khác được nghiên cứu:
3. NghiêncứuvềloàiPhyllanthusniruri[46,48,50,67]
4. Nghiêncứuvềloàikhác(Phyllanthusacidus[55],(Phyllanthusemblica-)[52]) 5. Nghiên cứu về Phyllanthus, không phân biệt loài nào [63, 69, 70] cho thấy
14
khả năng sử dụng hỗn hợp các loài Diệp hạ châu.
2.1.1.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học
Các nhóm chất chính có giá trị về tác động sinh học [27, 35, 44, 64] - Lignan (có nhiều trong lá, thân), gồm các hợp chất chính sau:
+ Phyllanthin và Hypophyllanthin, có tới > 0,3% khối lượng (w) + Lintetralin, Lintetralin ( 4-hydroxy: Seco:, iso
: > 0,02% w
+ Niranthin, Niranthin (demethylenedioxy, hydroxy): > 0,04% w + Nirphyllin, Nirtetralin > 0,09% w
- Flavonoid (trong lá, thân):
+ Catechin,(+):, Catechin, epi: (-):;Catechin-3-o-gallate,epi: (-):
+ Gallocatechin, (+):;Gallocatechin, epi: (-): ; Gallocatechin-3-o-gallate, epi: (-): + Phyllanthus Flavonoid FG-1 ; Phyllanthus Flavonoid FG-2
- Alcaloid :
+ Nirurine
+ Octa-trans-2-trans-4-dienamide, Alcaloid-mis, Octa-trans-2-trans-4-dienamide + Indolizidine Alcaloid
+ Securinine (nor:, nor: (-), nor: 4-methoxy) (Pyrrolizidine Alcaloid)
+ Ecurinine, nor: Ent (Pyrrolizidine Alcaloid)
- Steroid (đến 0,07%):
+ Cholesterol, 24-iso-propyl: ; Estradiol ; Fraternusterol ;
+ Phyllanthosecosteryl Ester ; Phyllanthosterol ; Phyllanthostigmasterol ; β- Sitosterol Ngoài ra còn có tannin, lipid, coumarin.
Còn có nhiều nghiên cứu mới về hoá học của DHC [35, 44, 45, 64].
15
2.1.1.3. Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học
Nghiên cứu khả năng chữa bệnh của DHC có các nội dung sau:
a/ Tác dụng hồi phục gan, điều trị viêm gan B, các bệnh khác về gan [28, 33,
34, 36-40, 42, 46, 49, 50, 59, 62, 63, 67-70]
b/ Tác dụng chống virus viêm gan B [28, 31, 33, 34, 36, 37, 40, 42, 46, 49, 57-
59, 62, 66, 67]
c/ Điều hòa đường huyết, lợi tiểu, hạ huyết áp [43, 51, 53, 56]
d/ Tác dụng bảo vệ hệ tim mạch [38, 50, 52]
đ/ Tác dụng chống ung thư (anticancer-cytotoxicity), chống HIV, [30, 45, 54]
2.1.1.4. Kết quả nghiên cứu về độc tính
Trong suốt thời gian hơn 30 năm nghiên cứu và sử dụng DHC để điều rị bệnh, trên thế giới chưa ghi nhận trường hợp ngộ độc nào.
2.1.2. Một số chế phẩm từ DHC của nước ngoài
1. Sản phẩm từ DHC: bột lá, hạt (seeds), dịch cồn (tinture). Bột lá khô 5g pha nước nóng uống (như pha chè)
2. CT ChromaDex (
3. CT Pharmasave: Bột DHC 200mg/lần, 3 lần/ngày, điều trị bệnh gan, kể cả u gan (
4. Live 52 của Ấn Độ, ....
2.1.3. Chiết Diệp hạ châu
Chiết DHC được thực hiện chủ yếu với dung môi nước, tiếp theo là
16
dung môi cồn/nước. Quy trình chiết DHC được giới thiệu trong hình 1.3:
* Thu hái: có thể chiết ngay tất cả các bộ phận của cây thu hoạch được, hay chiết từng bộ phận riêng biệt, đặc biệt là lá, thân cây.
* Xử lý sơ chế: Có thể xử lý sản phẩm thu hái trước khi chiết, ví dụ phơi sấy khô, cắt hay xay nghiền nhỏ. Ví dụ chiết 10kg nguyên liệu / 100 lít nước.
* Chiết: chiết truyền thống sử dụng dung môi nước. Có thể sử dụng rung siêu âm để chiết. Thiết bị chiết thường làm bằng thép không gỉ.
* Quá trình lọc: chiết theo phương pháp thông dụng với nguồn nguyên liệu xác định, như thu hái tự nhiên hay canh tác có giám sát, lọc chỉ để loại bỏ phần xơ bã.
* Cô đặc có thể làm tiêu hao một phần hoạt chất do bay hơi, phân huỷ, và đặc biệt là oxi hoá. Thông dụng nhất là cô đặc áp suất thấp.
* Công đoạn bao gói bảo quản rất quan trọng đối với sản phẩm lưu kho lâu dài.
1. Thu h ̧i
2. Xö lý, s¬ chÕ
4. Läc 3. ChiÕt 7. KiÓn tra 8. Bao gãi
9. B¶o qu¶n
5. C« ®Æc
6. SÊy
Hình 1.3. Các công đoạn chủ yếu trong Quy trình chiết xuất Diệp hạ châu
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 2.2.1. Cây DHC
DHC (ngọc dưới lá) là tên chung của chi DHC (chi Phyllanthus). DHC 17
còn là tên lưu hành thông dụng ở nước ta chỉ chung các loài cây thuốc cổ truyền thuộc chi DHC (Phyllanthus), rất có giá trị và đã được sử dụng trong dân gian hàng nghìn năm nay, không chỉ ở nước ta mà còn ở nhiều nước khác trên khắp thế giới, điển hình là Ấn Độ, Nam Mỹ...
Chi DHC (chi Phyllanthus) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae),
Chi Phyllanthus là một trong những chi lớn nhất của họ Thầu dầu, với khoảng hơn 700 loài, phân bố khắp nơi đặc biệt tập trung ở vùng Đông Nam Á và vùng nhiệt đới của Nam Mỹ. Hai loài DHC được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là [6-10, 13-18, 20. 24. 26]:
1. Cây Diệp hạ châu (cây chó đẻ răng cưa) không có vị đắng, có tên khoa học là Phyllanthus urinaria L., được dân gian sử dụng làm thuốc chữa nhiều loại bệnh và được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây [8, 20, 60, 61].
2. Cây DHC đắng có tên khoa học là Phyllanthus amarus Schum. et Thonn. mọc hoang phổ biến ở nước ta và nhiều nước khác trên thế giới, được sử dụng để chữa đinh râu, mụn nhọt, lở loét, rắn cắn..., và đặc biệt là thuốc chữa viêm gan có hiệu quả, được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu [8, 9, 10, 13, 15, 18, 24, 26, 60, 61].
Hai cây thuốc quí này là đối tượng nghiên cứu chế tạo cao đặc qui mô pilot.
2.2.1.1. Về thực vật học
Những nghiên cứu mới đây về mặt thực vật học hai loài cây trên được tóm tắt trong bảng 1.1 [5, 6, 7, 17, 47, 61]. Ngoài ra các đặc điểm khác nhau về thân, lá, hoa và quả [8, 14, 16, 61], có mô tả chi tiết kèm theo ảnh minh hoạ (hình 1.1) [61].
18
a/ DHC Phyllanthus urinaria L
b/ DHC đắng Phyllanthus amarus Schum. et Thonn. Hình 1.1. Ảnh hai loài Diệp hạ châu
Bảng 1.1. Một số đặc điểm của hai loại cây DHC [61].
Bộ phận
DHC đắng Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.
Diệp hạ châu Phyllanthus urinaria L.
19
Thân cành Lá
Cụm hoa
Lá đài
Bề mặt quả Bề mặt hạt
tròn, hình trụ
nhỏ, mỏng, gân mờ
hoa đực và hoa cái mọc trên cùng đốt
5láđài
trơn nhẵn
sọc dọc, vằn ngang nhỏ
dẹt, có hai mấu cạnh
to dày hơn, gân mập nổi rõ
hoa cái ở dưới, hoa đực ở trên cành
6 lá đài
nhăn hay gai
có rãnh ngang lớn
Nếu đã có hai loài DHC (P.a và P.u), cần nhận nhau, có thể sử dụng hai đặc điểm chính: màu sắc và vị:
1. DHC (P. u) có thân màu tía, vị không đắng (hình 1a) 2. DHC đắng (P. a) thân xanh, có vị đắng (hình 1b)
2.2.1.2. Về thành phần hoá học
Đã phân lập được Hypophyllanthin và Phyllanthin (Lignan) có khả năng
bảo vệ gan, và β-Sitosterol, và một số hợp chất khác [13, 14, 16, 24, 61].
Trần Đình Thắng và đồng tác giả [16] đã nghiên cứu phân lập và xác định
một số chất phenolic từ cây DHC Phyllanthus urinaria L.
Nhiều tác giả đã nghiên cứu so sánh hai loài DHC trên [61].
- Chiết được Alcaloid bằng hỗn hợp dung môi CHCl3-MeOH (9:1)
- Chiết được polyphenol bằng hỗn hợp dung môi CHCl3-EtOAc-HCOOH
(7:3:1)
Các chất Alcaloid của DHC đắng (P. a) được nghiên cứu và giới thiệu trong [24]. Viện Dược liệu chế tạo Phyllantin từ bột cao khô DHC [9]. Các hợp chất Lignan được chiết xuất và nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan [60].
4.4.4. Chiết DHC đắng bng cồn/nước 30/70 trong PTN [12] 4.4.4.1. Dịch chiết cồn / nước 30/70
Mẫu DHC sạch, khô, chiết bằng hỗn hợp cồn/nước tỉ lệ thể tích: 30/70 (cồn 30o), tỉ lệ khối lượng DHC đắng/ cồn+nước là 1/7, đun cách thủy hồi lưu ở áp suất thường 4h. Sau đó lọc thu dịch chiết, cặn chiết lần 2 với tỉ lệ khối lượng DHC đắng/ cồn + nước là 1/4 trong 2h, lọc bỏ bã. Dịch chiết hai lần gộp lại để lắng 12 h ở nhiệt độ phòng, lọc thu dịch chiết rồi cô áp suất thấp, còn 1/5 thể tích, lọc qua giấy lọc được dịch chiết cồn/nuớc 30/70, (còn gọi là dịch chiết cồn 30o).
4.4.4.2. Hàm lượng chất tan do chiết cồn/nước: 30/70 (v/v)
Cô cạn áp suất thấp dịch chiết cồn 30o, còn 1/12 thể tích dung môi ban đầu (100g dược liệu được 40ml), sấy ở 400C cho đến khối lượng không đổi, tạo thành cao đặc có hàm ẩm khoảng 15%. Xác định hàm ẩm và chất tan, kết quả ghi trong bảng 4.12.
Bảng 4.12. Hàm lượng chất tan, chiết DHC đắng bằng cồn/nước 30/70
53
Mẫu
DHC đắng (g)
Hàm ẩm %
Cao đặc (g)
Hàm ẩm (%)
Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối)
1 50,24 13,75 15,79 14,93
2 50,10 13,75 15,79 15,23
3 50,75 13,75 15,95 15,22
4 50,36 13,75 15,84 15,13
TB 50,24 13,75 15,79 14,93
31,00 30,98 30,89 30,96 30,96
4.4.4.3. Hàm lượng Alcaloid trong DHC đắng chiết cồn/nước: 30/70 (v/v)
Thực nghiệm:
100 ml dịch chiết cồn 30o + 30 ml HCl 2N, đun hồi lưu 1h, lọc cặn thu dịch chiết rồi kiềm hoá bằng NH3 đặc đến pH 10-11, để lắng rồi lọc, sấy khô cặn ở 400C, tán nhỏ và hoà tan vào 100 ml methanol, lọc thu dịch chiết methanol, rồi thu hồi methanol áp suất thấp, được Alcaloid tổng (bảng 4.13).
Bảng 4.13. Hàm lượng Alcaloid trong DHC đắng chiết cồn/nước 30/70
Mẫu 1 2 3 TB
Dược liệu (g) 50,24 50,44 50,57 50,42
Hàm ẩm % 12,31 12,31 12,31 12,31
Alcaloid (g) 1,47 1,43 1,43 1,45
Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối) 3,35
3,24
3,23
3,27
4.4.4.4. Hàm lượng Flavonoid tan trong cồn 30 của cây DHC khô
Thực nghiệm:
54
Xác định hàm lượng Flavonoid của dược liệu DHC đắng tan trong cồn 30o được thực hiện như đối với dịch chiết nước. Lắc dịch chiết với cloroform, thu phần tan trong cồn 30o và chiết với ethylacetat đến không màu, thu hồi ethylacetat dưới áp suất thấp ta thu được Flavonoid tổng số.
Kết quả được giới thiệu trong bảng 4.14.
Bảng 4.14. Hàm lượng Flavonoid trong DHC đắng chiết cồn/nước 30/70
Mẫu Dược liệu (g)
1 50,45
2 50,68
3 50,24
TB 50,46
Hàm ẩm % 13,79 13,79 13,79 13,79
Flavonoid(g) Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối) 0,59 1,37
0,59 1,37
0,60 1,39
0,59 1,38
4.4.4.5. Hàm lượng Lignan trong dịch chiết cồn nước 30/70
Phương pháp dựa theo tài liệu [44, 45]. Kết quả ghi trong bảng 4.15. Bảng 4.15. Hàm lượng Lignan trong DHC đắng chiết cồn/nước 30/70
Mẫu Dược liệu (g)
1 49,52
2 49,67
3 50,71
TB 49,97
Hàm ẩm % 12,37 12,37 12,37 12,37
Lignan (g) 0,47 0,50 0,51 0,49
Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối) 1,09
1,16
1,15
1,13
4.4.5. Chiết DHC đắng bng cồn/nước 50/50 trong PTN [12] 4.4.5.1. Dịch chiết cồn/nước 50/50 (cồn 50o)
55
Tương tự như phương pháp chiết nước và chiết cồn nước 30/70.
4.4.5.2. Hàm lượng chất tan từ DHC, chiết cồn/nước: 50/50 v/v
Thực nghiệm: Tương tự như đối với chiết DHC đắng bằng cồn/nước 30/70. Kết quả: Kết quả được giới thiệu trong bảng 4.16.
Bảng 4.16. Lượng chất tan từ DHC đắng thu được bằng chiết cồn/nước 50/50
Mẫu
DHC đắng (g)
Hàm ẩm %
Cao đặc (g)
Hàm ẩm (%)
Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối)
1 100,26 14,22 34,25 15,97
2 99,78 14,22 32,63 15,85
3 100,53 14,22 31,42 14,21
TB 100,19 14,22 32,77 15,34
33,47 32,08 31,26 32,27
4.4.5.3. Hàm lượng Alcaloid trong DHC đắng chiết cồn/nước: 50/50 (v/v) Thực nghiệm: Tương tự như đối với chiết Alcaloid bằng cồn/nước 30/70. Kết quả: Kết quả được giới thiệu trong bảng 4.17.
Bảng 4.17. Hàm lượng Alcaloid trong DHC đắng chiết cồn/nước 50/50
Mẫu
1 2 3 TB
Dược liệu (g)
32,34 33,58 35,57 33,83
Hàm ẩm %
13,37 13,37 13,37 13,37
Alcaloid (g)
1,03 0,97 0,94 0,98
Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối)
3,68 3,36 3,06 3,37
4.4.5.4. Hàm lượng Flavonoid trong DHC đắng chiết cồn/nước 50/50
56
Xác định hàm lượng Flavonoid của dược liệu DHC đắng tan trong cồn 50o được thực hiện như đối với cồn 30o. Hàm lượng Flavonoid của dược liệu DHC đắng tan trong cồn 50o được giới thiệu trong bảng 4.18.
Bảng 4.18. Hàm lượng Flavonoid trong DHC đắng chiết cồn/nước 50/50
Mẫu Dược liệu (g)
1 30,46
2 30,25
3 30,57
TB 30,43
Hàm ẩm %
13,67 13,67 13,67 13,67
Flavonoid(g) Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối)
0,41 1,57 0,43 1,64
0,41 1,57
0,42 1,59
4.4.5.5. Hàm lượng Lignan trong DHC đắng chiết cồn/nước 50/50 Thực nghiệm: tuơng tự như đã ghi trên đây
Kết quả: Kết quả thực nghiệm được giới thiệu trong bảng 4.19.
Bảng 4.19. Hàm lượng Lignan trong DHC đắng chiết cồn/nước 50/50
Mẫu Dược liệu (g)
1 40,43
2 30,35
3 30,56
TB 33,78
Hàm ẩm %
13,25 13,25 13,25 13,25
Lignan (g)
0,46 0,32 0,29 0,36
Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối)
1,32 1,22 1,11 1,22
4.4.6. Chiết DHC đắng bng cồn 94o trong PTN [12,25] 4.4.6.1. Dịch chiết DHC đắng bng cồn 94o
57
Cách thức thực hiện như với dịch chiết nước, mục 4.4.3.1.
4.4.6.2. Hàm lượng chất tan từ DHC đắng chiết cồn 94o
Hàm lượng chât tan trong cồn 94o, hiệu suất chiết, được ghi trong bảng 4.20. Bảng 4.20. Lượng chất tan từ DHC đắng thu được bằng chiết cồn 94o
Mẫu
1 2 3 TB
DHC đắng (g) 30,55
31,24 30,47 30,75
Hàm ẩm % 13,53 13,53 13,53 13,53
Cao đặc (g) 6,22 7,13 6,22 6,52
Hàm ẩm (%)
14,53 14,71 14,49 14,56
Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối) 23,56 26,38 23,60
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Môc lôc
Mục
Phần A: Tóm tắt kết quả nổi bật của đề tài (chủ nhiệm ĐT tự đánh giá) 8
1. Kết quả nổi bật của đề tài 8 1.1. Đóng góp mới của đề tài 8 1.2. Kết quả cụ thể (các sản phẩm cụ thể) 8 1.3. Hiệu quả về kinh tế 9 1.4. Hiệu quả về xã hội 9 1.5. Hiệu quả khác 10
2. Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội 10
3. Đánh giá thực hiện ĐT (đối chiếu với ĐCNC được phê duyệt ) 10 (a) Tiến độ 10 (b) Thực hiện mục tiêu nghiên cứu 10 (c) Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cương 11 (d) Đánh giá việc sử dụng kinh phí 11
4. Các ý kiến đề xuất 11 Phần B: Nội dung báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ 12
1. Đặt vấn đề 12 1.1. Tình hình chung - Tính cấp thiết 12 1.2. Giả thiết nghiên cứu của đề tài 13 1.3. Mục tiêu nghiên cứu 13
2. Tổng quan đề tài 14 2.1. Một số kết quả nghiên cứu DHC ở nước ngoài 14 2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 18
3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 24 3.1. Thiết kế nghiên cứu 24 3.2. Mẫu và đối tượng nghiên cứu 24 3.3. Phương pháp nghiên cứu 24
3.3.1. Chỉ tiêu nghiên cứu 24 3.3.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu 25 3.3.3. Một số thiết bị hóa chất vật tư chính 30
Trang
5
3.3.4. Xây dựng Quy trình sản xuất cao đặc qui mô pilot 31
4. Kết quả nghiên cứu 32 4.1. Nguồn dược liệu DHC 32 4.1.1. Chi DHC (Phyllanthus) 32 4.1.2. Phyllanthus amarus Schum. et Thonn. 32 4.1.3. Phyllanthus urinaria Linn 33 4.1.4. Nguồn dược liệu DHC ở nước ta 34 4.2. Thu hái sơ chế và bảo quản dược liệu 38 4.2.1. Mùa thu hái 38 4.2.2. Nguồn dược liệu 38 4.2.3. Quy trình thu hái, sơ chế 38 4.2.4. Quy trình bảo quản dược liệu 39 4.3. Nhu cầu dược liệu DHC 42 4.4. Nghiên cứu cây DHC đắng 45 4.4.1. Định tính hóa học DHC đắng 45 4.4.2. Hàm lượng tro DHC đắng 50 4.4.3. Nghiên cứu chiết DHC đắng bằng nước quy mô PTN 50 4.4.4. Chiết DHC đắng bằng cồn/nước 30/70 trong PTN 53 4.4.5. Chiết DHC đắng bằng cồn/nước 50/50 trong PTN 56 4.4.6. Chiết DHC đắng bằng cồn 94o trong PTN [12,25] 58 4.4.7. Hàm lượng hoạt chất trong DHC đắng 59 4.5. Nghiên cứu DHC (P.u) 60 4.5.1. Định tính thành phần hóa học DHC (P.u) 60 4.5.2. Định lượng một số hoạt chất DHC (P.u) 61 4.6. Bàn luận kết quả nghiên cứu phòng thí nghiệm 61 4.6.1. So sánh định tính thành phần hóa học 61 4.6.2. So sánh định lượng thành phần hóa học hai loài P.a và P.u 62 4.6.3. So sánh hiệu quả chiết của dung môi 63 4.6.4. Bàn luận về quy trình chiết phòng thí nghiệm 64 4.6.5. Lựa chọn dung môi và quy trình chiết pilot 65 4.7. Điều chế cao đặc hai loài P.a và P.u qui mô pilot 66 4.7.1. Kết quả chiết pilot tạo cao đặc 66 4.7.2. Kết quả phân tích kiểm tra cao đặc chiết pilot 67 4.7.3. Bảo quản cùng kiệt oxi hai loài cao đặc p.a và p.u 72 4.8. Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot 74 4.8.1. Nguyên phụ liệu dung môi hoá chất 74
4.8.2. Thiết bị, máy móc 4.8.3. An toàn lao động
75 76
6
4.8.4. Sơ đồ Quy trình sản xuất 77 4.8.5. Mô tả Quy trình sản xuất qui mô pilot cao đặc DHC 78 4.8.6. Kiểm tra chất lượng 80 4.8.7. Bã chiết – bảo vệ môi truờng 80 4.8.8. Các hồ sơ và sổ ghi chép cần thiết cho sản xuất cao 81 4.8.9. Quản lý chất lượng 82
4.9. Sản xuất 200 kg cao đặc DHC đắng 83
4.9.1. Nguyên liệu 83 4.9.2. Tiến hành 83 4.9.3. Hiệu suất chiết – tạo cao đặc 83
4.10. Đánh giá chất lượng cao đặc sản xuất được 84
4.10.1. Tính chất và thành phần hóa học 84 4.10.2. Hàm lượng kim loại nặng và thuốc BVTV 85 4.10.3. Vi khuẩn, men mốc 87 4.10.4. Độc tính cấp LD50 87 4.10.5. Tác dụng bảo vệ gan 89 4.10.6. Phiếu kiểm nghiệm 92
4.11. Tiêu chuẩn cơ sở về chất lượng cao đặc DHC 92
4.11.1. Tiêu chuẩn nguyên liệu DHC đắng P.a 93
4.11.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cao đặc DHC 96
4.12. Xây dựng mẫu mã thương hiệu cao đặc DHC 100
4.12.1. Yêu cầu chung 100 4.12.2. Nội dung xây dựng mẫu mã thương hiệu 100 4.12.3. Kết quả xây dựng mẫu mã thương hiệu 101
5. Bàn luận
6. Kết luận và kiến nghị 7. Tài liệu tham khảo
103 105 108
7
Phần A
Tóm tắt kết quả nổi bật của đề tài
1. Kết quả nổi bật của đề tài 1.1. Đóng góp mới của đề tài
• Đã xác định được không chỉ có 1 loài Phyllanthus amarus Schum. et Thonn (P.a) duy nhất. Nước ta có ít nhất 2 phân loài (giống) P.a
• Đã đề xuất phương pháp hong khô dược liệu thay thế cho phơi nắng
• Đã định lượng được nhóm chất có hoạt tính trong cao đặc là Alcaloid và Lignan
• Đã xây dựng được Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot
• Đã áp dụng phương pháp bảo quản chống oxy hóa, kín khí cùng kiệt oxy, cho
bảo quản dược liệu và cao đặc DHC đắng
1.2. Kết quả cụ thể (các sản phẩm cụ thể) * Về xác định tiêu chuẩn hóa dược liệu
Thu thập đ ược dược liệu DHC tại các địa điểm Thái Nguyên, Bắc Giang, Cát Bà, Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Yên Bài..., phân biệt được loài P.a và loài P.u.
* Về thành phần hóa học
Đã định lượng ba nhóm chất chính là Alcaloid, Flavonoid và Lignan trong cây và trong cao đặc hai loài DHC.
* Về Quy trình sản xuất
Đã xây dựng Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot, hàm luợng Alcaloid, Flavonoid và Lignan trong cao thành phẩm đạt TCCS.
* Về bao gói bảo quản
Đã bảo quản thử nghiệm trong điều kiện cùng kiệt oxy cho dược liệu và cao đặc thành phẩm, đạt chất lượng và kéo dài được thời gian lưu kho.
8
* Về xây dựng thương hiệu
Đã xây dựng tiêu chuẩn dược liệu DHC đắng, tiêu chuẩn chất lượng cao đặc thành phẩm.
Đã sản xuất hơn 200kg cao đặc DHC, và ổn định Quy trình sản xuất cao đặc DHC qui mô pilot, bước đầu cung ứng sản phẩm cao đặc cho thị trường.
* Về đào tạo
Góp phần đào tạo 01 cao học với luận văn ‘Nghiên cứu hóa học thực vật cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) mọc hoang tại Thái Nguyên’, kết quả tốt.
* Về công trình công bố
- 01 bài báo trên tạp chí Hóa học : Nguyễn Văn Phong, Nguyễn Mạnh Hùng, Nguyễn Văn Thông, Đinh Văn Thịnh, Đỗ Thị Lan Hương, Lê Xuân Quế, Nghiên cứu chế tạo cao diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum. et Thonn. qui mô pilot, TC Hóa học, T.46, 5A, 2008, tr.454-457
- 01 tham gia Hội thảo ‘Nghiên cứu và phát triển các sản phẩm tự nhiên’ 14/11/2008, ĐHBK Hà Nội.
1.3. Hiệu quả về kinh tế
Đã sản xuất 2000kg cao đặc thành phẩm và tính theo giá thị trường có thể thu hồi vốn đầu tư sản xuất pilot sau 1 - 2 năm.
1.4. Hiệu quả về xã hội
• Giải quyết việc làm cho nông dân thu hái cây DHC đắng mọc tự nhiên và gieo trồng loại cây này.
9
• Cung cấp nguyên liệu cao ổn định chất lượng cho sản xuất thuốc điều trị bệnh gan, hạn chế thấp nhất sự phụ thuộc mùa vụ.
• Góp phần cung cấp thuốc điều trị bệnh gan hiệu quả cao, giá phù hợp, đáp ứng yêu cầu của đông đảo nhân dân.
1.5. Hiệu quả khác
• Góp phần phát triển ngành công nghệ hóa dược
• Từng bước đưa công nghệ sản xuất có tính công nghiệp trong việc khai
thác nguồn thảo mộc cho đông dược.
2. Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội
• Đã phối hợp với công ty dược phẩm Đà Nẵng bào chế thuốc điều trị bệnh gan từ cao đặc DHC đắng sản xuất tại CTCP Hóa Dược Việt Nam.
• Một phần nhỏ sản phẩm cao đặc DHC đắng đã được sử dụng trực tiếp không cần bào chế, thay thế cho việc ‘sắc’ thuốc truyền thống hay ‘hãm’ chè từ DHC khô.
3. Đánh giá thực hiện đề tài so với đề cương đã được phê duyệt (a) Tiến độ: Đúng theo tiến độ
(b) Thực hiện mục tiêu nghiên cứu
Thực hiện đầy đủ các mục tiêu nghiên cứu đề ra
(c) Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cương
• Tạorađầyđủcácsảnphẩmđãdựkiếntrongđềcương
• Chấtlượngsảnphẩmđạtyêucầunhưđãghitrongđềcương
• Khốilượngcaođặcsảnxuấtđượcvượtnhiềulầnsovớidựkiến.
10
(d) Đánh giá việc sử dụng kinh phí
Kinh phí đã được thực hiện theo định mức, nội dung và đối tượng chi như đã được phê duyệt trong đề cương, đã thanh quyết toán xong.
4. Các ý kiến đề xuất
4.1. Trân trọng đề nghị Bộ xét duyệt dự án sản xuất cao Diệp hạ châu làm thuốc điều trị bệnh gan
Nước ta có khoảng 3 - 4 triệu người bị viêm gan B mãn tính. Trong khi thuốc tây y điều trị bệnh gan chưa nhiều, giá rất cao, thuốc bào chế từ DHC đắng có tác dụng tốt, lại không có tác dụng phụ, giá thành chỉ bằng 1/20 – 1/30 giá thuốc tây. Nhu cầu về thuốc trị bệnh gan bào chế từ DHC sẽ tăng nhanh khoảng 20% năm, số lượng sẽ rất lớn. Đến 2015, nhu cầu cao DHC lên đến 200 - 250 tấn/năm.
4.2. Đề nghị Bộ Y tế xem xét cho phép xây dựng một dự án ‘‘Công nghệ hóa thảo dược Việt Nam phòng chống và điều trị bệnh gan’’, cơ quan chủ trì xây dựng Dự án sẽ là Công Ty Cổ Phần Hóa Dược Việt Nam, ngoài ra còn có các cơ quan phối hợp các bộ các ngành.
Theo Tổ chức Y tế Thế giới, trên thế giới hiện có đến trên 350 triệu người (khoảng 5% dân số thế giới) viêm gan B mãn tính. Châu Á có số người mắc bệnh mãn tính nhiều nhất, trên 200 triệu. Hàng năm có đến 2 triệu người nhiễm virus viêm gan B bị chết do ung thư gan, viêm xơ gan. Chưa kể đến số bệnh gan do phơi nhiễm đối với hoá chất, thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, các loại ô nhiễm môi trường khác. Vì vậy nhu cầu thực tế về thuốc trị bệnh gan sẽ rất lớn.
11
Phần B
Nội dung báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ
1. Đặt vấn đề
1.1. Tình hình chung – tính cấp thiết
Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, có hệ thực vật rất phong phú, đa dạng, với khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài đã được nhân dân ta dùng làm thuốc [3, 4], là nguồn tài nguyên thiên nhiên quí báu, nguồn gen vô giá không phải quốc gia nào cũng có.
Hệ thực vật phong phú là tiền đề cho sự phát triển ngành hoá học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta, là nguồn nguyên liệu có giá trị cho ngành hóa dược đang trên đà phát triển.
Các phương thuốc y học cổ truyền, các nguồn đông dược có những ưu thế nhất định, đối với nhiều lĩnh vực y tế có tính vượt trội cao, nhất là độc tính thấp, hiếm khi có tác dụng không mong muốn, và dễ sử dụng. Nguồn tài nguyên sinh học này có thể tái tạo tự nhiên hay nhân giống và sinh khối nhân tạo, không gây ô nhiễm môi trường, không làm tổn hại đến môi sinh. Hiện có tới 60%-70% các loại thuốc chữa bệnh đang lưu hành hay đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên [3].
DHC là một cây thuốc quí, được nhiều nước trên thế giới sử dụng, ngày càng đuợc quan tâm nghiên cứu. DHC có tác dụng bảo vệ gan, chống viêm gan, làm phục hồi chức năng gan và ức chế virus viêm gan B phát triển. Nhiều chế phẩm bào chế từ DHC đã được lưu hành ở nước ta, thay thế một phần thuốc nhập đắt tiền, mang lại lợi ích hết sức thiết thực về y tế, xã hội, và đặc biệt về kinh tế cho bệnh nhân bị bệnh gan ở nông thôn.
Tuy nhiên việc sản xuất thuốc còn phụ thuộc thời vụ thu hái, việc chế biến nguyên liệu, bào chế bán thành phẩm còn thủ công, nhỏ lẻ, chất lượng sản phẩm chưa ổn định.
12
Để sản xuất qui mô lớn, có tính công nghiệp, cần có nguồn nguyên liệu ổn định, cả về chất lượng và số lượng, không bị ảnh hưởng bởi thời vụ thu hái. Vì vậy việc chiết hoạt chất tạo cao đặc qui mô đủ lớn, làm nguồn nguyên liệu ổn định đảm bảo chất lượng cao cung ứng cho bào chế thuốc là hết sức cần thiết.
1.2. Giả thiết nghiên cứu của đề tài
Từ nhu cầu cấp thiết trên đây và thực tế sử dụng đông dược nói chung và DHC nói riêng, có thể giả thiết xây dựng được Quy trình sản xuất qui mô pilot cao đặc DHC, tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng, và đảm bảo tính ổn định lâu dài của sản phẩm.
1.3. Mục tiêu của đề tài là
Xuất phát từ nhu cầu thực tế, giả thiết trên đây, đề tài đề ra mục tiêu sau: •Xây dựng quy trình sản xuất cao đặc qui mô pilot.
Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn. ) và Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.).
•Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng hai loại cao này. • Theo dõi độ ổn định của cao.
13
2. Tæng quan ®Ò tμi
2.1. Một số kết quả nghiên cứu DHC ở nước ngoài
2.1.1. Nghiên cứu về DHC
DHC là cây thuốc tự nhiên, nên chỉ quốc gia nào có nguồn tài nguyên này mới có quá trình sử dụng lâu đời. Các nước nghiên cứu về DHC đều có nguồn nguyên liệu DHC tự nhiên, điển hình nhất là Ấn Độ, một số nước Nam Mỹ, Trung Quốc ... Trong số đó, Ấn Độ là nước có nhiều kết quả ứng dụng Diệp hạ châu, và có những nghiên cứu cơ bản có hệ thống. Ngoài ra một số nước phát triển như Mỹ, Nhật, Pháp mới đây đều có những công trình nghiên cứu về Diệp hạ châu theo phương pháp của y học hiện đại.
2.1.1.1. Về thực vật học
DHC từ lâu được sử dụng làm thuốc ở nhiều nước : Trung Quốc, Ấn độ, các nước Nam Mỹ (Peru, Achentina,...). Trên thế giới đã phát hiện trên 700 loài Diệp hạ châu, với tên gọi dân gian rất khác nhau, nhưng trong số được nghiên cứu nhiều nhất vẫn là hai loài Phyllanthus amarus Schum et Thonn. và Phyllanthus urinaria L.
Có thể liệt kê một số tài liệu khoa học nghiên cứu về hai loài DHC này:
1. NghiêncứuvềloàiPhyllanthusurinariaL.[28,34,37,38,50]
2. NghiêncứuvềloàiPhyllanthusamarusSchum.etThonn.[25,29,33,36,41,42,
49, 59, 62].
Ngoài ra còn có một số loài khác được nghiên cứu:
3. NghiêncứuvềloàiPhyllanthusniruri[46,48,50,67]
4. Nghiêncứuvềloàikhác(Phyllanthusacidus[55],(Phyllanthusemblica-)[52]) 5. Nghiên cứu về Phyllanthus, không phân biệt loài nào [63, 69, 70] cho thấy
14
khả năng sử dụng hỗn hợp các loài Diệp hạ châu.
2.1.1.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học
Các nhóm chất chính có giá trị về tác động sinh học [27, 35, 44, 64] - Lignan (có nhiều trong lá, thân), gồm các hợp chất chính sau:
+ Phyllanthin và Hypophyllanthin, có tới > 0,3% khối lượng (w) + Lintetralin, Lintetralin ( 4-hydroxy: Seco:, iso
: > 0,02% w+ Niranthin, Niranthin (demethylenedioxy, hydroxy): > 0,04% w + Nirphyllin, Nirtetralin > 0,09% w
- Flavonoid (trong lá, thân):
+ Catechin,(+):, Catechin, epi: (-):;Catechin-3-o-gallate,epi: (-):
+ Gallocatechin, (+):;Gallocatechin, epi: (-): ; Gallocatechin-3-o-gallate, epi: (-): + Phyllanthus Flavonoid FG-1 ; Phyllanthus Flavonoid FG-2
- Alcaloid :
+ Nirurine
+ Octa-trans-2-trans-4-dienamide, Alcaloid-mis, Octa-trans-2-trans-4-dienamide + Indolizidine Alcaloid
+ Securinine (nor:, nor: (-), nor: 4-methoxy) (Pyrrolizidine Alcaloid)
+ Ecurinine, nor: Ent (Pyrrolizidine Alcaloid)
- Steroid (đến 0,07%):
+ Cholesterol, 24-iso-propyl: ; Estradiol ; Fraternusterol ;
+ Phyllanthosecosteryl Ester ; Phyllanthosterol ; Phyllanthostigmasterol ; β- Sitosterol Ngoài ra còn có tannin, lipid, coumarin.
Còn có nhiều nghiên cứu mới về hoá học của DHC [35, 44, 45, 64].
15
2.1.1.3. Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học
Nghiên cứu khả năng chữa bệnh của DHC có các nội dung sau:
a/ Tác dụng hồi phục gan, điều trị viêm gan B, các bệnh khác về gan [28, 33,
34, 36-40, 42, 46, 49, 50, 59, 62, 63, 67-70]
b/ Tác dụng chống virus viêm gan B [28, 31, 33, 34, 36, 37, 40, 42, 46, 49, 57-
59, 62, 66, 67]
c/ Điều hòa đường huyết, lợi tiểu, hạ huyết áp [43, 51, 53, 56]
d/ Tác dụng bảo vệ hệ tim mạch [38, 50, 52]
đ/ Tác dụng chống ung thư (anticancer-cytotoxicity), chống HIV, [30, 45, 54]
2.1.1.4. Kết quả nghiên cứu về độc tính
Trong suốt thời gian hơn 30 năm nghiên cứu và sử dụng DHC để điều rị bệnh, trên thế giới chưa ghi nhận trường hợp ngộ độc nào.
2.1.2. Một số chế phẩm từ DHC của nước ngoài
1. Sản phẩm từ DHC: bột lá, hạt (seeds), dịch cồn (tinture). Bột lá khô 5g pha nước nóng uống (như pha chè)
You must be registered for see links
2. CT ChromaDex (
You must be registered for see links
) sản phẩm Phyllanthin và hypophyllantin, Quercetin (5mg, 10mg)3. CT Pharmasave: Bột DHC 200mg/lần, 3 lần/ngày, điều trị bệnh gan, kể cả u gan (
You must be registered for see links
)4. Live 52 của Ấn Độ, ....
2.1.3. Chiết Diệp hạ châu
Chiết DHC được thực hiện chủ yếu với dung môi nước, tiếp theo là
16
dung môi cồn/nước. Quy trình chiết DHC được giới thiệu trong hình 1.3:
* Thu hái: có thể chiết ngay tất cả các bộ phận của cây thu hoạch được, hay chiết từng bộ phận riêng biệt, đặc biệt là lá, thân cây.
* Xử lý sơ chế: Có thể xử lý sản phẩm thu hái trước khi chiết, ví dụ phơi sấy khô, cắt hay xay nghiền nhỏ. Ví dụ chiết 10kg nguyên liệu / 100 lít nước.
* Chiết: chiết truyền thống sử dụng dung môi nước. Có thể sử dụng rung siêu âm để chiết. Thiết bị chiết thường làm bằng thép không gỉ.
* Quá trình lọc: chiết theo phương pháp thông dụng với nguồn nguyên liệu xác định, như thu hái tự nhiên hay canh tác có giám sát, lọc chỉ để loại bỏ phần xơ bã.
* Cô đặc có thể làm tiêu hao một phần hoạt chất do bay hơi, phân huỷ, và đặc biệt là oxi hoá. Thông dụng nhất là cô đặc áp suất thấp.
* Công đoạn bao gói bảo quản rất quan trọng đối với sản phẩm lưu kho lâu dài.
1. Thu h ̧i
2. Xö lý, s¬ chÕ
4. Läc 3. ChiÕt 7. KiÓn tra 8. Bao gãi
9. B¶o qu¶n
5. C« ®Æc
6. SÊy
Hình 1.3. Các công đoạn chủ yếu trong Quy trình chiết xuất Diệp hạ châu
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 2.2.1. Cây DHC
DHC (ngọc dưới lá) là tên chung của chi DHC (chi Phyllanthus). DHC 17
còn là tên lưu hành thông dụng ở nước ta chỉ chung các loài cây thuốc cổ truyền thuộc chi DHC (Phyllanthus), rất có giá trị và đã được sử dụng trong dân gian hàng nghìn năm nay, không chỉ ở nước ta mà còn ở nhiều nước khác trên khắp thế giới, điển hình là Ấn Độ, Nam Mỹ...
Chi DHC (chi Phyllanthus) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae),
Chi Phyllanthus là một trong những chi lớn nhất của họ Thầu dầu, với khoảng hơn 700 loài, phân bố khắp nơi đặc biệt tập trung ở vùng Đông Nam Á và vùng nhiệt đới của Nam Mỹ. Hai loài DHC được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là [6-10, 13-18, 20. 24. 26]:
1. Cây Diệp hạ châu (cây chó đẻ răng cưa) không có vị đắng, có tên khoa học là Phyllanthus urinaria L., được dân gian sử dụng làm thuốc chữa nhiều loại bệnh và được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây [8, 20, 60, 61].
2. Cây DHC đắng có tên khoa học là Phyllanthus amarus Schum. et Thonn. mọc hoang phổ biến ở nước ta và nhiều nước khác trên thế giới, được sử dụng để chữa đinh râu, mụn nhọt, lở loét, rắn cắn..., và đặc biệt là thuốc chữa viêm gan có hiệu quả, được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu [8, 9, 10, 13, 15, 18, 24, 26, 60, 61].
Hai cây thuốc quí này là đối tượng nghiên cứu chế tạo cao đặc qui mô pilot.
2.2.1.1. Về thực vật học
Những nghiên cứu mới đây về mặt thực vật học hai loài cây trên được tóm tắt trong bảng 1.1 [5, 6, 7, 17, 47, 61]. Ngoài ra các đặc điểm khác nhau về thân, lá, hoa và quả [8, 14, 16, 61], có mô tả chi tiết kèm theo ảnh minh hoạ (hình 1.1) [61].
18
a/ DHC Phyllanthus urinaria L
b/ DHC đắng Phyllanthus amarus Schum. et Thonn. Hình 1.1. Ảnh hai loài Diệp hạ châu
Bảng 1.1. Một số đặc điểm của hai loại cây DHC [61].
Bộ phận
DHC đắng Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.
Diệp hạ châu Phyllanthus urinaria L.
19
Thân cành Lá
Cụm hoa
Lá đài
Bề mặt quả Bề mặt hạt
tròn, hình trụ
nhỏ, mỏng, gân mờ
hoa đực và hoa cái mọc trên cùng đốt
5láđài
trơn nhẵn
sọc dọc, vằn ngang nhỏ
dẹt, có hai mấu cạnh
to dày hơn, gân mập nổi rõ
hoa cái ở dưới, hoa đực ở trên cành
6 lá đài
nhăn hay gai
có rãnh ngang lớn
Nếu đã có hai loài DHC (P.a và P.u), cần nhận nhau, có thể sử dụng hai đặc điểm chính: màu sắc và vị:
1. DHC (P. u) có thân màu tía, vị không đắng (hình 1a) 2. DHC đắng (P. a) thân xanh, có vị đắng (hình 1b)
2.2.1.2. Về thành phần hoá học
Đã phân lập được Hypophyllanthin và Phyllanthin (Lignan) có khả năng
bảo vệ gan, và β-Sitosterol, và một số hợp chất khác [13, 14, 16, 24, 61].
Trần Đình Thắng và đồng tác giả [16] đã nghiên cứu phân lập và xác định
một số chất phenolic từ cây DHC Phyllanthus urinaria L.
Nhiều tác giả đã nghiên cứu so sánh hai loài DHC trên [61].
- Chiết được Alcaloid bằng hỗn hợp dung môi CHCl3-MeOH (9:1)
- Chiết được polyphenol bằng hỗn hợp dung môi CHCl3-EtOAc-HCOOH
(7:3:1)
Các chất Alcaloid của DHC đắng (P. a) được nghiên cứu và giới thiệu trong [24]. Viện Dược liệu chế tạo Phyllantin từ bột cao khô DHC [9]. Các hợp chất Lignan được chiết xuất và nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan [60].
4.4.4. Chiết DHC đắng bng cồn/nước 30/70 trong PTN [12] 4.4.4.1. Dịch chiết cồn / nước 30/70
Mẫu DHC sạch, khô, chiết bằng hỗn hợp cồn/nước tỉ lệ thể tích: 30/70 (cồn 30o), tỉ lệ khối lượng DHC đắng/ cồn+nước là 1/7, đun cách thủy hồi lưu ở áp suất thường 4h. Sau đó lọc thu dịch chiết, cặn chiết lần 2 với tỉ lệ khối lượng DHC đắng/ cồn + nước là 1/4 trong 2h, lọc bỏ bã. Dịch chiết hai lần gộp lại để lắng 12 h ở nhiệt độ phòng, lọc thu dịch chiết rồi cô áp suất thấp, còn 1/5 thể tích, lọc qua giấy lọc được dịch chiết cồn/nuớc 30/70, (còn gọi là dịch chiết cồn 30o).
4.4.4.2. Hàm lượng chất tan do chiết cồn/nước: 30/70 (v/v)
Cô cạn áp suất thấp dịch chiết cồn 30o, còn 1/12 thể tích dung môi ban đầu (100g dược liệu được 40ml), sấy ở 400C cho đến khối lượng không đổi, tạo thành cao đặc có hàm ẩm khoảng 15%. Xác định hàm ẩm và chất tan, kết quả ghi trong bảng 4.12.
Bảng 4.12. Hàm lượng chất tan, chiết DHC đắng bằng cồn/nước 30/70
53
Mẫu
DHC đắng (g)
Hàm ẩm %
Cao đặc (g)
Hàm ẩm (%)
Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối)
1 50,24 13,75 15,79 14,93
2 50,10 13,75 15,79 15,23
3 50,75 13,75 15,95 15,22
4 50,36 13,75 15,84 15,13
TB 50,24 13,75 15,79 14,93
31,00 30,98 30,89 30,96 30,96
4.4.4.3. Hàm lượng Alcaloid trong DHC đắng chiết cồn/nước: 30/70 (v/v)
Thực nghiệm:
100 ml dịch chiết cồn 30o + 30 ml HCl 2N, đun hồi lưu 1h, lọc cặn thu dịch chiết rồi kiềm hoá bằng NH3 đặc đến pH 10-11, để lắng rồi lọc, sấy khô cặn ở 400C, tán nhỏ và hoà tan vào 100 ml methanol, lọc thu dịch chiết methanol, rồi thu hồi methanol áp suất thấp, được Alcaloid tổng (bảng 4.13).
Bảng 4.13. Hàm lượng Alcaloid trong DHC đắng chiết cồn/nước 30/70
Mẫu 1 2 3 TB
Dược liệu (g) 50,24 50,44 50,57 50,42
Hàm ẩm % 12,31 12,31 12,31 12,31
Alcaloid (g) 1,47 1,43 1,43 1,45
Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối) 3,35
3,24
3,23
3,27
4.4.4.4. Hàm lượng Flavonoid tan trong cồn 30 của cây DHC khô
Thực nghiệm:
54
Xác định hàm lượng Flavonoid của dược liệu DHC đắng tan trong cồn 30o được thực hiện như đối với dịch chiết nước. Lắc dịch chiết với cloroform, thu phần tan trong cồn 30o và chiết với ethylacetat đến không màu, thu hồi ethylacetat dưới áp suất thấp ta thu được Flavonoid tổng số.
Kết quả được giới thiệu trong bảng 4.14.
Bảng 4.14. Hàm lượng Flavonoid trong DHC đắng chiết cồn/nước 30/70
Mẫu Dược liệu (g)
1 50,45
2 50,68
3 50,24
TB 50,46
Hàm ẩm % 13,79 13,79 13,79 13,79
Flavonoid(g) Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối) 0,59 1,37
0,59 1,37
0,60 1,39
0,59 1,38
4.4.4.5. Hàm lượng Lignan trong dịch chiết cồn nước 30/70
Phương pháp dựa theo tài liệu [44, 45]. Kết quả ghi trong bảng 4.15. Bảng 4.15. Hàm lượng Lignan trong DHC đắng chiết cồn/nước 30/70
Mẫu Dược liệu (g)
1 49,52
2 49,67
3 50,71
TB 49,97
Hàm ẩm % 12,37 12,37 12,37 12,37
Lignan (g) 0,47 0,50 0,51 0,49
Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối) 1,09
1,16
1,15
1,13
4.4.5. Chiết DHC đắng bng cồn/nước 50/50 trong PTN [12] 4.4.5.1. Dịch chiết cồn/nước 50/50 (cồn 50o)
55
Tương tự như phương pháp chiết nước và chiết cồn nước 30/70.
4.4.5.2. Hàm lượng chất tan từ DHC, chiết cồn/nước: 50/50 v/v
Thực nghiệm: Tương tự như đối với chiết DHC đắng bằng cồn/nước 30/70. Kết quả: Kết quả được giới thiệu trong bảng 4.16.
Bảng 4.16. Lượng chất tan từ DHC đắng thu được bằng chiết cồn/nước 50/50
Mẫu
DHC đắng (g)
Hàm ẩm %
Cao đặc (g)
Hàm ẩm (%)
Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối)
1 100,26 14,22 34,25 15,97
2 99,78 14,22 32,63 15,85
3 100,53 14,22 31,42 14,21
TB 100,19 14,22 32,77 15,34
33,47 32,08 31,26 32,27
4.4.5.3. Hàm lượng Alcaloid trong DHC đắng chiết cồn/nước: 50/50 (v/v) Thực nghiệm: Tương tự như đối với chiết Alcaloid bằng cồn/nước 30/70. Kết quả: Kết quả được giới thiệu trong bảng 4.17.
Bảng 4.17. Hàm lượng Alcaloid trong DHC đắng chiết cồn/nước 50/50
Mẫu
1 2 3 TB
Dược liệu (g)
32,34 33,58 35,57 33,83
Hàm ẩm %
13,37 13,37 13,37 13,37
Alcaloid (g)
1,03 0,97 0,94 0,98
Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối)
3,68 3,36 3,06 3,37
4.4.5.4. Hàm lượng Flavonoid trong DHC đắng chiết cồn/nước 50/50
56
Xác định hàm lượng Flavonoid của dược liệu DHC đắng tan trong cồn 50o được thực hiện như đối với cồn 30o. Hàm lượng Flavonoid của dược liệu DHC đắng tan trong cồn 50o được giới thiệu trong bảng 4.18.
Bảng 4.18. Hàm lượng Flavonoid trong DHC đắng chiết cồn/nước 50/50
Mẫu Dược liệu (g)
1 30,46
2 30,25
3 30,57
TB 30,43
Hàm ẩm %
13,67 13,67 13,67 13,67
Flavonoid(g) Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối)
0,41 1,57 0,43 1,64
0,41 1,57
0,42 1,59
4.4.5.5. Hàm lượng Lignan trong DHC đắng chiết cồn/nước 50/50 Thực nghiệm: tuơng tự như đã ghi trên đây
Kết quả: Kết quả thực nghiệm được giới thiệu trong bảng 4.19.
Bảng 4.19. Hàm lượng Lignan trong DHC đắng chiết cồn/nước 50/50
Mẫu Dược liệu (g)
1 40,43
2 30,35
3 30,56
TB 33,78
Hàm ẩm %
13,25 13,25 13,25 13,25
Lignan (g)
0,46 0,32 0,29 0,36
Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối)
1,32 1,22 1,11 1,22
4.4.6. Chiết DHC đắng bng cồn 94o trong PTN [12,25] 4.4.6.1. Dịch chiết DHC đắng bng cồn 94o
57
Cách thức thực hiện như với dịch chiết nước, mục 4.4.3.1.
4.4.6.2. Hàm lượng chất tan từ DHC đắng chiết cồn 94o
Hàm lượng chât tan trong cồn 94o, hiệu suất chiết, được ghi trong bảng 4.20. Bảng 4.20. Lượng chất tan từ DHC đắng thu được bằng chiết cồn 94o
Mẫu
1 2 3 TB
DHC đắng (g) 30,55
31,24 30,47 30,75
Hàm ẩm % 13,53 13,53 13,53 13,53
Cao đặc (g) 6,22 7,13 6,22 6,52
Hàm ẩm (%)
14,53 14,71 14,49 14,56
Tỉ lệ (%) (khô tuyệt đối) 23,56 26,38 23,60
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links