Download Luận văn Tách dòng và xác định trình tự nucleotit một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV) tại Việt Nam
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN . 2
MỤC LỤC . 3
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT . 5
DANH MỤC CÁC BẢNG . 7
MỞ ĐẦU . 9
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 11
1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM . 11
1.1.1. Thế giới . 11
1.1.2. Việt Nam . 12
1.2. TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL . 13
1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA . 14
1.3.1. Virut vàng lùn lúa (RGSV) . 14
1.3.2. Các loại virut khác . 16
1.3.2.1. Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV). 16
1.3.2.2. Virut tungro hình cầu (RTSV) . 17
1.3.2.3. Virut tungro hình nhộng (RTBV) . 18
1.4. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RẦY NÂU – MÔI GIỚI CHỦ YẾU
TRUYỀN BỆNH VL&LXL . 19
1.4.1. Đặc điểm hình thái . 19
1.4.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và gây hại . 19
1.5. PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL . 20
1.6. MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG
NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUT . 21
1.6.1. Một số enzym sử dụng trong sinh học phân tử . 21
1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR . 22
1.6.3. Kỹ thuật PCR . 23
1.6.4. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli . 24
1.6.5. Kỹ thuật tách dòng gen . 24
1.6.6. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) . 25
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 26
2.1. VẬT LIỆU . 26
2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM . 27
2.2.1. Hóa chất . 27
2.2.2. Thiết bị . 27
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu . 27
2.3. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 27
2.3.1. Thu mẫu thí nghiệm . 27
2.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu . 28
2.3.3. Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa . 28
2.3.4. Phản ứng RT-PCR . 29
2.3.5. Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) . 29
2.3.6. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. 30
2.3.7. Colony-PCR. 31
2.3.8. Tách chiết plasmit . 32
2.3.9. Cắt gen bằng enzym giới hạn. 32
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . 34
3.1. THIẾT KẾ MỒI. 34
3.2. TÁCH DÕNG CÁC ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV . 34
3.2.1. RT-PCR . 34
3.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α . 37
3.2.3. Chọn lọc plasmit tái tổ hợp bằng colony-PCR . 37
3.2.4. Tách plasmit và cắt kiểm tra sự có mặt của gen . 39
3.3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG
GENOME CỦA RGSV . 40
3.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN
VÀ BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TưƠNG ỨNG TRÊN GENBANK. 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 46
CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ . 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 48
PHỤ LỤC . 53
Để tải bản DOC Đầy Đủ xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
22
Enzym DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5’-3’. phần
lớn các DNA polymerase dùng một bản mẫu là DNA đề làm khuôn cho sự tổng hợp
(DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase). Một DNA polymerase
đặc biệt là enzym phiên mã ngƣợc (Reverse Transciptase) sử dụng khuôn là RNA
để tổng hợp DNA. Ngoài ra, còn có Terminal transferrase là một DNA polymerase
không tổng hợp mạch mới từ mạch khuôn mà chỉ thêm các nucleotit vào đầu của
một phân tử DNA có sẵn. Các DNA mồi, là một đoạn DNA hay RNA ngắn bắt cặp
bổ sung với phần đầu của mạch khuôn (đầu 3’), để từ đó các polymerase mới nối
dài tạo mạch bổ sung.
Enzym cắt giới hạn (RE) là các endonuclease có khả năng cắt DNA mạch đôi
một cách lặp lại ở những vị trí (trình tự) xác định. Do đặc tính cơ bản của các RE là
khả năng nhận biết và cắt một trình tự xác định trên phân tử DNA, dựa vào khả
năng này, ngƣời ta chia chúng làm ba loại: (1) Khi enzym nhận biết đƣợc trình tự,
nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000 – 5000 nucleotit và
giải phóng độ vài chục nucleotit; (2) Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí
đó; (3) Enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20
nucleotit. Trình tự nhận biết của RE loại 2: Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotit
đặc trƣng. Các trình tự này thƣờng bao gồm 4-8 nucleotit (thƣờng là 4 hay 6). Đối
với một số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số
nucleotit của trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotit khác. Đặc trƣng quan trọng
nhất của các trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palindromic, nghĩa là hai mạch
của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng đƣợc đọc theo cùng chiều 5’-3’. Nhƣ
vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch.
1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR
Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR) là sự kết hợp của hai phản
ứng phiên mã ngƣợc (Reverse Transcriptase) và PCR để nhân lên đƣợc đoạn gen
quan tâm từ RNA [3]. Kỹ thuật này gồm hai giai đoạn:
- Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất: Nguyên lý của phƣơng pháp này là sử dụng
enzym phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase) để tổng hợp sợi cDNA thứ nhất từ
RNA. Tùy theo mục đích của thí nghiệm mà các loại RNA đƣợc sử dụng là khác
nhau. Nếu muốn nhân một đoạn gen của sinh vật nhân chuẩn mà không muốn có
intron thì ngƣời ta thƣờng tổng hợp cDNA từ mRNA với mồi oligo(dT)s. Nếu là
sinh vật nhân sơ hay virrut ngƣời ta có thể tổng hợp cDNA từ RNA tổng số với
mồi ngẫu nhiên hay mồi đặc hiệu cho gen cần nhân. Khi mồi gắn bổ sung với sợi
RNA khuôn, enzym phiên mã ngƣợc sẽ xúc tác cho quá trình tổng hợp cDNA từ các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
23
nucleotit tự do có trong thành phần phản ứng ở một nhiệt độ thích hợp. Phản ứng
tổng hợp cDNA chỉ xảy ra trong một chu kỳ, theo lý thuyết sau khi kết thúc phản
ứng ta sẽ thu đƣợc lƣợng cDNA tƣơng ứng với lƣợng RNA khuôn ban đầu. Để tăng
hiệu quả của qua trình tổng hợp, lƣợng mồi đƣợc cho vào lớn hơn rất nhiều lƣợng
RNA khuôn và chất kìm hãm RNase cũng đƣợc đƣa vào để bảo vệ cho RNA khỏi bị
cắt bởi RNase.
Khuếch đại gen bằng PCR: Sử dụng cDNA làm khuôn để khuếch đại gen
quan tâm bằng phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu (gồm mồi xuôi và mồi
ngƣợc). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR đƣợc trình bày ở mục 1.6.3.
1.6.3. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction – chuỗi phản ứng trùng hợp)
đƣợc Karl Mullis và cộng sự mô tả đầu tiên vào năm 1985. Đây là kỹ thuật in vitro
tƣơng đối đơn giản, cho phép nhân một số lƣợng không giới hạn nguyên bản một
đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xúc tác của DNA
polymerase. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một đoạn DNA
mới từ mạch khuôn đều cần sự có mặt của những mồi đặc hiệu. Mồi là những đoạn
DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA
polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Quá trình nhân bản bằng enzym
này bao gồm 3 bƣớc đƣợc lặp lại nhiều lần:
1> Biến tính (denaturation): DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng
cách nâng cao nhiệt độ lên 94-95oC trong khoảng thời gian từ 0,5- 1 phút.
2> Lai (hybridization): Nhiệt độ đƣợc hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho
phép các mồi bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong
khoảng 40oC – 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 0,5- 1 phút.
3> Kéo dài (elongation): Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo
dài từ đoạn mồi. Hai phân tử DNA mới đƣợc tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ
hai đầu phân tử khuôn ban đầu. Thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Để tránh
hiện tƣợng bắt cặp không đặc thù, phản ứng thƣờng đƣợc thực hiện ở 72oC.
Loại polymerase dùng trong PCR là loại chịu nhiệt, ví dụ nhƣ Taq-
polymerase đƣợc tách triết từ vi khuẩn Thermus aquaticus, một loại vi khuẩn đƣợc
phân lập từ suối nƣớc nóng. Hiện nay, enzym này chủ yếu đƣợc tổng hợp theo con
đƣờng tái tổ hợp. Sau mỗi chu kỳ phản ứng lƣợng DNA cần nhân bản sẽ tăng gấp
đôi, với N sợi khuôn ban đầu sau n chu kỳ sẽ có N*2n sợi DNA đƣợc tạo ra. Ví dụ,
sau khoảng 20 chu kỳ, có khoảng 30 triệu bản đƣợc tạo ra từ một sợi khuôn ban đầu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
24
1.6.4. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli
Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn đƣợc Frederick Griffith mô tả vào năm
1928 trong thí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là “nguyên lý biến nạp”. Tuy
nhiên, không phải tất cả các vi khuẩn đều có thể biến nạp đƣợc một cách dễ dàng.
Để có thể biến nạp ở E.coli có hiệu quả, các tế bào cần trở nên khả biến
(competent). Để đạt đƣợc điều này, trƣớc khi biến nạp, ngƣời ta ngâm các tế bào
trong dung dịch CaCl2 lạnh. Việc biến nạp các tế bào khả biến đƣợc thực hiện bằng
cách trộn DNA plasmit tái tổ hợp với các tế bào, rồi ủ trong đá từ 20- 30 phút, sau
đó tạo một sốc nhiệt ngắn ở 420C trong khoảng 1- 1,5 phút, làm nhƣ vậy DNA sẽ
chui vào tế bào. Sau khi biến nạp, vi khuẩn đƣợc nuôi phục hồi trong môi trƣờng
LB lỏng ở 370C trong khoảng 60- 90 phút. Sau đó, các tế bào đƣợc đƣa lên môi
trƣờng chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmit tái tổ hợp. Trong quá trình biến
nạp, chỉ một phần rất nhỏ các tế bào khả biến đƣợc biến nạp. Mặc dù có nhƣợc điểm
rất lớn này, biến nạp vẫn là một kỹ thuật quan trọng, nó có thể tạo ra tới 109 các tế
bào biến nạp (tức cá thể biến nạp) khi đƣa 1µg DNA vào thí nghiệm. Trong thực tế,
với 1µg DNA ngƣời ta tạo ra đƣợc 106 đến 107 tế bào biến nạp.
1.6.5. Kỹ thuật tách dòng gen
Tách dòng gen là một công cụ hữu hiệu đƣợc sử dụng trong kỹ thuật di
truyền và là bƣớc khởi nguồn cho các kỹ thuật sau này. Mục đích của việc tách
dòng là nhằm thu đƣợc một lƣợng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm. Đầu tiên,
DNA ngoại lai đƣợc nối vào một vectơ nhằm tạo ra DNA tái tổ hợp. Vectơ sử d
Download miễn phí Luận văn Tách dòng và xác định trình tự nucleotit một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV) tại Việt Nam
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN . 2
MỤC LỤC . 3
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT . 5
DANH MỤC CÁC BẢNG . 7
MỞ ĐẦU . 9
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 11
1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM . 11
1.1.1. Thế giới . 11
1.1.2. Việt Nam . 12
1.2. TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL . 13
1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA . 14
1.3.1. Virut vàng lùn lúa (RGSV) . 14
1.3.2. Các loại virut khác . 16
1.3.2.1. Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV). 16
1.3.2.2. Virut tungro hình cầu (RTSV) . 17
1.3.2.3. Virut tungro hình nhộng (RTBV) . 18
1.4. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RẦY NÂU – MÔI GIỚI CHỦ YẾU
TRUYỀN BỆNH VL&LXL . 19
1.4.1. Đặc điểm hình thái . 19
1.4.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và gây hại . 19
1.5. PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL . 20
1.6. MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG
NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUT . 21
1.6.1. Một số enzym sử dụng trong sinh học phân tử . 21
1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR . 22
1.6.3. Kỹ thuật PCR . 23
1.6.4. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli . 24
1.6.5. Kỹ thuật tách dòng gen . 24
1.6.6. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) . 25
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 26
2.1. VẬT LIỆU . 26
2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM . 27
2.2.1. Hóa chất . 27
2.2.2. Thiết bị . 27
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu . 27
2.3. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 27
2.3.1. Thu mẫu thí nghiệm . 27
2.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu . 28
2.3.3. Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa . 28
2.3.4. Phản ứng RT-PCR . 29
2.3.5. Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) . 29
2.3.6. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. 30
2.3.7. Colony-PCR. 31
2.3.8. Tách chiết plasmit . 32
2.3.9. Cắt gen bằng enzym giới hạn. 32
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . 34
3.1. THIẾT KẾ MỒI. 34
3.2. TÁCH DÕNG CÁC ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV . 34
3.2.1. RT-PCR . 34
3.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α . 37
3.2.3. Chọn lọc plasmit tái tổ hợp bằng colony-PCR . 37
3.2.4. Tách plasmit và cắt kiểm tra sự có mặt của gen . 39
3.3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG
GENOME CỦA RGSV . 40
3.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN
VÀ BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TưƠNG ỨNG TRÊN GENBANK. 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 46
CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ . 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 48
PHỤ LỤC . 53
Để tải bản DOC Đầy Đủ xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Tóm tắt nội dung:
22
Enzym DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5’-3’. phần
lớn các DNA polymerase dùng một bản mẫu là DNA đề làm khuôn cho sự tổng hợp
(DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase). Một DNA polymerase
đặc biệt là enzym phiên mã ngƣợc (Reverse Transciptase) sử dụng khuôn là RNA
để tổng hợp DNA. Ngoài ra, còn có Terminal transferrase là một DNA polymerase
không tổng hợp mạch mới từ mạch khuôn mà chỉ thêm các nucleotit vào đầu của
một phân tử DNA có sẵn. Các DNA mồi, là một đoạn DNA hay RNA ngắn bắt cặp
bổ sung với phần đầu của mạch khuôn (đầu 3’), để từ đó các polymerase mới nối
dài tạo mạch bổ sung.
Enzym cắt giới hạn (RE) là các endonuclease có khả năng cắt DNA mạch đôi
một cách lặp lại ở những vị trí (trình tự) xác định. Do đặc tính cơ bản của các RE là
khả năng nhận biết và cắt một trình tự xác định trên phân tử DNA, dựa vào khả
năng này, ngƣời ta chia chúng làm ba loại: (1) Khi enzym nhận biết đƣợc trình tự,
nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000 – 5000 nucleotit và
giải phóng độ vài chục nucleotit; (2) Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí
đó; (3) Enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20
nucleotit. Trình tự nhận biết của RE loại 2: Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotit
đặc trƣng. Các trình tự này thƣờng bao gồm 4-8 nucleotit (thƣờng là 4 hay 6). Đối
với một số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số
nucleotit của trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotit khác. Đặc trƣng quan trọng
nhất của các trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palindromic, nghĩa là hai mạch
của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng đƣợc đọc theo cùng chiều 5’-3’. Nhƣ
vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch.
1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR
Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR) là sự kết hợp của hai phản
ứng phiên mã ngƣợc (Reverse Transcriptase) và PCR để nhân lên đƣợc đoạn gen
quan tâm từ RNA [3]. Kỹ thuật này gồm hai giai đoạn:
- Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất: Nguyên lý của phƣơng pháp này là sử dụng
enzym phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase) để tổng hợp sợi cDNA thứ nhất từ
RNA. Tùy theo mục đích của thí nghiệm mà các loại RNA đƣợc sử dụng là khác
nhau. Nếu muốn nhân một đoạn gen của sinh vật nhân chuẩn mà không muốn có
intron thì ngƣời ta thƣờng tổng hợp cDNA từ mRNA với mồi oligo(dT)s. Nếu là
sinh vật nhân sơ hay virrut ngƣời ta có thể tổng hợp cDNA từ RNA tổng số với
mồi ngẫu nhiên hay mồi đặc hiệu cho gen cần nhân. Khi mồi gắn bổ sung với sợi
RNA khuôn, enzym phiên mã ngƣợc sẽ xúc tác cho quá trình tổng hợp cDNA từ các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
23
nucleotit tự do có trong thành phần phản ứng ở một nhiệt độ thích hợp. Phản ứng
tổng hợp cDNA chỉ xảy ra trong một chu kỳ, theo lý thuyết sau khi kết thúc phản
ứng ta sẽ thu đƣợc lƣợng cDNA tƣơng ứng với lƣợng RNA khuôn ban đầu. Để tăng
hiệu quả của qua trình tổng hợp, lƣợng mồi đƣợc cho vào lớn hơn rất nhiều lƣợng
RNA khuôn và chất kìm hãm RNase cũng đƣợc đƣa vào để bảo vệ cho RNA khỏi bị
cắt bởi RNase.
Khuếch đại gen bằng PCR: Sử dụng cDNA làm khuôn để khuếch đại gen
quan tâm bằng phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu (gồm mồi xuôi và mồi
ngƣợc). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR đƣợc trình bày ở mục 1.6.3.
1.6.3. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction – chuỗi phản ứng trùng hợp)
đƣợc Karl Mullis và cộng sự mô tả đầu tiên vào năm 1985. Đây là kỹ thuật in vitro
tƣơng đối đơn giản, cho phép nhân một số lƣợng không giới hạn nguyên bản một
đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xúc tác của DNA
polymerase. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một đoạn DNA
mới từ mạch khuôn đều cần sự có mặt của những mồi đặc hiệu. Mồi là những đoạn
DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA
polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Quá trình nhân bản bằng enzym
này bao gồm 3 bƣớc đƣợc lặp lại nhiều lần:
1> Biến tính (denaturation): DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng
cách nâng cao nhiệt độ lên 94-95oC trong khoảng thời gian từ 0,5- 1 phút.
2> Lai (hybridization): Nhiệt độ đƣợc hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho
phép các mồi bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong
khoảng 40oC – 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 0,5- 1 phút.
3> Kéo dài (elongation): Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo
dài từ đoạn mồi. Hai phân tử DNA mới đƣợc tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ
hai đầu phân tử khuôn ban đầu. Thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Để tránh
hiện tƣợng bắt cặp không đặc thù, phản ứng thƣờng đƣợc thực hiện ở 72oC.
Loại polymerase dùng trong PCR là loại chịu nhiệt, ví dụ nhƣ Taq-
polymerase đƣợc tách triết từ vi khuẩn Thermus aquaticus, một loại vi khuẩn đƣợc
phân lập từ suối nƣớc nóng. Hiện nay, enzym này chủ yếu đƣợc tổng hợp theo con
đƣờng tái tổ hợp. Sau mỗi chu kỳ phản ứng lƣợng DNA cần nhân bản sẽ tăng gấp
đôi, với N sợi khuôn ban đầu sau n chu kỳ sẽ có N*2n sợi DNA đƣợc tạo ra. Ví dụ,
sau khoảng 20 chu kỳ, có khoảng 30 triệu bản đƣợc tạo ra từ một sợi khuôn ban đầu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
24
1.6.4. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli
Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn đƣợc Frederick Griffith mô tả vào năm
1928 trong thí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là “nguyên lý biến nạp”. Tuy
nhiên, không phải tất cả các vi khuẩn đều có thể biến nạp đƣợc một cách dễ dàng.
Để có thể biến nạp ở E.coli có hiệu quả, các tế bào cần trở nên khả biến
(competent). Để đạt đƣợc điều này, trƣớc khi biến nạp, ngƣời ta ngâm các tế bào
trong dung dịch CaCl2 lạnh. Việc biến nạp các tế bào khả biến đƣợc thực hiện bằng
cách trộn DNA plasmit tái tổ hợp với các tế bào, rồi ủ trong đá từ 20- 30 phút, sau
đó tạo một sốc nhiệt ngắn ở 420C trong khoảng 1- 1,5 phút, làm nhƣ vậy DNA sẽ
chui vào tế bào. Sau khi biến nạp, vi khuẩn đƣợc nuôi phục hồi trong môi trƣờng
LB lỏng ở 370C trong khoảng 60- 90 phút. Sau đó, các tế bào đƣợc đƣa lên môi
trƣờng chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmit tái tổ hợp. Trong quá trình biến
nạp, chỉ một phần rất nhỏ các tế bào khả biến đƣợc biến nạp. Mặc dù có nhƣợc điểm
rất lớn này, biến nạp vẫn là một kỹ thuật quan trọng, nó có thể tạo ra tới 109 các tế
bào biến nạp (tức cá thể biến nạp) khi đƣa 1µg DNA vào thí nghiệm. Trong thực tế,
với 1µg DNA ngƣời ta tạo ra đƣợc 106 đến 107 tế bào biến nạp.
1.6.5. Kỹ thuật tách dòng gen
Tách dòng gen là một công cụ hữu hiệu đƣợc sử dụng trong kỹ thuật di
truyền và là bƣớc khởi nguồn cho các kỹ thuật sau này. Mục đích của việc tách
dòng là nhằm thu đƣợc một lƣợng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm. Đầu tiên,
DNA ngoại lai đƣợc nối vào một vectơ nhằm tạo ra DNA tái tổ hợp. Vectơ sử d