goldenchip_1987
New Member
Download miễn phí Đồ án Nghiên cứu chuyển nạp gen vào cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC i
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH SÁCH BẢNG BIỂU v
DANH SÁCH HÌNH VẼ vi
LỜI MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Công nghệ gen thực vật 1
1.1.1. Các phương pháp chuyển gen thực vật 1
1.1.1.1. Phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng sóng siêu âm 1
1.1.1.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium 3
1.1.1.3. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm. 9
1.1.2. Đoạn gen cần tách dòng, gen chỉ thị, gen chọn lọc .12
1.1.2.1. Đoạn gen cần tách dòng và gen ipt (isopentenyl transferase) 12
1.1.2.2. Gen chỉ thị, gen chọn lọc 14
1.1.3. Các phương pháp phân tích cây chuyển gen 16
1.1.3.1. Phương pháp thử khả năng kháng hygromycin, kanamycin, PPT (phosphinothiricin) của cây tái sinh 16
1.1.3.2. Phương pháp thử GUS 16
1.1.3.3. Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 17
1.1.3.4. Phương pháp phân tích điện di 18
1.1.3.5. Phương pháp Southern blot. 19
1.2. Giới thiệu về cây hoa cẩm chướng 21
1.2.1. Khái quát về cây cẩm chướng 21
1.2.2. Đặc điểm hình thái và sự sinh trưởng phát triển của cây cẩm chướng 26
1.2.3. Điều kiện ngoại cảnh 27
1.2.4. Nhân giống cây cẩm chướng 29
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu 33
2.1.1. Cẩm chướng 33
2.1.2. Chủng vi khuẩn A.tumefaciens có chứa plasmid pVDH396 tái tổ hợp 34
2.1.3. Môi trường và hóa chất sử dụng 35
2.1.4. Điều kiện thí nghiệm 36
2.2. Sơ đồ qui trình và nội dung nghiên cứu 37
2.3. Phương pháp nghiên cứu 38
2.3.1. Phương pháp khử trùng hạt cẩm chướng 38
2.3.2. Phương pháp khảo sát môi trường tái sinh cây cẩm chướng từ lá 40
2.3.3. Phương pháp khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycine 40
2.3.4. Phương pháp chuyển gen ipt gián tiếp nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciences kết hợp sóng siêu âm. 41
2.3.5. Phương pháp nhuộm GUS. 42
2.3.6. Phương pháp tách chiết DNA thực vật. 44
2.3.7. Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction). 45
2.3.8. Phương pháp chạy điện di. 46
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát nồng độ javel và thời gian khử trùng hạt giống 48
3.2. Kết quả khảo sát môi trường tái sinh cây cẩm chướng từ lá 52
3.3. Kết quả khảo sát nồng độ chất chọn lọc hygromycin 57
3.4. Kết quả chọn lọc mô cẩm chướng mang gen chuyển 61
3.5. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện tạm thời của gen chuyển 64
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận 66
4.2. Đề nghị 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TDZ Thidiazuron (N-phenyl-N’-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea)
NAA -naphthaleneacetic acid
BA N6 – Benzyladenine
MS Murashige and Skoog
LB Môi trường Luria-Bertania
B5 Môi trường B5
MSB5 Môi trường MS có thay vitamin môi trường MS bằng vitamin môi trường B5.
DNA Deoxyribonucleic acid
T-DNA transfer-DNA
GFP Green fluorescent protein
GUSA β-Glucoronidase
PEG Polymethylen glycol
PCR Polymerase chain reaction
AS acetosyringone
Hpt hygromycine phosphotransferase
Ipt isopentenyl transferase
Hyg Hygromycin
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Tham khảo thị trường xuất khẩu hoa cây cảnh tháng 04/2007 25
Bảng 1.2: Tham khảo mặt hàng hoa cây cảnh xuất khẩu trong 10 ngày cuối tháng 07/2007 25
Bảng 3.1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu ở nồng độ javel 1.5% 48
Bảng 3.2: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu ở nồng độ javel 3.0% 48
Bảng 3.3: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu ở nồng độ javel 5.0% 48
Bảng 3.4: Số lượng chồi tạo thành trung bình ở mỗi mẫu sau 8 tuần nuôi cấy 52
Bảng 3.5: Mức độ tương đương của các kết quả thí nghiệm môi trường tái sinh 53
Bảng 3.6: Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho việc chọn lọc dòng chuyển gen 57
Bảng 3.7: Mức độ tương đương của các kết quả thử nồng độ hygromycin 59
Bảng 3.8: Số mẫu còn sống sót trên môi trường tái sinh chứa hygrmycin 12mg/l. 61
DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Sóng siêu âm và hiện tượng cavitation 2
Hình 1.2: Hình vi khuẩn Agrobacterium dưới kính hiển vi 4
Hình 1.3: Nốt sần gây ra bởi vi khuẩn Agrobacterium trên thực vật. 4
Hình 1.4: Sơ đồ vector Ti plasmid 5
Hình 1.5. Quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật 6
Hình 1.6: Acetosyringone giúp hoạt hóa vùng vir trong quá trình chuyển gen 8
Hình 1.7: Hiện tượng cavitation (sự tạo và vỡ bọt) 10
Hình 1.8: Ảnh hưởng của sóng âm trên tế bào vào trong tế bào nhờ sóng âm. 10
Hình 1.9: Cơ chế chuyển DNA 11
Hình 1.10: Cơ chế chuyển DNA vào trong tế bào nhờ Agrobacterium tumefaciens kết hợp với sóng âm .11
Hình 1.11: Promoter đặc hiệu lão suy SAG12 được kết hợp với gen tổng hợp cytokinin isopentenyl transferase .13
Hình 1.12: Sơ đồ mô tả phương pháp Southern blot. 20
Hình 1.13: Hoa cẩm chướng. 21
Hình 2.1: Hoa cẩm chướng 33
Hình 2.2: Hạt cẩm chướng (Dianthus caryophylus) 33
Hình 2.3: Cây cẩm chướng in vitro 33
Hình 2.4: Sơ đồ plasmid pVDH396 mang gen chọn lọc kháng hygromycin (gen hpt), gen gusA và gen ipt 34
Hình 2.5: Gen hpt, gen ipt, gen gusA trong vùng T-DNA của plasmid pVDH396 34
Hình 2.6: Sơ đồ qui trình tạo cây cẩm chướng chuyển gen .37
Hình 2.7: Qui trình khử mẫu .39
Hình 3.1: Biểu đồ khảo sát tỷ lệ nhiễm ở nồng độ javel 1.5%, 3.0%, 5.0% và thời gian khử trùng hạt 5 phút, 10 phút, 15 phút. 49
Hình 3.2: Biểu đồ khảo sát tỷ lệ nảy mầm ở nồng độ javel 3.0%, 5.0% và thời gian khử trùng hạt 5 phút, 10 phút, 15 phút. 49
Hình 3.3: Sự phát triển của cây sau 13 ngày ở nồng độ javel 3.0%. 50
Hình 3.4: Các mẫu khử trùng 5, 10, 15 phút ở javel 3.0% sau 10 ngày 51
Hình 3.5: Các mẫu khử trùng 5, 10, 15 phút ở javel 5.0% sau 10 ngày 51
Hình 3.6: Các mẫu khử trùng 5, 10, 15 phút ở javel 3.0% sau 14 ngày 51
Hính 3.7: Biểu đồ thể hiện mức độ tương đương của các kết quả thí nghiệm môi trường tái sinh 53
Hình 3.8: Biểu đồ khảo sát số chồi tái sinh từ môi trường TS0 đến TS10. 54
Hình 3.9: Biểu đồ so sánh khả năng tạo chồi của nhóm môi trường có nồng độ NAA 0.1 mg/l và nhóm môi trường có nồng độ NAA 0.2 mg/l. 54
Hình 3.10: Khảo sát môi trường tái sinh tử diệp cẩm chướng. 55
Hình 3.11: Sơ đồ khảo sát nồng độ hygromycin trong 28 ngày. 57
Hính 3.12: Biểu đồ thể hiện mức độ tương đương của các kết quả thử nồng độ hygromycin 59
Hình 3.13: Mẫu tử diệp trên môi trường tái sinh với các nồng độ hygromycin khác nhau 0 (đối chứng), 4, 8, 12, 16, 20 mg/l sau 4 tuần chọn lọc 60
Hình 3.14: Quá trình chọn lọc mô cẩm chướng mang gen chuyển trên môi trường tái sinh chứa hygomycin. 62
Hình 3.15: Nhuộm GUS tử diệp cẩm chướng sau 6 ngày ủ với vi khuẩn. 64
Hình 3.16: Nhuộm GUS mô sẹo sau 3 tuần cấy chuyển trên môi trường chọn lọc chứa 12mg/l hygromycin. 64
Hình 3.17: Kết quả PCR đối với gen hyt ở D. caryophylus L. sau chọn lọc. 64
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
à tần số sóng âm được điều chỉnh.Để tăng hiệu suất chuyển gen thì các nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào phương pháp chuyển gen dùng Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm trong chuyển gen vào mô, tế bào thực vật (sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation) được viết tắt là SAAT. Các bọt khí cực nhỏ (bubbles) được ứng dụng để chuyển gen vào trong mô và tế bào thực vật.
Hình 1.7: Hiện tượng cavitation (sự tạo và vỡ bọt)
Hình 1.8: Ảnh hưởng của sóng âm trên tế bào.
A, B, C, D : những tế bào được xử lý sóng âm
E, F: tế bào không được xử lý sóng âm.
Hình 1.9: Cơ chế chuyển DNA vào trong tế bào nhờ sóng âm.
Sóng âm làm tăng hiện tượng cavitation, tạo lỗ (kênh) trên màng, các T-DNA của A. tumefaciens plasmid sẽ qua lỗ màng vào trong tế bào thực vật dễ dàng và nhanh chóng.
Hình 1.10: Cơ chế chuyển DNA vào trong tế bào
nhờ Agrobacterium tumefaciens kết hợp với sóng âm.
Sau khi T-DNA của A. tumefaciens vào được bên trong tế bào nó nhanh chóng tích hợp vào bộ gen thực vật, các gen trên T-DNA sẽ được biểu hiện, sự tổng hợp và giải phóng các hợp chất chuyển hóa mới – các hợp chất mà ta mong muốn sẽ được thực hiện.
Phương pháp SAAT mới được nghiên cứu và ứng dụng nhưng mang lại nhiều thành công và hứa hẹn trong công nghệ chuyển gen nói chung và chuyển gen thực vật nói riêng. [3, 12, 15, 28]
Đoạn gen tách dòng, gen chỉ thị, gen chọn lọc.
1.1.2.1 Đoạn gen cần tách dòng và gen ipt (isopentenyl transferase)
Gen cần tách dòng hay còn gọi là gen cần thiết thường là những gen mã hóa các protein, enzym hay gen mã hóa các đặc điểm quí (năng suất cao, khả năng chống chịu bệnh…) cần thiết cho con người trong thực tiễn sản xuất hay trong nghiên cứu.
Gen cần tách dòng có thể được chuẩn bị theo hai con đường: tách chiết từ bộ gen vi sinh vật, động thực vật, con người, hay tổng hợp nhân tạo các oligonucleotid. Trong thực tế, các gen mang đặc điểm quí thường được tách chiết từ vi sinh vật hay các sinh vật bậc cao.
Trong thí nghiệm này, đoạn gen cần tách dòng là gen tổng hợp cytokinin isopentenyl transferase (ipt). Nghiên cứu về sinh lý đã cho thấy là trong nhiều loài, cytokinin có thể ức chế lão suy và mức độ cytokine nội sinh đó giảm đi cùng với tiến trình lão suy (reviewed by Gan and Amasino, 1996). Biểu hiện của gen ipt sẽ dẫn đến việc sản xuất cytokinin. Nhiều chiến lược (với các promoter khác nhau) đã được thực hiện để điều khiển sự biểu hiện của gen ipt trong cây chuyển gene, gồm các promoter cảm ứng nhiệt, vết thương, sáng và những promoter đặc hiệu. Hầu hết những cây chuyển gen cấu trúc có chứa gen ipt đều biểu hiện chậm lão suy, cũng như có những bất thường về phát triển và phát sinh hình thái. Điều này có thể do cytokinin tác động mạnh đến quá trình phát triển ngoài lão suy, và việc sản xuất quá mức cytokinin trước khi lão suy xảy ra sẽ can thiệp vào sự phát triển bình thường của cây. Để tránh vấn đề này, promoter SAG12 đặc hiệu cao cho lão suy được dùng để điều khiển biểu hiện của gen ipt (Gan and Amasino, 1995). Promoter này kích hoạt biểu hiện của gen ipt tại thời điểm bắt đầu lão suy, dẫn đến tăng lượng cytokinin, ngăn cản quá trình lão suy. Lượng cytokinin ức chế lão suy sẽ tăng đến một ngưỡng nào đó và bắt đầu làm yếu đi promoter đặc hiệu lão suy, do đó ngăn cản được việc tích trữ cytokinin ở một mức độ mà nó có thể can thiệp tới những mặt phát triển khác của cây.[3, 9]
Isopentenyl transferase
Lão suy
Cytokinin
SAG 12 promoter
Lượng Cytokinin cao
Hình 1.11: Promoter đặc hiệu lão suy SAG12 được kết hợp với gen tổng hợp cytokinin isopentenyl transferase.
(Sự bắt đầu của lão suy kích hoạt promoter SAG 12 điều khiển sự sản xuất của cytokinin. Cytokinin được tạo ra ức chế quá trình lão suy, và nếu lượng cytokinin cao sẽ quay lại ức chế hoạt động promoter SAG để ngăn cản sự sản xuất quá mức các cytokinin)
Những nghiên cứu chuyển gen ipt ở cây trồng
Các nghiên cứu chuyển nạp gen ipt của các tác giả Gan và cs, 1996; Wang và cs, 1997 trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) cho thấy hàm lượng cytokinin tăng lên trong cây chuyển gen và do đó làm chậm sự lão hoá của lá và hoa.
Năm 2001, công trình "Ảnh hưởng của biểu hiện gen ipt promoter SAG12 đối với sự phát triển và lão suy ở cây cải xà lách (Lactuca sativa L. cv. ‘Evola’) chuyển gen", tác giả Matthew S. McCabe và cộng sự thực hiện chuyển gen ipt điều khiển bởi promoter SAG12 bằng phương pháp gián tiếp qua vi khuẩn A. tumefaciens trên đối tượng lá mầm cây cải xà lách. Kết quả cho thấy hàm lượng cytokinin tăng trong cây chuyển gen và làm chậm đáng kể sự lão suy lá trong quá trình phát triển cây cũng như sau thu hoạch của cây chuyển gen.
Năm 2003, Công trình "Sản xuất thừa các cytokinins trong hoa cây thuốc lá cảnh (Petunia) được chuyển gen ipt - promoter SAG12, làm chậm lão suy tràng hoa và giảm sự nhạy cảm đối với Ethylene". Hsiang Chang và cộng sự đã nghiên cứu chuyển gen ipt được điều khiển bởi promoter SAG12 vào cây hoa Dã yên (Petunia hybrida cv. ‘V26’) bằng phương pháp dùng vi khuẩn A. tumefaciens. Kết quả cho thấy hoa của các dòng cây chuyển gen có tuổi thọ dài hơn 6-10 ngày so với đối chứng và hoa cây chuyển gen kém mẫn cảm hơn đối với ethylen ngoại sinh. Kết luận quan trọng của nghiên cứu này là có thể sử dụng gen ipt trong nghiên cứu chuyển nạp gen tạo giống cây trồng tăng tuổi thọ của hoa như hoa phong lan, cẩm chướng, lily…
Năm 2006, công trình nghiên cứu "Sự chậm lão suy lá trong cây cỏ linh lăng (Medicago sativa) chuyển gen ipt được kiểm soát bởi promoter đặc hiệu lão suy SAG12" do Ornella Calderini và cộng sự thực hiện, tạo cây cỏ linh lăng tăng giá trị về chất và lượng khi sử dụng làm nguồn thức ăn gia súc. Phương pháp chuyển gen gián tiếp qua A. tumefaciens.
Một nghiên cứu quan trọng gần đây nhất do hai nhóm nghiên cứu của Mỹ và Nhật Bản ( Rivero và cs, 2007) đã tạo ra cây biến đổi gen có khả năng chống chịu được hạn hán bằng phương pháp chuyển gen ipt vào cây thuốc lá. Các nhà nghiên cứu hy vọng phát hiện này sẽ giúp giảm những thiệt hại về mùa màng do hạn hán và cho phép sản xuất lương thực tại các vùng thiếu nước.
1.1.2.2 Gen chỉ thị, gen chọn lọc
Bằng các phương pháp sinh học phân tử có thể tạo ra các cấu trúc DNA plasmid, trong đó ngoài các promoter, các gen của vi khuẩn Agrobacterium giúp cho DNA plasmid gắn được vào bộ gen thực vật, gen ngoại lai (gen cần tách dòng)… còn có các gen giúp phân lập ra tế bào hay mô thí nghiệm. Các gen được lắp ghép vào DNA của plasmid với mục đích này được gọi là gen chỉ thị chọn lọc hay gen chỉ thị sàng lọc.
Gen chỉ thị chọn lọc thường dùng nhất là các gen mã hóa cho một số enzyme chỉ có trong vi khuẩn ở điều kiện tự nhiên mà không có trong giới thực vật. Sau khi chuyển gen, nếu thấy enzyme vi khuẩn hoạt động thì có thể suy ra là toàn bộ T-DNA plasmid đã được gắn vào bộ gen của thực vật và gen ngoại lai mà ta cần chuyển đã trở thành một bộ phận của bộ máy di truyền thực vật.
Các gen chỉ thị thường dùng nhất : gusA, gfp.
Gen uidA (hay còn gọi là gen gusA): Gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide. Sản ph