LINK TẢI LUẬN VĂN MIỄN PHÍ CHO AE KET-NOI
Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease thương mại tegalase r660l để thu nhận chất màu astaxanthin ở dạng carotenoprotein từ phế liệu đầu tôm sú
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .....................................................................vi DANH MỤC BẢNG BIỂU................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH ẢNH .................................................................................vii CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ................................................................................ 3
1.1. Tổng quan về phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon ..............................3
1.1.1. Giới thiệu về tôm sú Penaeus monodon ...................................... 3
1.1.2. Phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon ...................................... 4
1.1.3. Tình hình xử lý đầu và vỏ tôm .................................................... 6
1.2. Carotenprotein trong động vật thuỷ sản và một số phương pháp chiết rút 7
1.2.1. Carotenoid ................................................................................. 7
1.2.2. Astaxanthin ................................................................................ 9
1.2.3. Caotenprotein ........................................................................... 11
1.2.4. Các ứng dụng astaxanthin: ...................................................... 13
1.3. Enzyme protease .......................................................................................15
1.3.1. Giới thiệu chung về enzyme protease ........................................ 15
1.3.2. Phân loại proease ..................................................................... 15 i
1.3.3. Tính chất chung của enzyme ................................................... 16
1.3.4. Yếu tố ảnh hưởng hoạt độ enzyme ............................................ 17
1.4. Quá trình thuỷ phân protein [4]...............................................................19
1.4.1. Khái niệm và bản chất của quá trình thuỷ phân protein: .......... 19
1.4.2. Các phương pháp thuỷ phân protein......................................... 19
1.5. Các nghiên cứu tách chiết carotenoprotein trong và ngoài nước: ........21
1.5.1. Các nghiên cứu trong nước:.....................................................21
1.5.2. Các nghiên cứu ngoài nước: .................................................... 24
CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 27 2.1. Nguyên liệu cứu:.........................................................................................27 2.1.1. Đầu tôm: ......................................................................................... 27 2.1.2. Enzyme protease: ............................................................................ 27 2.1.3. Hoá chất ......................................................................................... 27
2.2. công cụ và thiết bị .....................................................................................27
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.....................................................29
2.3.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................ 29
2.3.2. Bố trí thí nghiệm ...................................................................... 30
ii
Phế liệu đầu tôm trước khi được đưa vào thủy phân được xử lý theo thứ tự trình bày trong hình 2.2.............................................................................. 30
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu:.......................................................... 37
2.3.4. Xử lý số liệu: ............................................................................. 37
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 38 3.1. Các thông số cơ bản của nguyên vật liệu dùng trong thí nghiệm..................38 3.1.1. Biến đổi số đơn vị hoạt tính enzyme .................................................. 38 3.1.2. Thành phần nguyên liệu ................................................................... 39 Bảng 3.2. Thành phần nguyên liệu đầu tôm P.monodon ...................................... 39 3.2. Điểm pI của dịch thuỷ phân...........................................................................40
3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme prtotease Tegalase R660L ......................................................................................42
3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme protease Tegalase R660L...............................................................42
3.3.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid amin trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi acid amin .................................................................42
3.3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng astaxanthin thu nhận trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi astaxanthin...............................................45
3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) protease Tegalase R660L đến quá trình thuỷ phân..................................................48
iii
3.3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) protease Tegalase R660L đến hàm lượng acid amin thu được trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi acid amin...............................................................................48
3.3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzym) đến hàm lượng astaxanthin và hiệu suất thu hồi astaxanthin ........................................................52
3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thuỷ phân ............................. 57 3.3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin trong dịch thủy
phân ..................................................................................................................57
3.4. Tối ưu hoá nhiệt độ và thời gian thuỷ phân phế liệu đầu tôm để thu sản phẩm bột carotenoprotein ...............................................................................................60
3.4.1. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân .................... 61 3.4.2. Xác định chỉ tiêu tối ưu của quá trình thuỷ phân................................ 61
3.4.3. Thiết lập phương trình hồi qui của hàm lượng acid amin AP và xác định nhiệt dộ và thời gian tối ưu của quá trình thuỷ phân thu nhận carotenoprotein. ................ ........................................................................................................ 62
3.4.3.1 Thiết lập phương trình hồi qui và phân tích ảnh hưởng của nồng độ, nhiệt độ và thời gian tới thu hồi hàm lượng acid amin ....................................62
3.4.3.2. Thiết lập phương trình hồi qui và phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tới thu hồi astaxanthin......................................................................65
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 70
4.1. Kết luận..........................................................................................................70
iv
4.2. Kiến nghị........................................................................................................70
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................. 73
PHỤ LỤC
v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
C Nồng độ enzyme Tg Thời gian
T Nhiệt độ
AP Hàm lượng acid amin
AsP Hàm lượng astaxanthin
EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1: Đặc tính của enzyme protease Tegalase R660L............................. 27 Bảng 3.1. Thành phần nguyên liệu đầu tôm P.monodon (tính trên nguyên liệu
khô) .................................................................................................................. 39 Bảng 3.2: Khoảng biến thiên của các yếu tố cần tối ưu khi thuỷ phân đầu tôm61
Bảng 3.3. Thông số nhiệt độ và thời gian tối ưu của quá trình thu nhận bột carotenoprotein................................................................................................ 67
Bảng 3.4: Thành phần hóa học trong bột carotenoprotein.............................. 68
vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Sản lượng nuôi trồng và khai thác thuỷ sản Việt Nam ...............................5
Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của carotenoid .................................................................9
Hình 2.1. Nội dung nghiên cứu.................................................................................29
Hình 2.2. Chuẩn bị đầu tôm ......................................................................................30
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thuỷ phân phế liệu đầu tôm.............34
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ enzyme dùng thuỷ phân phế liệu đầu tôm.............................................................................................................................36
Hình 3.3. Hàm lượng acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau................42
Hình 3.4. Hàm lượng acid amin của dịch thủy phân theo nhiệt độ ở thời gian thủy phân là 6 giờ..............................................................................................................43
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau...................................................................................................................44
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi protein ở các nhiệt độ thủy phân sau 6 giờ thủy phân.............................................................................................................44
Hình 3.7. Hàm lượng astaxanthin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau ............46
...................................................................................................................................46
Hình 3.8. Hàm lượng astaxanthin sau 6 giờ thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau....46
Hình 3.9. Hiệu suất thu hồi astaxanthin qua các thời gian thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau...................................................................................................................47
vii
Hình 3.10. Hiệu suất thu hồi astaxanthin sau 6 giờ thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau. ..........................................................................................................................47
Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện hàm lượng astaxanthin và acid amin của dịch thuỷ phân sau 6 giờ với hoạt độ enzyme là 20UI ở các nhiệt độ khác nhau..............................48
Hình 3.12. Hàm lượng acid amin theo thời gian ở các các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau...................................................................................................................49
Hình 3.13. Hàm lượng acid amin sau 6 giờ thuỷ phân theo các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau .....................................................................................................50
Hình 3.14. Hiệu suất thu hồi protein theo thời gian ở các các số đơn vị hoạt độ khác nhau ...........................................................................................................................51
Hình 3.15. Hiệu suất thu hồi protein sau 6 giờ thủy phân ........................................51
Hình 3.16. Hàm lượng astaxanthin theo thời gian ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau...................................................................................................................53
Hình 3.17. Hàm lượng astaxanthin thu được trong bột nhão carotenoprotein từ dịch thủy phân sau 6 giờ thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau .............54
Hình 3.18. Hiệu suất thu hồi astaxanthin trong bột nahxo caroteinoprotein từ dịch thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau..............................................55
Hình 3.19. Hiệu suất thu hồi astaxanthin trong bột nhão carotenoprotein từ dịch thủy phân phân sau 6 giờ thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau.....55
Hình 3.20. Hàm lượng acid amin và astaxanthin của dịch thuỷ phân sau 6 giờ với các số đơn vị hoạt độ khác nhau, 550C .....................................................................56
viii
Hình 3.21. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin thu được khi thủy phân ở 30UI và 550C.................................................................................................58
Hình 3.22. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng astaxanthin thu được khi thủy phân ở 30UI và 550C.................................................................................................59
Hình 3.23. Bề mặt đáp ứng của hàm AP ở nồng độ C= 5% .....................................64 Hình 3.24. Bề mặt đáp ứng của hàm AsP ở nồng độ enzyme C= 5% ......................66 Hình 4.1. Quy trình thu nhận bột nahxo carotenoprotein ....................................... 72
ix
ĐẶT VẤN ĐỀ
MỞ ĐẦU
Astaxanthin được biết đến là một chất chống oxy hoá mạnh với năng lượng chống oxy hoá gấp 10 lần so với ß- carotene và 500 lần so với vitamin E.[23]. Chính vì lý do này, hiện nay, chất màu này được sử dụng nhiều trong y học, thực phẩm, mỹ phẩm và cả trong thức ăn thuỷ sản, đặc biệt là thức ăn cho cá hồi. Tính đến hiện tại, astaxanthin chủ yếu được thu nhận từ tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Phaffia. Và những năm gần đây, lớp vỏ của các loài giáp sát được chú ý đến trong các nghiên cứu chiết rút astaxanthin, đặc biệt là phế liệu đầu và vỏ tôm.
Ngày nay, ngành chế biến tôm đông lạnh xuất khẩu là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn, tạo ra nhiều công ăn việc làm và mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước. Cùng với sự phát triển của nền kinh tế trong và ngoài nước, ngành thủy sản trong những năm gần đây đã đạt được những thành tựu đáng kể về nuôi trồng, chế biến cũng như xuất khẩu. Trong công nghệ chế biến thủy sản xuất khẩu của Việt Nam, tỷ lệ các mặt hàng giáp xác đông lạnh chiếm từ 70 – 80% sản lượng chế biến. Trong các mặt hàng xuất khẩu của nước ta thì mặt hàng tôm xuất khẩu luôn chiếm tỷ lệ lớn, chiếm hơn 50% tổng kim ngạch xuất khẩu. Cùng với khối lượng tôm xuất khẩu hằng năm thì phế thải liệu của nó bao gồm đầu và vỏ tôm cũng khá lớn. Thông thường đầu tôm chiếm 25 – 40% so với khối lượng toàn cơ thể thì cùng với lượng tôm xuất khẩu năm 2016 là 6.7 triệu tấn sẽ suy ra được lượng phế liệu đầu tôm là 1 – 3 triệu tấn được thải ra trong quá trình chế biến. Trong phế liệu đầu tôm chứa một lượng lớn protein, chitin, chất màu astaxanthin và một số hợp chất sinh học khác. Tuy nhiên, hiện nay phế liệu đầu tôm chỉ được sử dụng chủ yếu để làm thức ăn gia súc, một phần nhỏ để sản xuất chitin. Đây là một cách tận thu phế liệu mang lại hiệu quả kinh tế nhưng không mang lại hiệu quả cao. Vì vậy, cần thiết phải có nhiều nghiên cứu hơn nữa để tìm ra hướng sử dụng nguồn phế liệu này hiệu quả hơn, mang lại lợi ích kinh tế, kỹ thuật và môi trường. Và hiện nay cũng đã có nhiều nghiên cứu về việc chiết rút astaxanthin từ nguồn phế liệu tôm bằng việc thuỷ phân bằng tác nhân hoá học hay trích ly astaxanthin bằng dung môi
1
....Tuy vậy, các tác nhân hoá học ảnh hưởng đến chất lượng màu của sản phẩm cũng như không thể sử dụng làm thực phẩm cho người.
Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong việc thuỷ phân phế liệu tôm sú Penaeus monodon nhằm tận thu astaxanthin ở dạng bột carotenprotein cho mục đích thực phẩm” được tiến hành với mong muốn nâng cao hiệu suất thu được astaxanthin với sự có mặt của protein hoà tan để có thể ứng dụng vào mỹ phẩm, thực phẩm.
MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
Mục đích chung của đề tài này nhằm xác định các thông số của quá trình thủy phân để nâng cao hiệu suất thu nhận carotenprotein cao nhất và bước đầu thăm dò điều kiện thủy phân tối ưu dựa vào bề mặt đáp ứng.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Để đạt được mục tiêu đề ra, chúng tui thực hiện các bước nghiên cứu như sau:
+ Khảo sát điểm pH có thể tủa carotenprotein nhiều nhất.
+ Khảo sát các điều kiện của quá trình thuỷ phân (nồng độ enzyme, nhiệt
độ và thời gian thủy phân).
+ Bước đầu tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian thủy phân dựa vào bề mặt đáp ứng.
+ Xác định các thông số của bột nhão carotenprotein: màu sắc, mùi, hàm lượng astaxanthin.
2
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon
1.1.1. Giới thiệu về tôm sú Penaeus monodon
Tôm sú (Tên Tiếng Anh: Giant/ Black Tiger Shrimp) được định loại là: Ngành: Arthropoda – Ngành chân khớp
Lớp: Crusstacea – Lớp giáp xác
Bộ: Decaoda – Bộ mười chân
Họ chung: Penaeidea
Họ: Penaeus Fabricius
Giống: Penaeus
Loài: Monodon
Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius
Cấu tạo của tôm gồm 2 phần: phần đầu và phần thân. Hầu hết các cơ quan nằm ở phần đầu ngực, phần thân chỉ có ruột và động mạch chủ, thịt tôm nằm gần như hoàn toàn ở thân. Vỏ tôm thường được tạo thành từ nhiều lớp protein, khoáng, lipid bao phủ khung chitin. Toàn bộ lớp vỏ này không sinh trưởng vì vậy tôm phải lột xác từng thời kì sinh trưởng của bản thân. Dưới lớp vỏ là lớp biểu bì có vai trò quan trọng trong việc lột xác bỏ lớp vỏ cũ và hình thành lớp vỏ mới của tôm. Kề trong lớp biểu bì là lớp trung bì có chứa sắc tố chủ yếu là astaxanthin. Chính nhờ sự biến đổi của sắc tố này mà ta có thể phân biệt được chất lượng tôm. Phần đầu thường chiếm khoảng 35 – 45% trọng lượng, phần vỏ chiếm 10 – 15% trọng lượng. Tỷ lệ các phần đầu, thân, vỏ luôn thay đổi phụ thuộc vào giống loài.
Vỏ tôm được cấu tạo từ một phức hợp chitin – protein liên kết với một số hợp chất hữu cơ khác (astaxanthin, lipid), bị hóa cứng do kết hợp với canxi cacbonat. Chitin là các loại polysaccharide phổ biến trong tự nhiên chỉ sau cellulose. Nó được cấu tạo bởi các cầu nối 1,4 glucozit. Ngoài lớp màng sáp bao phủ bên ngoài lớp vỏ epicuticle, lipid còn tồn tại dưới dạng phức chất sterol- protein chứa trong lớp
3
endocuticle. Bên cạnh các thành phần trên, trong phế liệu đầu và vỏ tôm chứa lượng lớn protein. Protein trong vỏ tôm thường là loại protein không hòa tan, liên kết với lớp vỏ chitin bởi liên kết cộng hóa trị bền vững tương tự như liên kết giữa các phân tử amino acid với nhau trong phân tử protein. Do đó nó không bị tách ra khỏi vỏ tôm. Thành phần trong vỏ tôm mà đề tài quan tâm nhất, đó là astaxanthin. Chất này có màu xanh, và liên kết với protein, khi gia nhiệt, chúng chuyển thành carotenoprotein có màu cam.
1.1.2. Phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon
Việt Nam nằm bên bờ Tây của Biển Đông, là một biển lớn của Thái Bình Dương, có diện tích khoảng 3.448.000 km2, có bờ biển dài 3260 km. Vùng nội thuỷ và lãnh hải rộng 226.000 km2, vùng biển đặc quyền kinh tế rộng hơn 1 triệu km2 với hơn 4.000 hòn đảo, tạo nên 12 vịnh, đầm phá với tổng diện tích 1.160km2 được che chắn tốt dễ trú đậu tàu thuyền. Biển Việt Nam có tính đa dạng sinh học khá cao, cũng là nơi phát sinh và phát tán của nhiều nhóm sinh vật biển vùng nhiệt đới ấn Độ - Thái Bình Dương với chừng 11.000 loài sinh vật đã được phát hiện. Bên cạnh đó, nước ta với hệ thống sông ngòi dày đặc và có đường biển dài rất thuận lợi phát triển hoạt động khai thác và nuôi trồng thủy sản. Sản lượng thủy sản Việt Nam đã duy trì tăng trưởng liên tục trong 17 năm qua với mức tăng bình quân là 9,07%/năm. Với chủ trương thúc đẩy phát triển của chính phủ, hoạt động nuôi trồng thủy sản đã có những bước phát triển mạnh, sản lượng liên tục tăng cao trong các năm qua, bình quân đạt 12,77%/năm, đóng góp đáng kể vào tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản của cả nước. Trong khi đó, trước sự cạn kiệt dần của nguồn thủy sản tự nhiên và trình độ của hoạt động khai thác đánh bắt chưa được cải thiện, sản lượng thủy sản từ hoạt động khai thác tăng khá thấp trong các năm qua, với mức tăng bình quân 6,42%/năm [1].
4
Hình 1.1. Sản lượng nuôi trồng và khai thác thuỷ sản Việt Nam
Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, tổng sản lượng thủy sản sản xuất năm 2016 đạt hơn 6,7 triệu tấn, tăng 2,5% so với năm 2015. Năm 2016, mặc dù tình hình hạn mặn và dịch bệnh làm ảnh hưởng nhiều tới nuôi tôm nước lợ trong 9 tháng đầu năm. Tuy nhiên, mưa nhiều trong những tháng cuối năm, độ mặn giảm...cùng với sự chỉ đạo sát sao của các cấp trong việc kiểm soát dịch bệnh nên sản lượng thu hoạch tăng vào những tháng cuối năm. Sản lượng tôm nước lợ cả nước ước đạt 650 nghìn tấn. Tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, diện tích tốm sú ước đạt 569.500 ha, sản lượng đạt 251 nghìn tấn. Diện tích tôm thẻ chân trắng ước đạt 64.440 ha, tăng 11,5% so với năm 2015, sản lượng ước đạt 253,1 nghìn tấn. Tính trên cả nước, trong những năm gần đây, diện tích và sản lượng tôm nuôi không ngừng tăng, đến năm 2015, diện tích nuôi tôm nước lợ đạt trên 700.000 ha với sản lượng trên 650.000 tấn. Bên cạnh diện tích nuôi trồng rộng lớn, số lượng doanh nghiệp tham gia chế biến và xuất khẩu cũng không ngừng gia tăng. Trên cả nước có khoảng 160 doanh nghiệp tham gia chế biến, xuất khẩu tôm, tập trung chủ yếu ở Miền Trung, Nam Trung Bộ (Khánh Hòa, Phú Yên, Ninh Thuận, Bà Rịa – Vũng Tàu...), Đồng
Bằng Sông Cửu Long (Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà
5
Mau, Kiên Giang), với tổng công suất chế biến đạt gần 1 triệu tấn sản phẩm/năm. Cùng với sự phát triển của ngành thuỷ hải sản, một lượng lớn đầu và vỏ tôm được thải ra môi trường, gây ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, đây lại là nguồn phế liệu chứa nhiều thành phần mang giá trị kinh tế cao: protein, chintin, astaxanthin.... Phế liệu tôm chủ yếu là đầu và mảnh vỏ, ngoài ra, còn có phần thịt vụn... tùy theo giống loài và phương pháp chế biến mà lượng phế liệu tôm có thể vượt quá 60% sản lượng tôm khai thác được. Ví dụ tôm càng xanh, phê liệu chiếm khoảng 60% khối lượng toàn bộ, với tôm sú thì phế liệu chiếm 40% [1].
1.1.3. Tình hình xử lý đầu và vỏ tôm
Trước đây vấn đề xử lý phụ phế phẩm tôm từ các cơ sở chế biến, các công ty gặp nhiều khó khăn, chủ yếu đem đỗ bỏ. Gần đây phụ phế phẩm tôm đã được dùng làm thức ăn cho gia súc, góp phần làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên phương pháp này không đem lại hiệu quả kinh tế cao, việc làm thức ăn đòi hỏi phải sấy mà quá trình này không làm giảm khoáng và chitin, 2 chất này gây khó tiêu cho gia súc.
Vì vậy người ta hướng đến một giải pháp mới là sản xuất Chitin – Chitosan. Chất Chitin- Chitosan chứa trong vỏ tôm là một loại nguyên liệu có thể ứng dụng cho nhiều ngành kinh tế. Theo đó, phế liệu tôm được thu gom tại các cơ sở chế biến đông lạnh, sau khi rửa sạch, sấy khô được đưa vào nồi phản ứng để loại bỏ muối vô cơ (muối can xi, muối phốt pho) và các protein. Sản phẩm thu được từ công đoạn này có tên là chitin; sau đó lại được đưa vào ngâm trong dung dịch kiềm khoảng 2 giờ sẽ cho ra một chất mới là Chitosan. Theo một số nhà khoa học, Chitosan có khả năng khống chế sự gia tăng của tế bào ung thư; đã được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả khá cao trong công nghệ bào chế dược phẩm (làm thuốc chữa bỏng (phỏng), thuốc giảm đau, hạ cholesterol, thuốc chữa bệnh dạ dày, thuốc chữa chứng đau xương khớp, chống viêm cấp trên mô lành...). Một số kết quả nghiên cứu của các bạn sĩ ở Bệnh viện K Hà Nội, Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Hóa học những năm gần đây đã chứng minh những tác dụng đó của chất Chitosan trong vỏ tôm. Và trên thị trường dược phẩm hiện nay, loại thuốc chữa bệnh khớp làm từ vỏ tôm có tên
6
Glucosamin ngày càng được sử dụng rộng rãi do ít gây tác dụng phụ. Ngoài ra, chất Chitosan cũng được ứng dụng trong một số ngành công nghiệp: hóa chất, mỹ phẩm, xử lý nước thải...Các nhà nghiên cứu trên thế giới từ lâu đã quan tâm đến lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan, protein và carotenoid từ phế liệu tôm bằng nhiều phương pháp như phương pháp hóa học, phương pháp sinh học hay kết hợp giữa phương pháp hóa học và sinh học.
Tuy nhiên, khi xử lý phế liệu tôm để thu chitin và chitosan thì sử dụng acid và bazo sẽ phần nào gây ảnh hưởng môi trường, tăng chi phí xử lý nước thải nhưng chỉ thu được một phần thành phần hoá học có giá trị kinh tế trong đầu tôm. Từ đó đã có thêm nhiều nghiên cứu tách chiết carotenprotein trong qui trình sản xuất chintin bằng HCl, HCOOH, thu protein, tách chiết astaxanthin bằng phương pháp lên men lactic và enzyme nhằm nâng cao hiệu quả kinh tế.
1.2. Carotenprotein trong động vật thuỷ sản và một số phương pháp chiết rút
1.2.1. Carotenoid
Carotenoid là nhóm hợp chất màu được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm. Carotenoid tồn tại rộng rãi trong tự nhiên, tất cả chất màu của rau quả đều là nguồn hợp chất màu tốt. Carotenoid được sử dụng trong công nghiệp được tổng hợp bằng phương pháp hoá học, một lượng nhỏ được tách từ thực vật hay tảo. Tất cả sinh vật quang hợp ( bao gồm tảo thực vật và khuẩn tảo lục) và một số vi khuẩn không quang hợp và nấm tổng hợp carotenoid. Nhóm chất màu này tan trong chất béo bao gồm hơn 700 hợp chất tạo ra màu đỏ, cam, vàng. Carotenoid là một mạch hydrocabon dài gồm 40 nguyên tử cacbon và 2 vòng cuối [23].
Hai loại carotenoid được tìm thấy trong tự nhiên: ß – caroten, dẫn xuất oxy hoá của caroten như là lutein, violaxanthin, neoanxanthin, và zeanxanthin, được biết như là xanthophylls. Từ hàng trăm hợp chất carotenoid hiện diện trong tự nhiên, chỉ 50 có hoạt tính sinh học và chúng có thể được chia thành 2 nhóm, tiền vitamin A và không tiền vitamn A. Vitamin A có vai trò quan trọng cho sự phát triển, duy trì một
7
loạt biểu mô, tái sản xuất hệ thống miễn dịch, và đặc biệt trong vòng tái sinh tế bào tiếp nhận kích thích ánh sáng của thị giác. Carotenoid được biến đổi thành vitamin A khi cơ thể cần. Tiền vitamin A được tìm thấy trong lá xanh đậm hay vàng cam. Những màu tối hơn được liên kết với tiền vitamin này cao hơn.Từ những hợp chất không enzyme, với vai trò chống oxy hoá, một số chất khoáng, vitamin, carotenoid, và tannin có thể bị tách ra. Cả hai carotenoid là tiền vitamin A và không tiền vitamin A, như là lutein, zeaxanthin, và lycopene, có tác động ngăn ngừa ung thư. Từ những hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng này, sự ngăn chặn bệnh tật bị tách ra nơi mà các gốc tự do đóng vai trò chủ chốt như trong bệnh xơ vữa động mạch, đục thủy tnh thể, ...
Carotenoid là hợp chất kỵ nước, ưa dầu mỡ, không tan trong nước và tan trong các dung môi như acetone, alcohol và chloroform. Bởi vì carotenoid là chất màu tan trong chất béo phổ biến trong tự nhiên, chúng có ích bởi màu của chúng [23]
8
Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của carotenoid (a) xanthophylls; (A) zeaxanthin, (B) lutein, (C) beta – cryptoxnthin, (D) astaxanthin; (b) Carotenes; (E) neurosporene, (F) lycopene, (G) ß – carotene, (H) α – carotene [Reference: Britton et al]
1.2.2. Astaxanthin
Astaxanthin (3,3’ – dyhydroxy – ß – carotene – 4,4’ – dione) với công thức hoá hoc là C40H52O4, là chất màu đỏ, làm thay đổi màu của tôm hồng, tôm hùm, cua, các loài nhuyễn thể và giáp sát khác [28]. Ở nhiều loài động vật không xương sống, đặc biệt là ở động vật giáp xác, màu sắc rực rỡ ở lớp mô phía ngoài, của máu,
9
trứng và cơ thịt dưới da là kết quả của sự tương tác giữa carotenoid với protein. Loại carotenoid thường kết hợp với protein là ketocarotenoid, trong đó thường gặp nhất là astaxanthin và các hợp chất có chứa gốc này. Astaxanthin có khung cấu tạo gần giống ß – carotene nhưng tính chất hoá hoc lại khác nhau, nó có tính chống oxy hoá mạnh hơn nhiều các chất chống oxy hoá khác như ß – caroten và thậm chí cả α – tocopherol [21]. Astaxnthin là chất màu được tìm thấy ở động vật sống dưới nước, như là tôm hùm, cua, tôm. Một sự quan tâm trong sử dụng astaxanthin cho nuôi trồng cá và gia cầm được phát triển, chất màu này không tổng hợp bởi động vật và phải cho thêm vào khẩu phần ăn nhằm mục đích có màu hấp dẫn để tiêu thụ. Xanthophyll này có tính chống oxy hoá gấp 10 lần ß - carotene và 500 lần vitamin E. Ngoài ra, chất màu này được xem là quan trong trong việc phòng ngừa và chữa bệnh với đặc tính chống oxy hoá và chống lại gốc tự do. Trong sự sát nhập của astaxnthin trong thức ăn cho nuôi trồng thuỷ hải sản là kết quả của sự tạo màu cho cá hồi và loài giáp sát, vì vậy sự hiện diện của nó trong tôm, tôm hùm, cua và động vật có vỏ xương ngoài. Trong tự nhiên, astaxanthin được tìm thấy nhiều ở tảo Haematococus [20]. Astaxanthin tồn tại dưới 3 dạng: sterified, phân tử tự do, phân tử phức tạp với protein, carotenoprotein. Protein này thường tồn tại ở loài giáp sát [17]. Trong vỏ của loài giáp sát, lớp protein đan xen với lớp chitin nơi mà chúng cùng tồn tại [29]. Trong tự nhiên, astaxanthin thường kết hợp với các phân tử khác nhau. Nó thường tồn tại ở dạng phức chất với protein và tạo ra nhiều màu sắc ở nhiều động thực vật khác nhau. Ví dụ, nó là chromophore trong sắc xanh biển, xanh lá và vàng của tôm hùm. Có nhiều trường hợp, astaxanthin chỉ đơn giản hoà tan trong dầu mỡ của các phân tử phức tạp như lipoprotein ở trứng, cũng có thể kết hợp với các phân tử acid béo chẳng hạn bằng một liên kết hoá học thật sự và tạo thành ester [15]. Đúng với bản chất màu của carotenoid, astaxanthin được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược, mỹ phẩm, và công nghiệp thức ăn động vật. Ngoài ra, chúng được sử dụng rộng rãi trong việc tạo màu, làm bền vững thực phẩm bởi vì hoạt động của chúng như vitamin A và hoạt tính sinh học của chúng tốt cho sức
10
khoẻ, như là cũng cố hệ thống miễn dịch, giảm nguy cơ bệnh thoái hoá, đặc tính chống oxy hoá
1.2.3. Carotenprotein
1.2.3.1. Sự tồn tại của carotenoprotein:
Trong các loài động vật biển không xương sống, ketocaroten thường tồn tại ở dạng phức chất carotenoprotein. Phức chất này là sự kết hợp giữa caroenoid và protein, lipo-protein hay glycoprotein. Mặt khác, carotenprotein kết hợp chặt chẽ với các chất thuộc cấu trúc lớp da như: chitin, calcium cacbonate [8]. Sự tồn tại của carotenoprotein là nguyên nhân thay đổi sự hấp thu quang phổ, do đó phức chất thường có màu tía, màu lam, màu xanh lục, tương phản lại màu vàng và màu cam của carotenoid ở dạng tự do. Nhóm keto của carotenoid thường là astaxanthin hay cantaxanthin [27]. Carotenoprotein tồn tại 2 dạng chính: (1) carotenoid liên kết với lipoprotein hay glycoprotein, (2) carotenoid liên kết với một protein hay một glycoprotein. Phản ứng giữa các nhóm 4 và 4’ keto trong các vòng đầu mạch của axtaxanthin với các nhóm chức của protein là điều kiện tiên quyết để hình thành phức carotenoprotein giữa astaxanthin và protein.
1.2.3.2. Bản chất và tính chất chung của carotenoprotein
Bản chất của carotenoprotein
Qua một số protein thu được khi tinh chế carotenoprotein, người ta thấy rằng, các protein có mặt trong phân tử này thuộc nhiều nhóm khác nhau. Crustacyanin, loại protein màu xanh biển ở vỏ tôm hùm được tách ra sau khi loại nhóm carotenoid dường như là một protein thuần tuý chỉ gồm các gốc amino acid tạo thành. Ngoài ra, còn có cả thành phần carbonhydrate có chứa hexosamin và gốc đường không chứa nhóm amino chiếm 4,8% trọng lượng phân tử [16].
Tính chất chung của carotenoprotein
Carotenoid và carotenoprotein, cả hai dều được xem là chất màu tự nhiên và có hoạt tính sinh học như: chống oxy hoá, kháng khuẩn [26]. Phức hợp carotenoprotein tan trong nước và có tính bền vững. Trong một vài trường hợp, màu
11
sắc của nó bền đến về năm trong không khí ở điều kiện nhiệt độ phòng. Các carotenoid liên kết với protein ít bị oxy hoá hơn so với chúng ở dạng tự do. Carotenoid ở dạng tự do có màu vàng, cam hay đỏ. Tuy nhiên, trong cơ thể những loài động vật biển không xương sống, các phức hợp carotenorotein tạo nên nhiều màu khác nhau như: xanh lá cây, xanh dương và tía. Trong các loài giáp xác thuỷ sản có chứa 3 loại crustacyanine là α,ß vàγ- crustacyanine. Cả 3 loại này đều có astaxanthin và ở dạng nhóm liên kết. Trong đó, astaxanthin thường liên kết với các phân tử protein tạo thành phức hợp α- crustacyanin, hấp thụ cực đại ở bước sóng (λmax = 628 nm), có màu xanh đen đặc trưng thường thấy ở các loài thuỷ sản sống. Dưới tác dụng của nhiệt, liên kết trên bị phá huỷ và giải phóng astaxanthin tự do có màu đỏ cam (λmax = 480 nm).
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu:
Xác định hàm lượng protein hoà tan bằng phương pháp Bradford.(Bradford,
1976)
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Các thông số cơ bản của nguyên vật liệu dùng trong thí nghiệm
3.1.1. Biến đổi số đơn vị hoạt tính enzyme
Hoạt tính enzyme được khảo sát qua các thời gian bảo quản. Theo hình 3.1 thời gian bảo quản hoạt tính enzyme giảm dần.
Sau 1 tháng sử dụng, hoạt tính enzyme giảm 3.38% so với khi bắt đầu sử dụng, sau 2 tháng hoạt tính giảm 5,84% so với khi bắt đầu sử dụng và giảm 7,31% sau 3 tháng khi bắt đầu sử dụng. Theo kết quả khảo sát thì enzyme dạng lỏng có hoạt tính giảm nhanh hơn enzyme dạng bột. Shie – Jea Lin và cộng sự (2010) cho rằng hoạt tính enzyme vẫn giảm khi trữ đông ở 800C hay thấp hơn và protein enzyme bị biến tính bất thuận nghịch.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme : thời gian bảo quản và điều kiện bảo quản. Ở đây enzyme protease được bảo quản ở 40C, nhưng hoạt tính vẫn giảm. Do đó, nên sử dụng enzyme trong vòng 6 tháng kể từ ngày mở bao bì để đảm bảo hoạt tính enzyme vẫn ổn định và tiết kiệm được lượng enzyme cho vào. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này tận dụng lại enzyme của đề tài nghiên cứu trước, do đó thời gian bảo quản enzyme kéo dài làm cho hoạt tính enzyme giảm đáng kể. Vì vậy, trước mỗi thí nghiệm trong nghiên cứu này, enzyme luôn được xác định hoạt tính để đảm bảo nồng độ enzyme cho vào trước mỗi thí nghiệm và đảm bảo hoạt ổn định trong suốt tất cả các thí nghiệm.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease thương mại tegalase r660l để thu nhận chất màu astaxanthin ở dạng carotenoprotein từ phế liệu đầu tôm sú
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .....................................................................vi DANH MỤC BẢNG BIỂU................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH ẢNH .................................................................................vii CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ................................................................................ 3
1.1. Tổng quan về phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon ..............................3
1.1.1. Giới thiệu về tôm sú Penaeus monodon ...................................... 3
1.1.2. Phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon ...................................... 4
1.1.3. Tình hình xử lý đầu và vỏ tôm .................................................... 6
1.2. Carotenprotein trong động vật thuỷ sản và một số phương pháp chiết rút 7
1.2.1. Carotenoid ................................................................................. 7
1.2.2. Astaxanthin ................................................................................ 9
1.2.3. Caotenprotein ........................................................................... 11
1.2.4. Các ứng dụng astaxanthin: ...................................................... 13
1.3. Enzyme protease .......................................................................................15
1.3.1. Giới thiệu chung về enzyme protease ........................................ 15
1.3.2. Phân loại proease ..................................................................... 15 i
1.3.3. Tính chất chung của enzyme ................................................... 16
1.3.4. Yếu tố ảnh hưởng hoạt độ enzyme ............................................ 17
1.4. Quá trình thuỷ phân protein [4]...............................................................19
1.4.1. Khái niệm và bản chất của quá trình thuỷ phân protein: .......... 19
1.4.2. Các phương pháp thuỷ phân protein......................................... 19
1.5. Các nghiên cứu tách chiết carotenoprotein trong và ngoài nước: ........21
1.5.1. Các nghiên cứu trong nước:.....................................................21
1.5.2. Các nghiên cứu ngoài nước: .................................................... 24
CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 27 2.1. Nguyên liệu cứu:.........................................................................................27 2.1.1. Đầu tôm: ......................................................................................... 27 2.1.2. Enzyme protease: ............................................................................ 27 2.1.3. Hoá chất ......................................................................................... 27
2.2. công cụ và thiết bị .....................................................................................27
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.....................................................29
2.3.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................ 29
2.3.2. Bố trí thí nghiệm ...................................................................... 30
ii
Phế liệu đầu tôm trước khi được đưa vào thủy phân được xử lý theo thứ tự trình bày trong hình 2.2.............................................................................. 30
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu:.......................................................... 37
2.3.4. Xử lý số liệu: ............................................................................. 37
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 38 3.1. Các thông số cơ bản của nguyên vật liệu dùng trong thí nghiệm..................38 3.1.1. Biến đổi số đơn vị hoạt tính enzyme .................................................. 38 3.1.2. Thành phần nguyên liệu ................................................................... 39 Bảng 3.2. Thành phần nguyên liệu đầu tôm P.monodon ...................................... 39 3.2. Điểm pI của dịch thuỷ phân...........................................................................40
3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme prtotease Tegalase R660L ......................................................................................42
3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme protease Tegalase R660L...............................................................42
3.3.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid amin trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi acid amin .................................................................42
3.3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng astaxanthin thu nhận trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi astaxanthin...............................................45
3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) protease Tegalase R660L đến quá trình thuỷ phân..................................................48
iii
3.3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) protease Tegalase R660L đến hàm lượng acid amin thu được trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi acid amin...............................................................................48
3.3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzym) đến hàm lượng astaxanthin và hiệu suất thu hồi astaxanthin ........................................................52
3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thuỷ phân ............................. 57 3.3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin trong dịch thủy
phân ..................................................................................................................57
3.4. Tối ưu hoá nhiệt độ và thời gian thuỷ phân phế liệu đầu tôm để thu sản phẩm bột carotenoprotein ...............................................................................................60
3.4.1. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân .................... 61 3.4.2. Xác định chỉ tiêu tối ưu của quá trình thuỷ phân................................ 61
3.4.3. Thiết lập phương trình hồi qui của hàm lượng acid amin AP và xác định nhiệt dộ và thời gian tối ưu của quá trình thuỷ phân thu nhận carotenoprotein. ................ ........................................................................................................ 62
3.4.3.1 Thiết lập phương trình hồi qui và phân tích ảnh hưởng của nồng độ, nhiệt độ và thời gian tới thu hồi hàm lượng acid amin ....................................62
3.4.3.2. Thiết lập phương trình hồi qui và phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tới thu hồi astaxanthin......................................................................65
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 70
4.1. Kết luận..........................................................................................................70
iv
4.2. Kiến nghị........................................................................................................70
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................. 73
PHỤ LỤC
v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
C Nồng độ enzyme Tg Thời gian
T Nhiệt độ
AP Hàm lượng acid amin
AsP Hàm lượng astaxanthin
EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1: Đặc tính của enzyme protease Tegalase R660L............................. 27 Bảng 3.1. Thành phần nguyên liệu đầu tôm P.monodon (tính trên nguyên liệu
khô) .................................................................................................................. 39 Bảng 3.2: Khoảng biến thiên của các yếu tố cần tối ưu khi thuỷ phân đầu tôm61
Bảng 3.3. Thông số nhiệt độ và thời gian tối ưu của quá trình thu nhận bột carotenoprotein................................................................................................ 67
Bảng 3.4: Thành phần hóa học trong bột carotenoprotein.............................. 68
vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Sản lượng nuôi trồng và khai thác thuỷ sản Việt Nam ...............................5
Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của carotenoid .................................................................9
Hình 2.1. Nội dung nghiên cứu.................................................................................29
Hình 2.2. Chuẩn bị đầu tôm ......................................................................................30
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thuỷ phân phế liệu đầu tôm.............34
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ enzyme dùng thuỷ phân phế liệu đầu tôm.............................................................................................................................36
Hình 3.3. Hàm lượng acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau................42
Hình 3.4. Hàm lượng acid amin của dịch thủy phân theo nhiệt độ ở thời gian thủy phân là 6 giờ..............................................................................................................43
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau...................................................................................................................44
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi protein ở các nhiệt độ thủy phân sau 6 giờ thủy phân.............................................................................................................44
Hình 3.7. Hàm lượng astaxanthin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau ............46
...................................................................................................................................46
Hình 3.8. Hàm lượng astaxanthin sau 6 giờ thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau....46
Hình 3.9. Hiệu suất thu hồi astaxanthin qua các thời gian thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau...................................................................................................................47
vii
Hình 3.10. Hiệu suất thu hồi astaxanthin sau 6 giờ thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau. ..........................................................................................................................47
Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện hàm lượng astaxanthin và acid amin của dịch thuỷ phân sau 6 giờ với hoạt độ enzyme là 20UI ở các nhiệt độ khác nhau..............................48
Hình 3.12. Hàm lượng acid amin theo thời gian ở các các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau...................................................................................................................49
Hình 3.13. Hàm lượng acid amin sau 6 giờ thuỷ phân theo các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau .....................................................................................................50
Hình 3.14. Hiệu suất thu hồi protein theo thời gian ở các các số đơn vị hoạt độ khác nhau ...........................................................................................................................51
Hình 3.15. Hiệu suất thu hồi protein sau 6 giờ thủy phân ........................................51
Hình 3.16. Hàm lượng astaxanthin theo thời gian ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau...................................................................................................................53
Hình 3.17. Hàm lượng astaxanthin thu được trong bột nhão carotenoprotein từ dịch thủy phân sau 6 giờ thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau .............54
Hình 3.18. Hiệu suất thu hồi astaxanthin trong bột nahxo caroteinoprotein từ dịch thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau..............................................55
Hình 3.19. Hiệu suất thu hồi astaxanthin trong bột nhão carotenoprotein từ dịch thủy phân phân sau 6 giờ thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau.....55
Hình 3.20. Hàm lượng acid amin và astaxanthin của dịch thuỷ phân sau 6 giờ với các số đơn vị hoạt độ khác nhau, 550C .....................................................................56
viii
Hình 3.21. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin thu được khi thủy phân ở 30UI và 550C.................................................................................................58
Hình 3.22. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng astaxanthin thu được khi thủy phân ở 30UI và 550C.................................................................................................59
Hình 3.23. Bề mặt đáp ứng của hàm AP ở nồng độ C= 5% .....................................64 Hình 3.24. Bề mặt đáp ứng của hàm AsP ở nồng độ enzyme C= 5% ......................66 Hình 4.1. Quy trình thu nhận bột nahxo carotenoprotein ....................................... 72
ix
ĐẶT VẤN ĐỀ
MỞ ĐẦU
Astaxanthin được biết đến là một chất chống oxy hoá mạnh với năng lượng chống oxy hoá gấp 10 lần so với ß- carotene và 500 lần so với vitamin E.[23]. Chính vì lý do này, hiện nay, chất màu này được sử dụng nhiều trong y học, thực phẩm, mỹ phẩm và cả trong thức ăn thuỷ sản, đặc biệt là thức ăn cho cá hồi. Tính đến hiện tại, astaxanthin chủ yếu được thu nhận từ tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Phaffia. Và những năm gần đây, lớp vỏ của các loài giáp sát được chú ý đến trong các nghiên cứu chiết rút astaxanthin, đặc biệt là phế liệu đầu và vỏ tôm.
Ngày nay, ngành chế biến tôm đông lạnh xuất khẩu là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn, tạo ra nhiều công ăn việc làm và mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước. Cùng với sự phát triển của nền kinh tế trong và ngoài nước, ngành thủy sản trong những năm gần đây đã đạt được những thành tựu đáng kể về nuôi trồng, chế biến cũng như xuất khẩu. Trong công nghệ chế biến thủy sản xuất khẩu của Việt Nam, tỷ lệ các mặt hàng giáp xác đông lạnh chiếm từ 70 – 80% sản lượng chế biến. Trong các mặt hàng xuất khẩu của nước ta thì mặt hàng tôm xuất khẩu luôn chiếm tỷ lệ lớn, chiếm hơn 50% tổng kim ngạch xuất khẩu. Cùng với khối lượng tôm xuất khẩu hằng năm thì phế thải liệu của nó bao gồm đầu và vỏ tôm cũng khá lớn. Thông thường đầu tôm chiếm 25 – 40% so với khối lượng toàn cơ thể thì cùng với lượng tôm xuất khẩu năm 2016 là 6.7 triệu tấn sẽ suy ra được lượng phế liệu đầu tôm là 1 – 3 triệu tấn được thải ra trong quá trình chế biến. Trong phế liệu đầu tôm chứa một lượng lớn protein, chitin, chất màu astaxanthin và một số hợp chất sinh học khác. Tuy nhiên, hiện nay phế liệu đầu tôm chỉ được sử dụng chủ yếu để làm thức ăn gia súc, một phần nhỏ để sản xuất chitin. Đây là một cách tận thu phế liệu mang lại hiệu quả kinh tế nhưng không mang lại hiệu quả cao. Vì vậy, cần thiết phải có nhiều nghiên cứu hơn nữa để tìm ra hướng sử dụng nguồn phế liệu này hiệu quả hơn, mang lại lợi ích kinh tế, kỹ thuật và môi trường. Và hiện nay cũng đã có nhiều nghiên cứu về việc chiết rút astaxanthin từ nguồn phế liệu tôm bằng việc thuỷ phân bằng tác nhân hoá học hay trích ly astaxanthin bằng dung môi
1
....Tuy vậy, các tác nhân hoá học ảnh hưởng đến chất lượng màu của sản phẩm cũng như không thể sử dụng làm thực phẩm cho người.
Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong việc thuỷ phân phế liệu tôm sú Penaeus monodon nhằm tận thu astaxanthin ở dạng bột carotenprotein cho mục đích thực phẩm” được tiến hành với mong muốn nâng cao hiệu suất thu được astaxanthin với sự có mặt của protein hoà tan để có thể ứng dụng vào mỹ phẩm, thực phẩm.
MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
Mục đích chung của đề tài này nhằm xác định các thông số của quá trình thủy phân để nâng cao hiệu suất thu nhận carotenprotein cao nhất và bước đầu thăm dò điều kiện thủy phân tối ưu dựa vào bề mặt đáp ứng.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Để đạt được mục tiêu đề ra, chúng tui thực hiện các bước nghiên cứu như sau:
+ Khảo sát điểm pH có thể tủa carotenprotein nhiều nhất.
+ Khảo sát các điều kiện của quá trình thuỷ phân (nồng độ enzyme, nhiệt
độ và thời gian thủy phân).
+ Bước đầu tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian thủy phân dựa vào bề mặt đáp ứng.
+ Xác định các thông số của bột nhão carotenprotein: màu sắc, mùi, hàm lượng astaxanthin.
2
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon
1.1.1. Giới thiệu về tôm sú Penaeus monodon
Tôm sú (Tên Tiếng Anh: Giant/ Black Tiger Shrimp) được định loại là: Ngành: Arthropoda – Ngành chân khớp
Lớp: Crusstacea – Lớp giáp xác
Bộ: Decaoda – Bộ mười chân
Họ chung: Penaeidea
Họ: Penaeus Fabricius
Giống: Penaeus
Loài: Monodon
Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius
Cấu tạo của tôm gồm 2 phần: phần đầu và phần thân. Hầu hết các cơ quan nằm ở phần đầu ngực, phần thân chỉ có ruột và động mạch chủ, thịt tôm nằm gần như hoàn toàn ở thân. Vỏ tôm thường được tạo thành từ nhiều lớp protein, khoáng, lipid bao phủ khung chitin. Toàn bộ lớp vỏ này không sinh trưởng vì vậy tôm phải lột xác từng thời kì sinh trưởng của bản thân. Dưới lớp vỏ là lớp biểu bì có vai trò quan trọng trong việc lột xác bỏ lớp vỏ cũ và hình thành lớp vỏ mới của tôm. Kề trong lớp biểu bì là lớp trung bì có chứa sắc tố chủ yếu là astaxanthin. Chính nhờ sự biến đổi của sắc tố này mà ta có thể phân biệt được chất lượng tôm. Phần đầu thường chiếm khoảng 35 – 45% trọng lượng, phần vỏ chiếm 10 – 15% trọng lượng. Tỷ lệ các phần đầu, thân, vỏ luôn thay đổi phụ thuộc vào giống loài.
Vỏ tôm được cấu tạo từ một phức hợp chitin – protein liên kết với một số hợp chất hữu cơ khác (astaxanthin, lipid), bị hóa cứng do kết hợp với canxi cacbonat. Chitin là các loại polysaccharide phổ biến trong tự nhiên chỉ sau cellulose. Nó được cấu tạo bởi các cầu nối 1,4 glucozit. Ngoài lớp màng sáp bao phủ bên ngoài lớp vỏ epicuticle, lipid còn tồn tại dưới dạng phức chất sterol- protein chứa trong lớp
3
endocuticle. Bên cạnh các thành phần trên, trong phế liệu đầu và vỏ tôm chứa lượng lớn protein. Protein trong vỏ tôm thường là loại protein không hòa tan, liên kết với lớp vỏ chitin bởi liên kết cộng hóa trị bền vững tương tự như liên kết giữa các phân tử amino acid với nhau trong phân tử protein. Do đó nó không bị tách ra khỏi vỏ tôm. Thành phần trong vỏ tôm mà đề tài quan tâm nhất, đó là astaxanthin. Chất này có màu xanh, và liên kết với protein, khi gia nhiệt, chúng chuyển thành carotenoprotein có màu cam.
1.1.2. Phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon
Việt Nam nằm bên bờ Tây của Biển Đông, là một biển lớn của Thái Bình Dương, có diện tích khoảng 3.448.000 km2, có bờ biển dài 3260 km. Vùng nội thuỷ và lãnh hải rộng 226.000 km2, vùng biển đặc quyền kinh tế rộng hơn 1 triệu km2 với hơn 4.000 hòn đảo, tạo nên 12 vịnh, đầm phá với tổng diện tích 1.160km2 được che chắn tốt dễ trú đậu tàu thuyền. Biển Việt Nam có tính đa dạng sinh học khá cao, cũng là nơi phát sinh và phát tán của nhiều nhóm sinh vật biển vùng nhiệt đới ấn Độ - Thái Bình Dương với chừng 11.000 loài sinh vật đã được phát hiện. Bên cạnh đó, nước ta với hệ thống sông ngòi dày đặc và có đường biển dài rất thuận lợi phát triển hoạt động khai thác và nuôi trồng thủy sản. Sản lượng thủy sản Việt Nam đã duy trì tăng trưởng liên tục trong 17 năm qua với mức tăng bình quân là 9,07%/năm. Với chủ trương thúc đẩy phát triển của chính phủ, hoạt động nuôi trồng thủy sản đã có những bước phát triển mạnh, sản lượng liên tục tăng cao trong các năm qua, bình quân đạt 12,77%/năm, đóng góp đáng kể vào tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản của cả nước. Trong khi đó, trước sự cạn kiệt dần của nguồn thủy sản tự nhiên và trình độ của hoạt động khai thác đánh bắt chưa được cải thiện, sản lượng thủy sản từ hoạt động khai thác tăng khá thấp trong các năm qua, với mức tăng bình quân 6,42%/năm [1].
4
Hình 1.1. Sản lượng nuôi trồng và khai thác thuỷ sản Việt Nam
Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, tổng sản lượng thủy sản sản xuất năm 2016 đạt hơn 6,7 triệu tấn, tăng 2,5% so với năm 2015. Năm 2016, mặc dù tình hình hạn mặn và dịch bệnh làm ảnh hưởng nhiều tới nuôi tôm nước lợ trong 9 tháng đầu năm. Tuy nhiên, mưa nhiều trong những tháng cuối năm, độ mặn giảm...cùng với sự chỉ đạo sát sao của các cấp trong việc kiểm soát dịch bệnh nên sản lượng thu hoạch tăng vào những tháng cuối năm. Sản lượng tôm nước lợ cả nước ước đạt 650 nghìn tấn. Tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, diện tích tốm sú ước đạt 569.500 ha, sản lượng đạt 251 nghìn tấn. Diện tích tôm thẻ chân trắng ước đạt 64.440 ha, tăng 11,5% so với năm 2015, sản lượng ước đạt 253,1 nghìn tấn. Tính trên cả nước, trong những năm gần đây, diện tích và sản lượng tôm nuôi không ngừng tăng, đến năm 2015, diện tích nuôi tôm nước lợ đạt trên 700.000 ha với sản lượng trên 650.000 tấn. Bên cạnh diện tích nuôi trồng rộng lớn, số lượng doanh nghiệp tham gia chế biến và xuất khẩu cũng không ngừng gia tăng. Trên cả nước có khoảng 160 doanh nghiệp tham gia chế biến, xuất khẩu tôm, tập trung chủ yếu ở Miền Trung, Nam Trung Bộ (Khánh Hòa, Phú Yên, Ninh Thuận, Bà Rịa – Vũng Tàu...), Đồng
Bằng Sông Cửu Long (Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà
5
Mau, Kiên Giang), với tổng công suất chế biến đạt gần 1 triệu tấn sản phẩm/năm. Cùng với sự phát triển của ngành thuỷ hải sản, một lượng lớn đầu và vỏ tôm được thải ra môi trường, gây ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, đây lại là nguồn phế liệu chứa nhiều thành phần mang giá trị kinh tế cao: protein, chintin, astaxanthin.... Phế liệu tôm chủ yếu là đầu và mảnh vỏ, ngoài ra, còn có phần thịt vụn... tùy theo giống loài và phương pháp chế biến mà lượng phế liệu tôm có thể vượt quá 60% sản lượng tôm khai thác được. Ví dụ tôm càng xanh, phê liệu chiếm khoảng 60% khối lượng toàn bộ, với tôm sú thì phế liệu chiếm 40% [1].
1.1.3. Tình hình xử lý đầu và vỏ tôm
Trước đây vấn đề xử lý phụ phế phẩm tôm từ các cơ sở chế biến, các công ty gặp nhiều khó khăn, chủ yếu đem đỗ bỏ. Gần đây phụ phế phẩm tôm đã được dùng làm thức ăn cho gia súc, góp phần làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên phương pháp này không đem lại hiệu quả kinh tế cao, việc làm thức ăn đòi hỏi phải sấy mà quá trình này không làm giảm khoáng và chitin, 2 chất này gây khó tiêu cho gia súc.
Vì vậy người ta hướng đến một giải pháp mới là sản xuất Chitin – Chitosan. Chất Chitin- Chitosan chứa trong vỏ tôm là một loại nguyên liệu có thể ứng dụng cho nhiều ngành kinh tế. Theo đó, phế liệu tôm được thu gom tại các cơ sở chế biến đông lạnh, sau khi rửa sạch, sấy khô được đưa vào nồi phản ứng để loại bỏ muối vô cơ (muối can xi, muối phốt pho) và các protein. Sản phẩm thu được từ công đoạn này có tên là chitin; sau đó lại được đưa vào ngâm trong dung dịch kiềm khoảng 2 giờ sẽ cho ra một chất mới là Chitosan. Theo một số nhà khoa học, Chitosan có khả năng khống chế sự gia tăng của tế bào ung thư; đã được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả khá cao trong công nghệ bào chế dược phẩm (làm thuốc chữa bỏng (phỏng), thuốc giảm đau, hạ cholesterol, thuốc chữa bệnh dạ dày, thuốc chữa chứng đau xương khớp, chống viêm cấp trên mô lành...). Một số kết quả nghiên cứu của các bạn sĩ ở Bệnh viện K Hà Nội, Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Hóa học những năm gần đây đã chứng minh những tác dụng đó của chất Chitosan trong vỏ tôm. Và trên thị trường dược phẩm hiện nay, loại thuốc chữa bệnh khớp làm từ vỏ tôm có tên
6
Glucosamin ngày càng được sử dụng rộng rãi do ít gây tác dụng phụ. Ngoài ra, chất Chitosan cũng được ứng dụng trong một số ngành công nghiệp: hóa chất, mỹ phẩm, xử lý nước thải...Các nhà nghiên cứu trên thế giới từ lâu đã quan tâm đến lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan, protein và carotenoid từ phế liệu tôm bằng nhiều phương pháp như phương pháp hóa học, phương pháp sinh học hay kết hợp giữa phương pháp hóa học và sinh học.
Tuy nhiên, khi xử lý phế liệu tôm để thu chitin và chitosan thì sử dụng acid và bazo sẽ phần nào gây ảnh hưởng môi trường, tăng chi phí xử lý nước thải nhưng chỉ thu được một phần thành phần hoá học có giá trị kinh tế trong đầu tôm. Từ đó đã có thêm nhiều nghiên cứu tách chiết carotenprotein trong qui trình sản xuất chintin bằng HCl, HCOOH, thu protein, tách chiết astaxanthin bằng phương pháp lên men lactic và enzyme nhằm nâng cao hiệu quả kinh tế.
1.2. Carotenprotein trong động vật thuỷ sản và một số phương pháp chiết rút
1.2.1. Carotenoid
Carotenoid là nhóm hợp chất màu được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm. Carotenoid tồn tại rộng rãi trong tự nhiên, tất cả chất màu của rau quả đều là nguồn hợp chất màu tốt. Carotenoid được sử dụng trong công nghiệp được tổng hợp bằng phương pháp hoá học, một lượng nhỏ được tách từ thực vật hay tảo. Tất cả sinh vật quang hợp ( bao gồm tảo thực vật và khuẩn tảo lục) và một số vi khuẩn không quang hợp và nấm tổng hợp carotenoid. Nhóm chất màu này tan trong chất béo bao gồm hơn 700 hợp chất tạo ra màu đỏ, cam, vàng. Carotenoid là một mạch hydrocabon dài gồm 40 nguyên tử cacbon và 2 vòng cuối [23].
Hai loại carotenoid được tìm thấy trong tự nhiên: ß – caroten, dẫn xuất oxy hoá của caroten như là lutein, violaxanthin, neoanxanthin, và zeanxanthin, được biết như là xanthophylls. Từ hàng trăm hợp chất carotenoid hiện diện trong tự nhiên, chỉ 50 có hoạt tính sinh học và chúng có thể được chia thành 2 nhóm, tiền vitamin A và không tiền vitamn A. Vitamin A có vai trò quan trọng cho sự phát triển, duy trì một
7
loạt biểu mô, tái sản xuất hệ thống miễn dịch, và đặc biệt trong vòng tái sinh tế bào tiếp nhận kích thích ánh sáng của thị giác. Carotenoid được biến đổi thành vitamin A khi cơ thể cần. Tiền vitamin A được tìm thấy trong lá xanh đậm hay vàng cam. Những màu tối hơn được liên kết với tiền vitamin này cao hơn.Từ những hợp chất không enzyme, với vai trò chống oxy hoá, một số chất khoáng, vitamin, carotenoid, và tannin có thể bị tách ra. Cả hai carotenoid là tiền vitamin A và không tiền vitamin A, như là lutein, zeaxanthin, và lycopene, có tác động ngăn ngừa ung thư. Từ những hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng này, sự ngăn chặn bệnh tật bị tách ra nơi mà các gốc tự do đóng vai trò chủ chốt như trong bệnh xơ vữa động mạch, đục thủy tnh thể, ...
Carotenoid là hợp chất kỵ nước, ưa dầu mỡ, không tan trong nước và tan trong các dung môi như acetone, alcohol và chloroform. Bởi vì carotenoid là chất màu tan trong chất béo phổ biến trong tự nhiên, chúng có ích bởi màu của chúng [23]
8
Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của carotenoid (a) xanthophylls; (A) zeaxanthin, (B) lutein, (C) beta – cryptoxnthin, (D) astaxanthin; (b) Carotenes; (E) neurosporene, (F) lycopene, (G) ß – carotene, (H) α – carotene [Reference: Britton et al]
1.2.2. Astaxanthin
Astaxanthin (3,3’ – dyhydroxy – ß – carotene – 4,4’ – dione) với công thức hoá hoc là C40H52O4, là chất màu đỏ, làm thay đổi màu của tôm hồng, tôm hùm, cua, các loài nhuyễn thể và giáp sát khác [28]. Ở nhiều loài động vật không xương sống, đặc biệt là ở động vật giáp xác, màu sắc rực rỡ ở lớp mô phía ngoài, của máu,
9
trứng và cơ thịt dưới da là kết quả của sự tương tác giữa carotenoid với protein. Loại carotenoid thường kết hợp với protein là ketocarotenoid, trong đó thường gặp nhất là astaxanthin và các hợp chất có chứa gốc này. Astaxanthin có khung cấu tạo gần giống ß – carotene nhưng tính chất hoá hoc lại khác nhau, nó có tính chống oxy hoá mạnh hơn nhiều các chất chống oxy hoá khác như ß – caroten và thậm chí cả α – tocopherol [21]. Astaxnthin là chất màu được tìm thấy ở động vật sống dưới nước, như là tôm hùm, cua, tôm. Một sự quan tâm trong sử dụng astaxanthin cho nuôi trồng cá và gia cầm được phát triển, chất màu này không tổng hợp bởi động vật và phải cho thêm vào khẩu phần ăn nhằm mục đích có màu hấp dẫn để tiêu thụ. Xanthophyll này có tính chống oxy hoá gấp 10 lần ß - carotene và 500 lần vitamin E. Ngoài ra, chất màu này được xem là quan trong trong việc phòng ngừa và chữa bệnh với đặc tính chống oxy hoá và chống lại gốc tự do. Trong sự sát nhập của astaxnthin trong thức ăn cho nuôi trồng thuỷ hải sản là kết quả của sự tạo màu cho cá hồi và loài giáp sát, vì vậy sự hiện diện của nó trong tôm, tôm hùm, cua và động vật có vỏ xương ngoài. Trong tự nhiên, astaxanthin được tìm thấy nhiều ở tảo Haematococus [20]. Astaxanthin tồn tại dưới 3 dạng: sterified, phân tử tự do, phân tử phức tạp với protein, carotenoprotein. Protein này thường tồn tại ở loài giáp sát [17]. Trong vỏ của loài giáp sát, lớp protein đan xen với lớp chitin nơi mà chúng cùng tồn tại [29]. Trong tự nhiên, astaxanthin thường kết hợp với các phân tử khác nhau. Nó thường tồn tại ở dạng phức chất với protein và tạo ra nhiều màu sắc ở nhiều động thực vật khác nhau. Ví dụ, nó là chromophore trong sắc xanh biển, xanh lá và vàng của tôm hùm. Có nhiều trường hợp, astaxanthin chỉ đơn giản hoà tan trong dầu mỡ của các phân tử phức tạp như lipoprotein ở trứng, cũng có thể kết hợp với các phân tử acid béo chẳng hạn bằng một liên kết hoá học thật sự và tạo thành ester [15]. Đúng với bản chất màu của carotenoid, astaxanthin được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược, mỹ phẩm, và công nghiệp thức ăn động vật. Ngoài ra, chúng được sử dụng rộng rãi trong việc tạo màu, làm bền vững thực phẩm bởi vì hoạt động của chúng như vitamin A và hoạt tính sinh học của chúng tốt cho sức
10
khoẻ, như là cũng cố hệ thống miễn dịch, giảm nguy cơ bệnh thoái hoá, đặc tính chống oxy hoá
1.2.3. Carotenprotein
1.2.3.1. Sự tồn tại của carotenoprotein:
Trong các loài động vật biển không xương sống, ketocaroten thường tồn tại ở dạng phức chất carotenoprotein. Phức chất này là sự kết hợp giữa caroenoid và protein, lipo-protein hay glycoprotein. Mặt khác, carotenprotein kết hợp chặt chẽ với các chất thuộc cấu trúc lớp da như: chitin, calcium cacbonate [8]. Sự tồn tại của carotenoprotein là nguyên nhân thay đổi sự hấp thu quang phổ, do đó phức chất thường có màu tía, màu lam, màu xanh lục, tương phản lại màu vàng và màu cam của carotenoid ở dạng tự do. Nhóm keto của carotenoid thường là astaxanthin hay cantaxanthin [27]. Carotenoprotein tồn tại 2 dạng chính: (1) carotenoid liên kết với lipoprotein hay glycoprotein, (2) carotenoid liên kết với một protein hay một glycoprotein. Phản ứng giữa các nhóm 4 và 4’ keto trong các vòng đầu mạch của axtaxanthin với các nhóm chức của protein là điều kiện tiên quyết để hình thành phức carotenoprotein giữa astaxanthin và protein.
1.2.3.2. Bản chất và tính chất chung của carotenoprotein
Bản chất của carotenoprotein
Qua một số protein thu được khi tinh chế carotenoprotein, người ta thấy rằng, các protein có mặt trong phân tử này thuộc nhiều nhóm khác nhau. Crustacyanin, loại protein màu xanh biển ở vỏ tôm hùm được tách ra sau khi loại nhóm carotenoid dường như là một protein thuần tuý chỉ gồm các gốc amino acid tạo thành. Ngoài ra, còn có cả thành phần carbonhydrate có chứa hexosamin và gốc đường không chứa nhóm amino chiếm 4,8% trọng lượng phân tử [16].
Tính chất chung của carotenoprotein
Carotenoid và carotenoprotein, cả hai dều được xem là chất màu tự nhiên và có hoạt tính sinh học như: chống oxy hoá, kháng khuẩn [26]. Phức hợp carotenoprotein tan trong nước và có tính bền vững. Trong một vài trường hợp, màu
11
sắc của nó bền đến về năm trong không khí ở điều kiện nhiệt độ phòng. Các carotenoid liên kết với protein ít bị oxy hoá hơn so với chúng ở dạng tự do. Carotenoid ở dạng tự do có màu vàng, cam hay đỏ. Tuy nhiên, trong cơ thể những loài động vật biển không xương sống, các phức hợp carotenorotein tạo nên nhiều màu khác nhau như: xanh lá cây, xanh dương và tía. Trong các loài giáp xác thuỷ sản có chứa 3 loại crustacyanine là α,ß vàγ- crustacyanine. Cả 3 loại này đều có astaxanthin và ở dạng nhóm liên kết. Trong đó, astaxanthin thường liên kết với các phân tử protein tạo thành phức hợp α- crustacyanin, hấp thụ cực đại ở bước sóng (λmax = 628 nm), có màu xanh đen đặc trưng thường thấy ở các loài thuỷ sản sống. Dưới tác dụng của nhiệt, liên kết trên bị phá huỷ và giải phóng astaxanthin tự do có màu đỏ cam (λmax = 480 nm).
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu:
Xác định hàm lượng protein hoà tan bằng phương pháp Bradford.(Bradford,
1976)
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Các thông số cơ bản của nguyên vật liệu dùng trong thí nghiệm
3.1.1. Biến đổi số đơn vị hoạt tính enzyme
Hoạt tính enzyme được khảo sát qua các thời gian bảo quản. Theo hình 3.1 thời gian bảo quản hoạt tính enzyme giảm dần.
Sau 1 tháng sử dụng, hoạt tính enzyme giảm 3.38% so với khi bắt đầu sử dụng, sau 2 tháng hoạt tính giảm 5,84% so với khi bắt đầu sử dụng và giảm 7,31% sau 3 tháng khi bắt đầu sử dụng. Theo kết quả khảo sát thì enzyme dạng lỏng có hoạt tính giảm nhanh hơn enzyme dạng bột. Shie – Jea Lin và cộng sự (2010) cho rằng hoạt tính enzyme vẫn giảm khi trữ đông ở 800C hay thấp hơn và protein enzyme bị biến tính bất thuận nghịch.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme : thời gian bảo quản và điều kiện bảo quản. Ở đây enzyme protease được bảo quản ở 40C, nhưng hoạt tính vẫn giảm. Do đó, nên sử dụng enzyme trong vòng 6 tháng kể từ ngày mở bao bì để đảm bảo hoạt tính enzyme vẫn ổn định và tiết kiệm được lượng enzyme cho vào. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này tận dụng lại enzyme của đề tài nghiên cứu trước, do đó thời gian bảo quản enzyme kéo dài làm cho hoạt tính enzyme giảm đáng kể. Vì vậy, trước mỗi thí nghiệm trong nghiên cứu này, enzyme luôn được xác định hoạt tính để đảm bảo nồng độ enzyme cho vào trước mỗi thí nghiệm và đảm bảo hoạt ổn định trong suốt tất cả các thí nghiệm.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links