Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết Nối
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh lao 3
1.2. Tình hình bệnh lao trên thế giới và ở Việt Nam 3
1.3. Đặc điểm của bệnh lao và đặc điểm của vi khuẩn lao 8
1.4. Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn lao và bệnh lao 16
1.4.1. Kỹ thuật soi kính trực tiếp 16
1.4.2. Kỹ thuật nuôi cấy 17
1.4.3. Kỹ thuật PCR 17
1.4.4. Kỹ thuật RFLP 17
1.4.5. Phương pháp ELISA
1.4.6. Miễn dịch tế bào
17
18
1.4.7. Miễn dịch dịch thể 18
1.5. Phương pháp PCR và các ứng dụng trong y học 19
1.5.1. Nguyên lý của kỹ thuật PCR 19
1.5.2. Thành phần phản ứng 19
1.5.3. Các ứng dụng của kỹ thuật PCR trong y học 20
1.5.4. Sự đa dạng trong quy trình kỹ thuật và trình tự nucleotide đặc hiệu
được sử dụng để phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis
22Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ii
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1. Đối tượng nghiên cứu 23
2.2. công cụ và thiết bị xét nghiệm 23
2.3. Hóa chất xét nghiệm 23
2.4. Quy trình nghiên cứu 24
2.5. Phương pháp và kĩ thuật nghiên cứu 25
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33
3.1 Kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong các
mẫu bệnh phẩm
33
3.1.1. Kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong bệnh
phẩm đờm
33
3.1.2. Kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong bệnh
phẩm dịch màng phổi
35
3.2. Hiệu quả của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện nhanh vi khuẩn lao
Mycobacterium tuberculosis
37
3.2.1. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong đờm 38
3.2.2. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong
dịch màng phổi
40
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
PHỤ LỤC
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiSố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Viết đầy đủ
AFB Acid Fast Bacilli
AIDS Acquired Immuno Deficiency Syndrome
BK Bacille de Kock
Bp Base pair
CTCLQG Chương trình chống lao quốc gia
DRPQ Dịch rửa phế quản
EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
GTDBDT Giá trị dự báo dương tính
GTDBAT Giá trị dự báo âm tính
HIV Human Immunodeficiency Virus
IgG Immuno globin G
IS6110 Insert Sequence 6110
PCR Polymerase Chain Reaction
Se Sensitivity (độ nhạy)
Sp Specificity (độ đặc hiệu)
TCYTTG Tổ chức Y tế thế giới
WHO World Health OrganizationSố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
iv
DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU Trang
Bảng 1.1. Ước tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực 5
Bảng 1.2. Số liệu ước tính bệnh lao của nước ta hàng năm 7
Bảng 2.1. Phân loại kết quả nhuộm soi 27
Bảng 2.2. Phân loại kết quả nuôi cấy 28
Bảng 2.3. Các thành phần phản ứng PCR 30
Bảng 3.1. Kết quả nhuộm soi phát hiện vi khuẩn AFB trong đờm 33
Bảng 3.2. Kết quả nuôi cấy phát hiện vi khuẩn Mycobacterium tubercuolosis
trong đờm
33
Bảng 3.3. Kết quả PCR phát hiện vi khuẩn Mycobacterium tubercuolosis
trong đờm
34
Bảng 3.4.. Kết quả nhuộm soi phát hiện vi khuẩn AFB trong dịch màng phổi 35
Bảng 3.5. Kết quả nuôi cấy phát hiện vi khuẩn Mycobacterium tubercuolosis
trong dịch màng phổi
35
Bảng 3.6. Kết quả PCR phát hiện vi khuẩn Mycobacterium tubercuolosis
trong dịch màng phổi
36
Bảng 3.7. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis
trong đờm bằng nhuộm soi so với nuôi cấy
38
Bảng 3.8. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis
trong đờm bằng PCR so với nuôi cấy
39
Bảng 3.9. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis
trong dịch màng phổi bằng nhuộm soi so với nuôi cấy
40
Bảng 3.10. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis
trong dịch màng phổi bằng PCR so với nuôi cấy
41
Bảng 3.11. So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium
tubercuolosis trong đờm giữa phương pháp nhuộm soi và PCR
42
Bảng 3.12. So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium
tubercuolosis trong dịch màng phổi giữa phương pháp nhuộm soi và PCR
43
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiSố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
v
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang
Hình 1.1. Vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis soi dưới kính hiển vi 14
Hình 1.2. Khuẩn lạc vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy 15
Hình 1.3. Cấu trúc thành vi khuẩn lao 15
Hình 2.1. Quy trình nghiên cứu 24
Hình .2.2. Sơ đồ chu trình nhiệt phản ứng PCR 30
Hình 3.1. So sánh kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium
tubercuolosis trong đờm bằng 3 phương pháp
34
Hình 3.2. So sánh kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium
tubercuolosis trong dịch màng phổi bằng 3 phương pháp
36
Hình 3.3. So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium
tubercuolosis trong đờm giữa phương pháp nhuộm soi và PCR
42
Hình 3.4. So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium
tubercuolosis trong dịch màng phổi giữa phương pháp nhuộm soi và PCR
43
Hình 3.5. Hình ảnh soi trên kính hiển vi quang học trực khuẩn lao AFB
nhuộm bằng phương pháp Ziehl-Neelsen
44
Hình 3.6. Đặc điểm phát triển của vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy
Ogawa
45
Hình 3.7. Điện di đồ DNA trên gel agarose 1,0% 45Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
MỞ ĐẦU
Lao là một bệnh nhiễm khuẩn phổ biến ở người, số người mắc lao trong cộng
đồng ngày càng tăng. Theo Tổ chức Y tế thế giới, năm 1994 có khoảng 1/3 dân số
thế giới bị nhiễm lao. Mỗi năm có 30 triệu người nhiễm lao, mỗi giây có thêm 1
người nhiễm lao. Bệnh lao là bệnh gây tử vong hàng đầu ở người lớn, mỗi năm có 3
triệu người chết vì lao, đến năm 2020 có thêm 1 tỷ người nhiễm lao trong đó có
khoảng 70 triệu người chết vì lao mà chủ yếu là lao phổi. Bệnh lao chủ yếu phát
triển ở những nước nghèo, các nước đang phát triển, khoảng 95% số bệnh nhân lao
và 98% số người chết do lao ở những nước có thu nhập vừa và thấp [8, 9, 10, 43].
Ở các nước đang phát triển, bệnh lao vẫn còn tồn tại trong cộng đồng do rất
nhiều yếu tố: sự bùng nổ của đại dịch HIV/AIDS, tăng dân số không kìm hãm được,
do sự phân cực, phân hóa giàu nghèo, hoạt động chưa hiệu quả của các chương trình
phòng chống lao quốc gia. Việt Nam đứng thứ 12 trong số 22 nước có số bệnh nhân
lao cao trên toàn cầu (WHO, 2008). Trong khu vưc Tây-Thái Bình Dương, Việt
Nam đứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philippinnes về số lượng bệnh nhân lao lưu
hành cũng như bệnh nhân lao xuất hiện thêm hàng năm.
Để làm giảm tỷ lệ mắc bệnh cũng như tỷ lệ tử vong do bệnh lao, một trong
những biện pháp mà Tổ chức Y tế thế giới ưu tiên hàng đầu là đẩy mạnh việc phát
hiện sớm các trường hợp mắc lao, điều trị kịp thời để loại bỏ nguồn lây, hạn chế tối
đa sự lây nhiễm trong cộng đồng.
Bệnh lao là bệnh nhiễm khuẩn, tác nhân gây bệnh là trực khuẩn
Mycobacterium tuberculosis. Phát hiện và chẩn đoán lao quan trọng nhất chủ yếu
dựa vào việc phát hiện trực khuẩn lao trong cơ thể hay trong chất xuất tiết của
người bị bệnh lao. Tìm thấy trực khuẩn lao được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong
việc chẩn đoán bệnh lao. Hiện nay có một số phương pháp giúp chẩn đoán xác định
hay hỗ trợ chẩn đoán xác định vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây bệnh lao
như: nhuộm soi trực tiếp, nuôi cấy phân lập, tiêm truyền động vật cảm nhiễm, test
tuberculin, ELISA,… [13, 23].
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiSố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
Ở Việt Nam, hiện nay tại hầu hết các bệnh viện, việc chẩn đoán bệnh lao vẫn
chủ yếu dựa vào phương pháp nhuộm soi bệnh phẩm tìm vi khuẩn lao AFB. Một số
bệnh viện chuyên khoa lao và bệnh phổi, thường là ở tuyến trung ương có điều kiện
có thể thực hiện thêm phương pháp nuôi cấy phân lập. Tuy nhiên những phương
pháp này ngoài ưu điểm vẫn còn một số hạn chế: Phương pháp nhuộm soi trực tiếp,
tuy đơn giản, dễ thực hiện, nhưng hiệu quả thấp, độ nhạy không cao, ngưỡng phát
hiện yêu cầu ≥103 vi khuẩn/ml. Còn phương pháp nuôi cấy, phân lập tuy có độ đặc
hiệu cao nhưng lại cho kết quả chậm sau 4-8 tuần. Do đó, việc có thêm một phương
pháp phát hiện nhanh vi khuẩn lao, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao sẽ đáp ứng được
yêu cầu của thực tế, khắc phục được một số hạn chế còn tồn tại của những phương
pháp chẩn đoán vi khuẩn lao thường dùng hiện nay.
PCR là phản ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm, cho phép khuếch đại một
đoạn DNA đích lên hàng triệu bản sao trong thời gian ngắn. PCR đã được ứng dụng
rộng rãi trong y sinh học, đặc biệt trong chẩn đoán nguyên nhân một số bệnh nhiễm
trùng truyền nhiễm, nhiều nghiên cứu cho thấy đây là kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc
hiệu cao trong chẩn đoán.
Ứng dụng và phát triển kỹ thuật PCR giúp chẩn đoán nhanh và chính xác vi
khuẩn gây bệnh lao sẽ giải quyết được yêu cầu cấp bách trong công tác phát hiện và
điều trị bệnh lao, góp phần khống chế và đẩy lùi dần bệnh lao trong cộng đồng. Từ
yêu cầu thực tế đó chúng tui tiến hành đề tài: “Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật
PCR phát hiện trực tiếp Mycobacterium tuberculosis trong mẫu bệnh phẩm”.
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Phát hiện nhanh vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong các mẫu bệnh
phẩm thu nhận từ những bệnh nhân nghi mắc lao phổi và tràn dịch màng phổi do
lao bằng kỹ thuật PCR.
2. Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện nhanh vi khuẩn lao
Mycobacterium tuberculosis.Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh lao
Lao là một trong những bệnh được ghi nhận sớm nhất trong lịch sử y học.
Bệnh lao được phát hiên trước Công nguyên ở Ấn Độ, Ai Cập, Hy Lạp và các nước
vùng Trung Á. Thời kỳ này bệnh lao được xếp lẫn với một số bệnh khác, đặc biệt là
các bệnh ở phổi. Trong một thời gian dài, người ta quan niệm đây là bệnh không
chữa được và là bệnh di truyền [2, 3, 4].
Năm 1882, Robert Kock tìm ra nguyên nhân gây bệnh lao là trực khuẩn lao,
ông được giải thưởng Nobel y học năm 1905 và sau đó trực khuẩn lao được mang
tên nhà bác học R.Koch (trực khuẩn BK-Bacille de Koch) [16, 27, 28].
Từ đầu thế kỷ XX, xuất hiện nhiều công trình về dị ứng và phòng bệnh lao.
Năm 1907, Von Pirquet áp dụng phản ứng da để xác định tình trạng nhiễm lao.
Năm 1908, Mantoux dùng tuberculin tiêm trong da để phát hiện dị ứng lao (nay gọi
là phản ứng Mantoux). Cũng năm 1908, Calmette và Guérin bắt đầu nghiên cứu tìm
vacxin BCG (Bacille Calmette Guérin) được sử dụng phòng bệnh lao trên người
[14].
Thời kỳ đầu, điều trị lao gặp nhiều khó khăn, một số phương pháp được áp
dụng điều trị như dinh dưỡng, bơm hơi màng phổi, màng bụng, phẫu thuật thành
ngực hay cắt bỏ tổn thương. Tiếp sau đó, các thuốc điều trị lao như Rimifon,
Streptomycine, Rifampicin, Pyrazinamid, đã lần lượt được tìm ra. Hội nghị chống
lao quốc tế lần thứ 23 ở Mexico (1975) nêu 12 loại thuốc đặc hiệu điều trị bệnh lao.
Những thành tựu y học đã đạt được mở ra thời kỳ phòng chống và tiêu diệt bệnh lao
trên quy mô toàn cầu.
1.2. Tình hình bệnh lao trên thế giới và ở Việt Nam
1.2.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân
số thế giới). Theo số liệu công bố của Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2004), ước
tính trong năm 2003 có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và 2 triệu người
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiSố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
chết do lao. Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các
nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao
động. Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh
nặng bệnh lao cao.
Đến năm 2008, theo ước tính của WHO thì tỷ lệ bệnh nhân lao lưu hành là
11,1 triệu ca (tương ứng với tỷ lệ lưu hành là 164 ca/100.000 dân); tỷ lệ các trường
hợp mới nhiễm ước tính là 9,4 triệu ca (tương ứng với tỷ lệ mắc mới 139
ca/100.000 dân) cao hơn so với năm 2007 (9,3 triệu ca); trong số đó có 12 trong
15 nước có gánh nặng cao về lao nằm ở châu Phi (nơi mà tỷ lệ mắc lao ước tính
khoảng 363 ca/100.000 dân). Cũng trong năm này số liệu cho thấy có 1,3 triệu ca
tử vong do lao (tương đương 20 ca tử vong/100.000 dân) bao gồm cả lao đồng
nhiễm HIV, trong đó nữ chiếm 0,5 triệu [2, 8, 9, 10, 12].
Hiện tại, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng tỷ lệ phát
hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao
không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo ước tính của
WHO, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người).
Theo WHO, phân bố của bệnh lao theo khu vực như sau: Châu Á 55%, châu
Phi 30%, Trung Đông 7%, châu Âu 5%, châu Mĩ 3% .
Mức độ nặng nề của bệnh lao đã ảnh hưởng tới thu nhập quốc dân và chỉ số
phát triển con người của các quốc gia. Các nghiên cứu về kinh tế y tế cho thấy,
mỗi bệnh nhân lao sẽ mất trung bình 3-4 tháng lao động, làm giảm 20-30% thu
nhập bình quân của gia đình. Những gia đình có người chết sớm vì bệnh lao có thể
sẽ mất tới 15 năm thu nhập.[43, 44, 45].Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
Bảng 1.1. Ước tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực (WHO) [43, 46].
Khu vực Số BN (nghìn) Tỷ lệ/100 000 Tử vong do lao (bao
gồm cả nhiễm HIV)
Các thể AFB
(+)
Các thể AFB
(+)
SL
(nghìn)
TL/100000
Châu Phi 2354 (26%) 1000 350 149 556 83
Châu Mỹ 370 (4%) 165 43 19 53 6
Trung Đông 622 (7%) 279 124 55 143 28
Châu Âu 472 (5%) 211 54 24 73 8
Đông nam
Châu Á
2890 (33%) 1294 182 81 625 39
Tây Thái
Bình Dƣơng
2090 (24%) 939 122 55 373 22
Toàn cầu 8797 (100%) 3887 141 63 1823 29
1.2.2. Bệnh lao và HIV/AIDS
Theo WHO đến cuối năm 2002, trên thế giới có 42 triệu người nhiễm HIV,
trong đó 50% đồng nhiễm lao.
HIV là yếu tố nguy cơ làm cho người nhiễm lao phát triển thành bệnh lao,
nguy cơ đó cao gấp 30 lần so với người HIV (-). Đại dịch HIV/AIDS đã làm tăng
ít nhất 30% số bệnh nhân lao trên loàn cầu, bệnh lao là nguyên nhân gây tử vong
cho 1/3 số bệnh nhân HIV trên toàn cầu, là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu cho
những người HIV (+). Như vậy, đại dịch HIV đang làm tăng thêm gánh nặng đồng
thời làm giảm hiệu quả của Chương trình chống lao.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong các mẫu
bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm đờm của 67 bệnh nhân nghi mắc lao phổi được xét nghiệm:
- Phương pháp nhuộm soi: 46,27% dương tính
- Phương pháp nuôi cấy: 73,13% dương tính
- Phương pháp PCR: 70,15% dương tính
Mẫu bệnh phẩm dịch màng phổi của 34 bệnh nhân tràn dịch màng phổi nghi do lao
được xét nghiệm:
- Phương pháp nhuộm soi: 5,88% dương tính
- Phương pháp nuôi cấy: 26,47%dương tính
- Phương pháp PCR: 23,53%dương tính
2. Hiệu quả của phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn lao M. tuberculosis trong các
mẫu bệnh phẩm
Phương pháp nhuộm soi trực tiếp:
+ Mẫu bệnh phẩm đờm:
- Độ nhạy = 53,06%.
- Độ đặc hiệu = 72,22 %.
- Giá trị tiên đoán dương tính = 83,87%.
- Giá trị đoán âm tính = 36,11%
+ Mẫu bệnh phẩm dịch màng phổi:
- Độ nhạy = 11,11%.
- Độ đặc hiệu = 96,00 %.
- Giá trị tiên đoán dương tính = 50,00%.
- Giá trị đoán âm tính = 75,00%
Phương pháp PCR:
+ Mẫu bệnh phẩm đờm:
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
xem thêm
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis tại thành phố Cần Thơ
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh lao 3
1.2. Tình hình bệnh lao trên thế giới và ở Việt Nam 3
1.3. Đặc điểm của bệnh lao và đặc điểm của vi khuẩn lao 8
1.4. Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn lao và bệnh lao 16
1.4.1. Kỹ thuật soi kính trực tiếp 16
1.4.2. Kỹ thuật nuôi cấy 17
1.4.3. Kỹ thuật PCR 17
1.4.4. Kỹ thuật RFLP 17
1.4.5. Phương pháp ELISA
1.4.6. Miễn dịch tế bào
17
18
1.4.7. Miễn dịch dịch thể 18
1.5. Phương pháp PCR và các ứng dụng trong y học 19
1.5.1. Nguyên lý của kỹ thuật PCR 19
1.5.2. Thành phần phản ứng 19
1.5.3. Các ứng dụng của kỹ thuật PCR trong y học 20
1.5.4. Sự đa dạng trong quy trình kỹ thuật và trình tự nucleotide đặc hiệu
được sử dụng để phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis
22Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
You must be registered for see links
ii
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1. Đối tượng nghiên cứu 23
2.2. công cụ và thiết bị xét nghiệm 23
2.3. Hóa chất xét nghiệm 23
2.4. Quy trình nghiên cứu 24
2.5. Phương pháp và kĩ thuật nghiên cứu 25
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33
3.1 Kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong các
mẫu bệnh phẩm
33
3.1.1. Kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong bệnh
phẩm đờm
33
3.1.2. Kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong bệnh
phẩm dịch màng phổi
35
3.2. Hiệu quả của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện nhanh vi khuẩn lao
Mycobacterium tuberculosis
37
3.2.1. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong đờm 38
3.2.2. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong
dịch màng phổi
40
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
PHỤ LỤC
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiSố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
You must be registered for see links
iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Viết đầy đủ
AFB Acid Fast Bacilli
AIDS Acquired Immuno Deficiency Syndrome
BK Bacille de Kock
Bp Base pair
CTCLQG Chương trình chống lao quốc gia
DRPQ Dịch rửa phế quản
EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
GTDBDT Giá trị dự báo dương tính
GTDBAT Giá trị dự báo âm tính
HIV Human Immunodeficiency Virus
IgG Immuno globin G
IS6110 Insert Sequence 6110
PCR Polymerase Chain Reaction
Se Sensitivity (độ nhạy)
Sp Specificity (độ đặc hiệu)
TCYTTG Tổ chức Y tế thế giới
WHO World Health OrganizationSố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
You must be registered for see links
iv
DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU Trang
Bảng 1.1. Ước tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực 5
Bảng 1.2. Số liệu ước tính bệnh lao của nước ta hàng năm 7
Bảng 2.1. Phân loại kết quả nhuộm soi 27
Bảng 2.2. Phân loại kết quả nuôi cấy 28
Bảng 2.3. Các thành phần phản ứng PCR 30
Bảng 3.1. Kết quả nhuộm soi phát hiện vi khuẩn AFB trong đờm 33
Bảng 3.2. Kết quả nuôi cấy phát hiện vi khuẩn Mycobacterium tubercuolosis
trong đờm
33
Bảng 3.3. Kết quả PCR phát hiện vi khuẩn Mycobacterium tubercuolosis
trong đờm
34
Bảng 3.4.. Kết quả nhuộm soi phát hiện vi khuẩn AFB trong dịch màng phổi 35
Bảng 3.5. Kết quả nuôi cấy phát hiện vi khuẩn Mycobacterium tubercuolosis
trong dịch màng phổi
35
Bảng 3.6. Kết quả PCR phát hiện vi khuẩn Mycobacterium tubercuolosis
trong dịch màng phổi
36
Bảng 3.7. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis
trong đờm bằng nhuộm soi so với nuôi cấy
38
Bảng 3.8. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis
trong đờm bằng PCR so với nuôi cấy
39
Bảng 3.9. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis
trong dịch màng phổi bằng nhuộm soi so với nuôi cấy
40
Bảng 3.10. Hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis
trong dịch màng phổi bằng PCR so với nuôi cấy
41
Bảng 3.11. So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium
tubercuolosis trong đờm giữa phương pháp nhuộm soi và PCR
42
Bảng 3.12. So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium
tubercuolosis trong dịch màng phổi giữa phương pháp nhuộm soi và PCR
43
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiSố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
You must be registered for see links
v
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang
Hình 1.1. Vi khuẩn lao Mycobacterium tubercuolosis soi dưới kính hiển vi 14
Hình 1.2. Khuẩn lạc vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy 15
Hình 1.3. Cấu trúc thành vi khuẩn lao 15
Hình 2.1. Quy trình nghiên cứu 24
Hình .2.2. Sơ đồ chu trình nhiệt phản ứng PCR 30
Hình 3.1. So sánh kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium
tubercuolosis trong đờm bằng 3 phương pháp
34
Hình 3.2. So sánh kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium
tubercuolosis trong dịch màng phổi bằng 3 phương pháp
36
Hình 3.3. So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium
tubercuolosis trong đờm giữa phương pháp nhuộm soi và PCR
42
Hình 3.4. So sánh hiệu quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium
tubercuolosis trong dịch màng phổi giữa phương pháp nhuộm soi và PCR
43
Hình 3.5. Hình ảnh soi trên kính hiển vi quang học trực khuẩn lao AFB
nhuộm bằng phương pháp Ziehl-Neelsen
44
Hình 3.6. Đặc điểm phát triển của vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy
Ogawa
45
Hình 3.7. Điện di đồ DNA trên gel agarose 1,0% 45Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
You must be registered for see links
1
MỞ ĐẦU
Lao là một bệnh nhiễm khuẩn phổ biến ở người, số người mắc lao trong cộng
đồng ngày càng tăng. Theo Tổ chức Y tế thế giới, năm 1994 có khoảng 1/3 dân số
thế giới bị nhiễm lao. Mỗi năm có 30 triệu người nhiễm lao, mỗi giây có thêm 1
người nhiễm lao. Bệnh lao là bệnh gây tử vong hàng đầu ở người lớn, mỗi năm có 3
triệu người chết vì lao, đến năm 2020 có thêm 1 tỷ người nhiễm lao trong đó có
khoảng 70 triệu người chết vì lao mà chủ yếu là lao phổi. Bệnh lao chủ yếu phát
triển ở những nước nghèo, các nước đang phát triển, khoảng 95% số bệnh nhân lao
và 98% số người chết do lao ở những nước có thu nhập vừa và thấp [8, 9, 10, 43].
Ở các nước đang phát triển, bệnh lao vẫn còn tồn tại trong cộng đồng do rất
nhiều yếu tố: sự bùng nổ của đại dịch HIV/AIDS, tăng dân số không kìm hãm được,
do sự phân cực, phân hóa giàu nghèo, hoạt động chưa hiệu quả của các chương trình
phòng chống lao quốc gia. Việt Nam đứng thứ 12 trong số 22 nước có số bệnh nhân
lao cao trên toàn cầu (WHO, 2008). Trong khu vưc Tây-Thái Bình Dương, Việt
Nam đứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philippinnes về số lượng bệnh nhân lao lưu
hành cũng như bệnh nhân lao xuất hiện thêm hàng năm.
Để làm giảm tỷ lệ mắc bệnh cũng như tỷ lệ tử vong do bệnh lao, một trong
những biện pháp mà Tổ chức Y tế thế giới ưu tiên hàng đầu là đẩy mạnh việc phát
hiện sớm các trường hợp mắc lao, điều trị kịp thời để loại bỏ nguồn lây, hạn chế tối
đa sự lây nhiễm trong cộng đồng.
Bệnh lao là bệnh nhiễm khuẩn, tác nhân gây bệnh là trực khuẩn
Mycobacterium tuberculosis. Phát hiện và chẩn đoán lao quan trọng nhất chủ yếu
dựa vào việc phát hiện trực khuẩn lao trong cơ thể hay trong chất xuất tiết của
người bị bệnh lao. Tìm thấy trực khuẩn lao được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong
việc chẩn đoán bệnh lao. Hiện nay có một số phương pháp giúp chẩn đoán xác định
hay hỗ trợ chẩn đoán xác định vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây bệnh lao
như: nhuộm soi trực tiếp, nuôi cấy phân lập, tiêm truyền động vật cảm nhiễm, test
tuberculin, ELISA,… [13, 23].
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiSố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
You must be registered for see links
2
Ở Việt Nam, hiện nay tại hầu hết các bệnh viện, việc chẩn đoán bệnh lao vẫn
chủ yếu dựa vào phương pháp nhuộm soi bệnh phẩm tìm vi khuẩn lao AFB. Một số
bệnh viện chuyên khoa lao và bệnh phổi, thường là ở tuyến trung ương có điều kiện
có thể thực hiện thêm phương pháp nuôi cấy phân lập. Tuy nhiên những phương
pháp này ngoài ưu điểm vẫn còn một số hạn chế: Phương pháp nhuộm soi trực tiếp,
tuy đơn giản, dễ thực hiện, nhưng hiệu quả thấp, độ nhạy không cao, ngưỡng phát
hiện yêu cầu ≥103 vi khuẩn/ml. Còn phương pháp nuôi cấy, phân lập tuy có độ đặc
hiệu cao nhưng lại cho kết quả chậm sau 4-8 tuần. Do đó, việc có thêm một phương
pháp phát hiện nhanh vi khuẩn lao, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao sẽ đáp ứng được
yêu cầu của thực tế, khắc phục được một số hạn chế còn tồn tại của những phương
pháp chẩn đoán vi khuẩn lao thường dùng hiện nay.
PCR là phản ứng tổng hợp DNA trong ống nghiệm, cho phép khuếch đại một
đoạn DNA đích lên hàng triệu bản sao trong thời gian ngắn. PCR đã được ứng dụng
rộng rãi trong y sinh học, đặc biệt trong chẩn đoán nguyên nhân một số bệnh nhiễm
trùng truyền nhiễm, nhiều nghiên cứu cho thấy đây là kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc
hiệu cao trong chẩn đoán.
Ứng dụng và phát triển kỹ thuật PCR giúp chẩn đoán nhanh và chính xác vi
khuẩn gây bệnh lao sẽ giải quyết được yêu cầu cấp bách trong công tác phát hiện và
điều trị bệnh lao, góp phần khống chế và đẩy lùi dần bệnh lao trong cộng đồng. Từ
yêu cầu thực tế đó chúng tui tiến hành đề tài: “Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật
PCR phát hiện trực tiếp Mycobacterium tuberculosis trong mẫu bệnh phẩm”.
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Phát hiện nhanh vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong các mẫu bệnh
phẩm thu nhận từ những bệnh nhân nghi mắc lao phổi và tràn dịch màng phổi do
lao bằng kỹ thuật PCR.
2. Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện nhanh vi khuẩn lao
Mycobacterium tuberculosis.Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
You must be registered for see links
3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh lao
Lao là một trong những bệnh được ghi nhận sớm nhất trong lịch sử y học.
Bệnh lao được phát hiên trước Công nguyên ở Ấn Độ, Ai Cập, Hy Lạp và các nước
vùng Trung Á. Thời kỳ này bệnh lao được xếp lẫn với một số bệnh khác, đặc biệt là
các bệnh ở phổi. Trong một thời gian dài, người ta quan niệm đây là bệnh không
chữa được và là bệnh di truyền [2, 3, 4].
Năm 1882, Robert Kock tìm ra nguyên nhân gây bệnh lao là trực khuẩn lao,
ông được giải thưởng Nobel y học năm 1905 và sau đó trực khuẩn lao được mang
tên nhà bác học R.Koch (trực khuẩn BK-Bacille de Koch) [16, 27, 28].
Từ đầu thế kỷ XX, xuất hiện nhiều công trình về dị ứng và phòng bệnh lao.
Năm 1907, Von Pirquet áp dụng phản ứng da để xác định tình trạng nhiễm lao.
Năm 1908, Mantoux dùng tuberculin tiêm trong da để phát hiện dị ứng lao (nay gọi
là phản ứng Mantoux). Cũng năm 1908, Calmette và Guérin bắt đầu nghiên cứu tìm
vacxin BCG (Bacille Calmette Guérin) được sử dụng phòng bệnh lao trên người
[14].
Thời kỳ đầu, điều trị lao gặp nhiều khó khăn, một số phương pháp được áp
dụng điều trị như dinh dưỡng, bơm hơi màng phổi, màng bụng, phẫu thuật thành
ngực hay cắt bỏ tổn thương. Tiếp sau đó, các thuốc điều trị lao như Rimifon,
Streptomycine, Rifampicin, Pyrazinamid, đã lần lượt được tìm ra. Hội nghị chống
lao quốc tế lần thứ 23 ở Mexico (1975) nêu 12 loại thuốc đặc hiệu điều trị bệnh lao.
Những thành tựu y học đã đạt được mở ra thời kỳ phòng chống và tiêu diệt bệnh lao
trên quy mô toàn cầu.
1.2. Tình hình bệnh lao trên thế giới và ở Việt Nam
1.2.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân
số thế giới). Theo số liệu công bố của Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2004), ước
tính trong năm 2003 có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và 2 triệu người
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiSố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
You must be registered for see links
4
chết do lao. Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các
nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao
động. Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh
nặng bệnh lao cao.
Đến năm 2008, theo ước tính của WHO thì tỷ lệ bệnh nhân lao lưu hành là
11,1 triệu ca (tương ứng với tỷ lệ lưu hành là 164 ca/100.000 dân); tỷ lệ các trường
hợp mới nhiễm ước tính là 9,4 triệu ca (tương ứng với tỷ lệ mắc mới 139
ca/100.000 dân) cao hơn so với năm 2007 (9,3 triệu ca); trong số đó có 12 trong
15 nước có gánh nặng cao về lao nằm ở châu Phi (nơi mà tỷ lệ mắc lao ước tính
khoảng 363 ca/100.000 dân). Cũng trong năm này số liệu cho thấy có 1,3 triệu ca
tử vong do lao (tương đương 20 ca tử vong/100.000 dân) bao gồm cả lao đồng
nhiễm HIV, trong đó nữ chiếm 0,5 triệu [2, 8, 9, 10, 12].
Hiện tại, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng tỷ lệ phát
hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao
không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo ước tính của
WHO, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người).
Theo WHO, phân bố của bệnh lao theo khu vực như sau: Châu Á 55%, châu
Phi 30%, Trung Đông 7%, châu Âu 5%, châu Mĩ 3% .
Mức độ nặng nề của bệnh lao đã ảnh hưởng tới thu nhập quốc dân và chỉ số
phát triển con người của các quốc gia. Các nghiên cứu về kinh tế y tế cho thấy,
mỗi bệnh nhân lao sẽ mất trung bình 3-4 tháng lao động, làm giảm 20-30% thu
nhập bình quân của gia đình. Những gia đình có người chết sớm vì bệnh lao có thể
sẽ mất tới 15 năm thu nhập.[43, 44, 45].Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
You must be registered for see links
5
Bảng 1.1. Ước tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực (WHO) [43, 46].
Khu vực Số BN (nghìn) Tỷ lệ/100 000 Tử vong do lao (bao
gồm cả nhiễm HIV)
Các thể AFB
(+)
Các thể AFB
(+)
SL
(nghìn)
TL/100000
Châu Phi 2354 (26%) 1000 350 149 556 83
Châu Mỹ 370 (4%) 165 43 19 53 6
Trung Đông 622 (7%) 279 124 55 143 28
Châu Âu 472 (5%) 211 54 24 73 8
Đông nam
Châu Á
2890 (33%) 1294 182 81 625 39
Tây Thái
Bình Dƣơng
2090 (24%) 939 122 55 373 22
Toàn cầu 8797 (100%) 3887 141 63 1823 29
1.2.2. Bệnh lao và HIV/AIDS
Theo WHO đến cuối năm 2002, trên thế giới có 42 triệu người nhiễm HIV,
trong đó 50% đồng nhiễm lao.
HIV là yếu tố nguy cơ làm cho người nhiễm lao phát triển thành bệnh lao,
nguy cơ đó cao gấp 30 lần so với người HIV (-). Đại dịch HIV/AIDS đã làm tăng
ít nhất 30% số bệnh nhân lao trên loàn cầu, bệnh lao là nguyên nhân gây tử vong
cho 1/3 số bệnh nhân HIV trên toàn cầu, là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu cho
những người HIV (+). Như vậy, đại dịch HIV đang làm tăng thêm gánh nặng đồng
thời làm giảm hiệu quả của Chương trình chống lao.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Kết quả phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis trong các mẫu
bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm đờm của 67 bệnh nhân nghi mắc lao phổi được xét nghiệm:
- Phương pháp nhuộm soi: 46,27% dương tính
- Phương pháp nuôi cấy: 73,13% dương tính
- Phương pháp PCR: 70,15% dương tính
Mẫu bệnh phẩm dịch màng phổi của 34 bệnh nhân tràn dịch màng phổi nghi do lao
được xét nghiệm:
- Phương pháp nhuộm soi: 5,88% dương tính
- Phương pháp nuôi cấy: 26,47%dương tính
- Phương pháp PCR: 23,53%dương tính
2. Hiệu quả của phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn lao M. tuberculosis trong các
mẫu bệnh phẩm
Phương pháp nhuộm soi trực tiếp:
+ Mẫu bệnh phẩm đờm:
- Độ nhạy = 53,06%.
- Độ đặc hiệu = 72,22 %.
- Giá trị tiên đoán dương tính = 83,87%.
- Giá trị đoán âm tính = 36,11%
+ Mẫu bệnh phẩm dịch màng phổi:
- Độ nhạy = 11,11%.
- Độ đặc hiệu = 96,00 %.
- Giá trị tiên đoán dương tính = 50,00%.
- Giá trị đoán âm tính = 75,00%
Phương pháp PCR:
+ Mẫu bệnh phẩm đờm:
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
xem thêm
Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis tại thành phố Cần Thơ