kuty_kjsskjss
New Member
Download miễn phí Luận văn Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hóa enzyme invertase (Beta-Fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose ở cây mía
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1. VAI TRÒ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA . 3
1.1.1. Sơ lược về cây mía . 3
1.1.2. Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam . 4
1.2. SINH TỔNG HỢP SUCROSE . 5
1.3. VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO . 8
1.5. ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHưƠNG PHÁP RNAi (RNA
INTERFERENCE) . 10
1.5.1. Nguồn gốc RNAi . 10
1.5.2. Cơ chế gây bất hoạt gen . 10
1.6. KỸ THUẬT GATEWAY. 12
1.7. NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA . 14
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 16
2.1. NGUYÊN LIỆU. 16
2.1.1. Nguyên liệu thực vật . 16
2.1.2. Các chủng plasmid và enzyme . 16
2.1.3. Hóa chất khác . 16
2.1.3. Các thiết bị máy móc . 17
2.2. PHưƠNG PHÁP . 17
2.2.1. Thiết kế mồi. 17
2.2.2. Tách RNA tổng số . 18
2.2.3. RT-PCR . 18
2.2.4. Tách dòng và xác định trình tự gen . 19
2.2.5. Thiết kế vector tái tổ hợp INV-RNAi . 20
2.2.6. Tái sinh mía thông qua mô sẹo . 21
2.2.7. Thử nghiệm chuyển gen gus-intron vào cây mía . 22
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: . 2
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 24
3.1. THIẾT KẾ MỒI . 24
3.2. TÁCH RNA TỔNG SỐ . 25
3.3. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE . 27
3.4. TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN . 28
3.4.1. Tạo plasmid tái tổ hợp INV-pENTR . 28
3.4.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vào tế bào khả biến
E.coli TOP 10 . 28
3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tổ hợp INV_pENTR bằng PCR . 29
3.4.4. Kết quả xác định trình tự nucleotit . 31
3.5. THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP INV-RNAi . 31
3.5.1. Tạo vector tái tổ hợp INV_RNAi bằng kỹ thuật Gateway . 31
3.5.2. Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli . 32
3.6. BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG
VI KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1. . 34
3.7. TÁI SINH VÀ BưỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA . 35
3.7.1. Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo . 35
3.7.3. Chọn lọc mô sẹo và tái sinh cây chuyển gen . 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 42
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
. Fire và Craig C. Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vàongày 19/12/1998 [4]. Andrew Fire và Craig Mello đã nghiên cứu cơ chế điều
khiển biểu hiện gen ở giun tròn (Caenorhabditis elegans) và cho rằng khi
mRNA “chiều dịch mã” và “chiều đối mã” gặp nhau thì chúng sẽ kết hợp lại
thành những mRNA sợi kép. Hai ông đã kiểm chứng lại giả thuyết của mình
bằng cách tiêm các phân tử mRNA sợi kép chứa các mật mã di truyền quy
định nhiều protein khác của giun tròn. Kết quả đều thu đƣợc protein đƣợc mã
hóa bởi các gen đó không đƣợc tổng hợp. Qua đó Fire và Mello đã rút ra đƣợc
kết luận rằng có thể RNA dạng chuỗi kép đã làm các gen bị bất hoạt. Công
trình đƣợc công bố và đƣợc trao giải Nobel Y học năm 2006.
1.5.2. Cơ chế gây bất hoạt gen
RNAi (RNA interference) đƣợc coi nhƣ một phƣơng thức miễn dịch tự
nhiên giúp sinh vật chống lại sự xâm nhập của virus RNA bằng cách phân
huỷ các trình tự nucleotide tƣơng đồng của chúng [8]. Nó làm trung gian
kháng lại cả acid nucleic ngoại bào và nội bào, cũng nhƣ điều khiển sự biểu
hiện gen mã hóa protein. Nó đƣợc thực hiện khi có sự xuất hiện của phân tử
RNA mạch kép trong cơ thể sinh vật gây nên ức chế sự biểu hiện gen của một
loại trình tự đặc hiệu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11
Hình 1.2. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi
Hình 1.2 cho thấy, Cơ chế RNAi đƣợc bắt đầu bằng việc phân cắt phân
tử RNA chuỗi kép (dsRNA) bởi enzyme Dicer - một trong những enzyme thuộc
họ RNase III, tạo thành các phân tử RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích thƣớc
khoảng 21 - 26 nucleotide [4]. Các siRNA này đƣợc giải xoắn và một mạch
gắn kết với một phức hợp protein một cách chọn lọc gọi là phức hợp cảm ứng
sự bất hoạt RNA (RISC – RNA Induced Silencing Complex). Argonaute
(protein Argonaute) trong RISC có chứa RNase-H hoạt động nhƣ một
endonuclease sẽ tách siRNA thành những chuỗi RNA đơn, trong đó chỉ có một
chuỗi đơn RNA có đầu 5’ có lực bắt cặp base (base pairing) nhỏ nhất đƣợc
chọn để tiếp tục đi vào phức hệ RISC. Sau đó, RISC sẽ thu nhận các phân tử
phiên mã mRNA nội sinh của tế bào có trình tự tƣơng đồng với trình tự của
chuỗi siRNA đang có mặt trong phức hệ bằng cách bắt cặp với các base theo
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
12
nguyên tắc bổ sung. Khi đã đƣợc nhận diện các mRNA nhanh chóng bị cắt đứt
ở khoảng giữa của chuỗi xoắn kép siRNA-mRNA và bị tiêu hủy bởi các RNA
nuclease (Helicase) có trong RISC. Sợi RNA bị phân cắt, tiếp tục hình thành
các siRNA. Quá trình tiếp diễn liên tục nhƣ vậy sẽ phân hủy các bản mã sao
hình thành, kết quả là ức chế biểu hiện của gen mong muốn [4].
Cơ chế can thiệp RNAi đem lại những ứng dụng vô cùng to lớn và
đang là công cụ nghiên cứu hữu ích trong nhiều ngành sinh học, nông
nghiệp và y dƣợc học. Nó đƣợc biết đến nhƣ một kỹ thuật sinh học hiện đại
có hiệu quả trong việc chuyển gen phòng chống bệnh do virus, vi khuẩn, hay
làm tăng cƣờng, ức chế một tính trạng mong muốn nào đó ở sinh vật.
Phƣơng pháp này đã đƣợc ứng dụng thành công để thay đổi thành phần chất
béo trong dầu, loại caffein trong cà phê, tăng hàm lƣợng lysine trong ngô
hay loại các chất gây dị ứng ở táo và cà chua [19, 20, 25]. RNAi là một
hƣớng mới cho phép các nhà khoa học nghiên cứu những ứng dụng trong
các liệu pháp trị bệnh cho con ngƣời trong tƣơng lai cũng nhƣ phân tích
chức năng hệ gen cây trồng v.v...
1.6. KỸ THUẬT GATEWAY
Kỹ thuật Gateway (Invitrogen) là một kỹ thuật dòng hóa phổ biến, nó
mang lại hiệu quả cao và nhanh chóng khi phân tích chức năng, biểu hiện
protein và dòng hóa đoạn DNA. Kỹ thuật này cho phép chuyển đoạn DNA
giữa các vector tách dòng khác nhau mà vẫn duy trì định hƣớng chính và cấu
trúc đọc, thay thế việc sử dụng các enzyme giới hạn và các enzyme nối hiệu
quả trong thời gian ngắn. Kỹ thuật này có hiệu quả cao (90%) đối với việc
tách dòng có định hƣớng của các sản phẩm PCR. Hơn nữa các phản ứng đơn
giản, dễ thực hiện, nhanh, mạnh và tự động. Đây là kỹ thuật hữu ích cho
những đặc tính tái tổ hợp đặc hiệu vị trí của vi khuẩn lambda, giúp cho phản
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
ứng tái tổ hợp lambda (Lambda reconstruction: LR) xảy ra một cách hiệu quả
và gắn các đoạn trình tự DNA vào nhiều hệ thống vector.
Hình 1.3. Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway
- Kỹ thuật Gateway đƣợc thực hiện bởi hai bƣớc chính:
+ Tạo dòng tiếp nhận “entry clone” bằng cách chèn gen biểu hiện
(expression gene) vào vector tiếp nhận (pENTR/D).
+ Tạo dòng biểu hiện (expression clone) bằng cách tái tổ hợp giữa
“entry clone” với một vector đích (destination vector) mà có chứa các trình tự
attR1 và attR2 và marker có khả năng kháng chọn lọc ccdB.
Trên hình 1.3 cho thấy dòng vector nhận có các điểm tái tổ hợp attL1
và attL2 sẽ phản ứng với các điểm tái tổ hợp trên vector đích attR1 và attR2
để tạo ra một cấu trúc mới attB1 và attB2. Mặt khác, đoạn gen quan tâm đƣợc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
14
gắn vào trên vector nhận sẽ trao đổi chéo với đoạn ccdB trên vector đích vì
thế thu đƣợc trên dòng biểu hiện có cấu trúc của đoạn gen mong muốn.
1.7. NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA
Tái sinh cây đƣợc xem là mấu chốt quan trọng, quyết định sự thành công
của các thí nghiệm chuyển gen. Hiện nay, hệ thống chuyển gen ở thực vật
thông qua A.tumefaciens đã mang lại những thành tựu lớn trong thời gian
ngắn có thể tạo ra các giống cây trồng có những đặc tính tốt mong muốn. Ở
mía đã chuyển gen thành công với hai phƣơng pháp là súng bắn gen và thông
qua vi khuẩn A.tumefaciens, trong đó chuyển gen thông qua A.tumefaciens là
hiệu quả hơn hẳn.
Snyman và cs (2006) đã tái sinh và chuyển gen thành công ở cây mía
bằng phƣơng pháp súng bắn gen từ mô sẹo [29]. Mô sẹo tạo ra bằng cách đặt
những lát cắt nhỏ dày 1 - 2 mm ở phần đỉnh ngọn của cây mía lên môi trƣờng
cảm ứng tạo mô sẹo là (MS + 30 g/l sucrose + 0,5 g/l casein + 0,6 mg/l 2,4D
+5 g/l agar), pH = 5,8 trong điều kiện tối, ở 28oC. Trƣớc 4 giờ chuyển gen
bằng kỹ thuật súng bắn gen, các mô sẹo đƣợc đặt lên môi trƣờng có bổ sung
thêm 0,2 M Sorbitol; 0,2 M manitol. Sau chuyển gen các mô sẹo đƣợc đồng
nuôi cấy ở trong tối, 3 ngày. Tiếp theo mô sẹo đƣợc chuyển sang môi trƣờng
chọn lọc và thu đƣợc cây chuyển gen hoàn chỉnh với các môi trƣờng có bổ
sung 45 mg/l geneticin.
Manickavasagam và cs (2004) tái sinh và chuyển gen thành công ở mía
thông qua A.tumefaciens từ các mô phân sinh của chồi bằng con đƣờng tạo đa
chồi với hiệu quả thu đƣợc là 49,6% cây chuyển gen [22]. Lây nhiễm
A.tumefaciens vào các mô non đã bị làm thƣơng của mía trong 10 phút. Sau
đó thấm khô trên giấy thấm và đặt lên môi trƣờng MS trong 3 ngày. Các mô
đƣợc diệt khuẩn bằng nƣớc cất khử trùng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
Ông tạo đƣợc các cây chuyển gen trên các môi trƣờng chọn lọc tái sinh có bổ
sung 5 mg/l ppt.
Santosa và cs (2004) ch...