Download miễn phí Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại
Để xác định khả năng sinh axit lactic của
18 chủng có hàm lượng axit cao, dịch nuôi
cấy của các chủng này được định lượng axit
lactic trên thiết bị sắc ký lỏng cao áp, đồng
thời cũng xác định khả năng kháng một số
vi khuẩn gây bệnh trên dịch này. Kết quả
thu được cho thấy hàm lượng axit lactic do
các chủng sinh ra tương đối đồng đều, trải
dài trong khoảng từ 15,3 đến 21 mg/ml dịch
nuôi. Khả năng kháng các vi sinh vật kiểm
định của dịch nuôi vi khuẩn cũng rất mạnh.
Kích thước vòng kháng (D-d) của dịch nuôi
các chủng đối với E. coli từ 20-30 mm, M.
luteus từ 14-20 mm, Salmonella typhi từ 20-34 mm và Shigella flexneri 10-34 mm
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6 – 2010J. Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology
Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi
1
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC DÙNG TRONG CHẾ
BIẾN VÀ BẢO QUẢN THỨC ĂN THÔ XANH VÀ PHỤ PHẨM NÔNG
NGHIỆP CHO GIA SÚC NHAI LẠI
Đào Thị Lƣơng, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên,
Dƣơng Văn Hợp
Viện Vi sinh vật và CNSH-Đại học Quốc Gia Hà Nội
Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len, Bùi Thị Thu Huyền
Viện Chăn nuôi
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bảo quản thức ăn cho gia súc ở quy mô
lớn là vấn đề đang được các nhà chăn nuôi
quan tâm. Nó giúp thức ăn cho động vật
không bị hỏng và giữ được dinh dưỡng
trong thời gian dài. Bảo quản thức ăn cho
gia súc bằng phương pháp ủ chua có bổ sung
vi khuẩn lactic dựa vào khả năng ức chế các
vi khuẩn gây thối, gây bệnh của axit lactic
và kháng sinh bacterioxin do chúng sinh ra
là một phương pháp bảo quản được nhiều
quốc gia trên thế giới ứng dụng.
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có
hoạt tính sinh học cao nhằm ứng dụng trong
bảo quản thức ăn gia súc, giúp cho quá trình
lên men hiệu quả hơn. Phân loại bằng sinh
học phân tử kết hợp với các đặc điểm sinh lý
sinh hoá của các chủng vi khuẩn sinh axit
lactic góp phần quan trọng trong việc lựa
chọn ra các chủng có các đặc tính tốt và an
toàn về mặt sinh học.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Nguồn vi sinh vật
Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập
từ 30 mẫu cỏ, ngô, dưa, cà muối chua, nước
bún.
- Các vi sinh vật kiểm định: Escherichia
coli, Micrococcus luteus, Salmonella typhi,
Shigella flexneri được lữu giữ tại Bảo tàng
giống Vi sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật
và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia
Hà Nội
2.1.2. Môi trường nghiên cứu
- Môi trường MRS thạch (g/l): Glucoza-
20,0; K2HPO4-2,0; CaCO3-5,0;
CH3COONa-5,0; Cao thịt- 10,0; Triamoni
xitrat-2,0; Pepton-10,0; MgSO4.7H2O- 0,58;
Cao nấm men-5,0; MnSO4.4H2O- 0,28;
Tween 80- 1 ml; Thạch- 15,0; Nước cất vừa
đủ- 1lít; pH= 6,0; khử trùng 121oC/15 phút.
- Môi trường MRS dịch thể (g/l): Có thành
phần như trên ngoại trừ thạch và CaCO3.
- Môi trường canh thang nuôi vi sinh vật
kiểm định(g/l): Cao thịt - 3,0; Pepton- 5,0;
NaCl- 1,0; Thạch-15,0; Nước cất vừa đủ-1
lít; pH 7,0; khử trùng 121oC/15 phút.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp định tính và định
lượng
- Định lượng axit theo Therner (Emanuel và
cộng sự, 2005)
- Xác định hàm lượng axit lactic bằng sắc ký
lỏng cao áp (Bevilacqua và Califano, 1989)
2.2.2. Phương pháp phân lập và tuyển
chọn vi khuẩn lactic
- Phân lập: Sử dụng phương pháp pha loãng
giới hạn (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự,
1972)
- Tuyển chọn: Xác định khả năng lên men
đồng hình; chịu nhiệt; kháng khuẩn; sinh
bacterioxin; sinh enzyme ngoại bào phân
giải các cơ chất (tinh bột, casein, pectin,
xylan, CMC) và khả năng đối kháng theo
các phương pháp của Nguyễn Lân Dũng và
cộng sự (1972).
2.2.3. Phương pháp phân loại
- Xác định các đặc điểm sinh lý sinh hoá
(Kozaki et al., 1992)
- Phân loại dựa trên giải trình tự ADNr 16S
Di truyền học và ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6 – 2010
J. Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology
Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi
2
Xác định trình tự ADNr 16S của các
chủng vi khuẩn theo phương pháp của
Sakiyama và cộng sự (2009). Sản phẩm
PCR được tinh sạch và xác định trình tự trên
máy đọc trình tự tự động (ABI
PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer-
Mỹ). Kết quả đọc trình tự được xử lý trên
phần mềm Clustal X của Thompson và cộng
sự, 1997. Các trình tự được so sánh với trình
tự ADNr 16S của các loài đã công bố từ dữ
liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Cây phát
sinh được xây dựng theo Kimura (1980), sử
dụng phương pháp của Saitou và Nei
(1987); phân tích Bootstrap (Felsenstein,
1985) được thực hiện từ 1000 lần lặp lại
ngẫu nhiên.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi
khuẩn lactic lên men đồng hình
3.1.1. Phân lập vi khuẩn sinh axit
Từ 30 nguồn cỏ, ngô, nước dưa cà,
nước bún, 134 chủng vi khuẩn đã được phân
lập và tinh sạch trên môi trường MRS, sau 2
ngày ở nhiệt độ 30oC.
3.1.2. Tuyển chọn các vi khuẩn lactic
- Xác định khả năng sinh axit lên men đồng
hình của các vi khuẩn phân lập
Các chủng phân lập được nuôi trên môi
trường MRS dịch thể có đặt ống Durham.
Sau 3 ngày nuôi cấy, trong số 134 chủng
phân lập có 131 chủng không sinh khí trong
ống Durham là lên men đồng hình.
- Xác định khả năng chịu nhiệt của các vi
khuẩn sinh axit
Các chủng vi khuẩn sử dụng làm giống
khởi động phải có khả năng sinh trưởng
được ở nhiệt độ cao, vì nhiệt độ thường tăng
trong quá trình ủ chua thức ăn, và sinh
trưởng được ở nhiệt độ trong dạ cỏ của động
vật. Dựa vào tiêu chí này, 131 chủng lên
men đồng hình được nuôi trên môi trường
MRS ở 37oC và đã lựa chọn được 70 chủng
có khả năng phát triển tốt tại nhiệt độ này
dùng cho nghiên cứu tiếp theo.
- Xác định khả năng sản sinh axit của các vi
khuẩn sinh axit
Bảy mươi chủng vi khuẩn sinh axit chịu
nhiệt được nuôi trên môi trường MRS dịch
thể trong 48 giờ, hàm lượng axit tổng số của
dịch nuôi cấy được xác định. Kết quả cho
thấy 18 chủng có khả năng sinh axit cao từ
20-21 mg/ml, 43 chủng sinh axit từ 15-19
mg/ml và 9 chủng còn lại có hàm lượng axit
từ 8-14 mg/ml.
- Xác định khả năng sản sinh axit lactic và
kháng khuẩn của dịch nuôi vi khuẩn
Để xác định khả năng sinh axit lactic của
18 chủng có hàm lượng axit cao, dịch nuôi
cấy của các chủng này được định lượng axit
lactic trên thiết bị sắc ký lỏng cao áp, đồng
thời cũng xác định khả năng kháng một số
vi khuẩn gây bệnh trên dịch này. Kết quả
thu được cho thấy hàm lượng axit lactic do
các chủng sinh ra tương đối đồng đều, trải
dài trong khoảng từ 15,3 đến 21 mg/ml dịch
nuôi. Khả năng kháng các vi sinh vật kiểm
định của dịch nuôi vi khuẩn cũng rất mạnh.
Kích thước vòng kháng (D-d) của dịch nuôi
các chủng đối với E. coli từ 20-30 mm, M.
luteus từ 14-20 mm, Salmonella typhi từ 20-
34 mm và Shigella flexneri 10-34 mm.
Khả năng sinh bacterioxin của dịch nuôi
các chủng nghiên cứu cũng được xác định.
Dịch nuôi được trung hòa về pH-6 và được
kiểm tra khả năng kháng với vi khuẩn kiểm
định. Kết quả chỉ rõ cả 18 chủng đều có khả
năng sinh bacterioxin kháng lại các vi khuẩn
kiểm định. Kích thước vòng kháng (D-d) đối
với E. coli từ 8-12 mm, M. luteus từ 2-6
mm, Salmonella typhi từ 3-6 mm và Shigella
flexneri 10-12 mm.
Từ các kết quả trên, 8 chủng vi khuẩn
(2-9; 2-10; 3-5; 3-10; 4-4, 8-10; 9-17 và
L10) có hoạt tính cao và là các chủng đại
diện cho các mẫu khác nhau sẽ được kiểm
tra một số đặc tính sinh học và tiến hành
phân loại.
- Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các
chủng lựa chọn
Tám chủng lựa chọn được nuôi trên môi
trường MRS trong 3 ngày ở nhiệt độ 37oC,
hoạt tính enzyme ngoại bào của dịch nuôi
cấy được xác định bằng phương pháp
khuếch tán tr