girl_ngongcuong
New Member
Download miễn phí Tách chiết và tinh sạch protein
1.2.2.Phân lập các enzyme hòa tan
cách quan trọng đểphân tách enzyme hòa tan nhanh và hiệu quảsau khi
phá vỡtếbào là làm lạnh, dùng dung dịch đệm thích hợp, và có sựhiện diện của
các tác nhân bảo vệenzyme nhưmercapthoethanol (cần thiết để ổn định một số
dung dịch enzyme).
Thường các nhân tố ức chếprotein phải được bổsung đểlàm giảm ảnh hưởng
phân hủy của protease. Các enzyme hòa tan có thể được thu thập bằng phương
pháp lọc qua màng hay bằng cách ly tâm. Phương pháp sau tương đối dễthực
hiện ởquy mô phòng thí nghiệm với các lực ly tâm tốc độcao. Các lực gcao như
thếkhông thể đạt được ởcác thiết bịquy mô sản xuất lớn. Các máy ly tâm lớn
thường được cấu tạo từcác hợp kim titanium đắt tiền đểchịu đựng các lực g cao,
nhưng mặc dù thếchỉcó thểthu được các lực g không cao lắm mà thôi. Đểkhắc
phục điều này, các chất kết tủa nucleoprotein và protein, nhưpolyethyleneimine,
được bổsung vào các chất đồng hóa tếbào đểkết bông các nguyên liệu không
mong muốn và giảm thời gian lắng xuống nhanh hơn
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
ocalteau) vớiphức hợp đồng - protein. Phức màu xanh tạo thành có thể đo ở bước sóng 675nm.
Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein. Dựa vào đồ
thị chuẩn protein (thông thường dùng tinh thể albumin huyết thanh bò) ta có thể
tính được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
Phương pháp Lowry được dùng rộng rãi để xác định nhiều loại protein khác nhau.
Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện được protein trong dung dịch
ở nồng độ 1µg/ml. Tuy nhiên cường độ màu còn tuỳ từng trường hợp nhiều vào loại protein.
Ví dụ, ở cùng một nồng độ, dung dịch trypsin cho cường độ màu cao gấp 3 lần
gelatin, hemoglobin cho cường độ màu thấp hơn trypsin nhưng cao hơn gelatin.
Ngoài ra, nhiều chất khác có thể làm tăng hay giảm cường độ màu phản ứng, vì
vậy phương pháp này cho kết quả chính xác khi xác định protein đã được tinh
sạch.
- Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ:
Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch là độ hấp thụ tia
cực tím của nó. Nếu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo
giá trị đo được. Nếu protein không tinh sạch (ví dụ, dịch chiết từ một sắc ký) thì
nồng độ của protein tổng được tính tương đối từ độ hấp thụ. Nguyên tắc của
phương pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280nm do
các acid amin thơm như tryptophan, tyrosine và phenylalanine. Độ hấp thụ ở
280nm thay đổi tuỳ loại protein nhưng hệ số tắt đo được (nghĩa là độ hấp thụ của
dung dịch protein 1% với đường sóng truyền qua 1cm) cho mỗi protein cho phép
tính nồng độ của protein tinh sạch.
Với một hỗn hợp các protein hay với bất cứ một loai protein nào mà không biết hệ
số tắt thì nồng độ protein được tính như sau:
Nồng độ protein (mg/ml)=1,55xA280-0,77xA260
Trong đó: A280: độ hấp thụ ở bước sóng 280nm
A260: độ hấp thụ ở bước sóng 260nm
Phương pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp hơn
0,1mg/ml hay khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím (ví
dụ, đệm, acid nucleic và một số chất béo), hay khi protein ở trong dịch truyền phù
chứ không phải trong dung dịch. (Ví dụ, trong màng hay các phức hợp có trọng
lượng phân tử lớn). Cũng cần chú ý là nếu tỷ lệ
A280/A260 thấp hơn 0,6 nghĩa là dung dịch
protein chưa sạch, bị lẫn các chất khác, đặc biệt với acid nucleic thì nên sử dụng
phương pháp Lowry để đo nồng độ protein.
Vì vậy, phương pháp đo độ hấp thụ tia cực tím thường được dùng để định lượng
protein đã tinh sạch hay để xác định protein trong các phân đoạn nhận được khi
sắc ký tách các protein qua cột.
5.2. Đánh giá tính đồng thể của protein:
Khi đã nhận được một protein enzyme ở trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại
mức độ tinh khiết hay tính đồng thể của nó. Độ đồng thể của chế phẩm protein
enzyme phải được kiểm tra bằng một số phương pháp dựa trên những nguyên lý
khác nhau. Trong một số trường hợp protein enzyme được coi là đồng thể khi ly
tâm, nhưng lại có thể phân chia thành một số isoenzyme bằng phương pháp điện di
trên gel. Chính vì vậy, nếu dùng nhiều loại phương pháp khác nhau để kiểm tra độ
sạch của protein mà kết quả đều đánh giá là đồng thể thì protein đó có thể được công
nhận là tinh khiết. Những phương pháp để kiểm tra tính đồng thể hay dùng là xây
dựng đồ thị về độ hoà tan, điện di và siêu ly tâm.
- Phương pháp kiểm tra tính đồng thể (hay còn gọi là tính đồng nhất) của protein
đơn giản và nhạy nhất là xây dựng đường biểu diễn về độ hoà tan.
Cách làm như sau: Trong hàng loạt mẫu dùng một thể tích không đổi một loại dung
môi (nước hay dung dịch muối) lắc với những số lượng enzyme khác nhau. Sau
đó lọc và xác định số protein trong dịch lọc. Cuối cùng xây dựng đường đồ thị.
Trong những loại mẫu đầu, tất cả các protein thêm vào bị hoà tan và số lượng
protein thêm vào bằng số lượng protein có trong dịch lọc hay dịch ly tâm. Kết quả
nhận được biểu diễn là một đường thẳng. Sau đó dung dịch đạt được bão hoà. Nếu
protein đem hoà tan là tinh khiết nghĩa là đồng nhất thì khi thêm protein trong dịch
lọc sẽ không tăng lên và đường biểu diễn có một điểm uốn. Nếu trong mẫu có một
protein thứ hai thì sau khi đạt được độ bão hoà đối với protein ít hoà tan hơn, loại
protein thứ hai còn có thể hoà tan được nữa.
Kết quả là có một điểm bão hoà thứ hai và đường biểu diễn có hai điểm uốn. Nếu
dịch chiết (hỗn hợp) có nhiều protein enzyme thì sẽ có nhiều điểm uốn. Phương
pháp này được Northrop và Kunitz sử dụng rất có kết quả. Nay vẫn còn ứng dụng
nhiều.
- Phương pháp thứ hai để xác định độ đồng thể của protein enzyme là phương pháp
điện di. Phương pháp điện di là ứng dụng tính chất lưỡng tính của protein, dựa trên
cơ sở dịch chuyển của các tiểu phần chế phẩm protein enzyme mang điện trong
điện trường. Đem chế phẩm protein enzyme điện di ở pH và lực ion nhất định. Nếu
trên điện di đồ có một băng protein thì chứng tỏ protein enzyme đó là đơn thể. Nếu
có hai băng chứng tỏ có hai protein enzyme trong chế phẩm đó. Bản điện di đồ này
được đua vào máy detector để phát hiện không chỉ nồng độ của băng điện di mà
còn phát hiện được số lượng các băng vệt.
p=vahi&vie w=att&th=11d94e949413c887"
src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_
image012.jpg">
Hình 5.4: Đường biểu diễn độ hoà tan protein
- Phương pháp siêu ly tâm:
Đây cũng là phương pháp rất quan trọng để xác định tính đồng thể của protein
enzyme. Phương pháp được thực hiện như sau:
Dùng lực ly tâm rất lớn bằng cách tăng số vòng quay ly tâm lên hàng nghìn, hàng
vạn vòng trong một phút. Với tốc độ ly tâm rất lớn, người ta có thể tách ra được
các phân tử enzyme có trọng lượng phân tử khác nhau.
Tốc độ kết tủa của protein enzyme trong máy siêu ly tâm được xác định bằng trọng
lượng phân tử của nó. Khi dừng quay thì các phân tử protein lại khuyếch tán vào
dung dịch. Bởi vậy, cần quan sát tốc độ lắng trong quá trình siêu ly tâm.
Chính vì vậy, trong cốc siêu ly tâm, người ta gắn một thiết bị quang học đặc biệt,
vẽ các đường ánh sáng của kết quả phân tích lên một màn. Nếu trong dung dịch có
một loai protein enzyme (có một trọng lượng phân tử) thì trên màn sáng sẽ cho
đường đồ thị có một đỉnh. Nếu làm việc với hai protein enzyme thì sẽ có hai đỉnh
v.v...
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Hữu Chấn, Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Nghiêm Luật, Hoàng Bích Ngọc,
Vũ Thị Phương. 2001. Hoá sinh. Nxb Y học - Hà Nội.
2. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng. 1999. Hoá sinh học.Nxb Giáo dục - Hà
Nội.
3. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên. 1998. Giáo trình sinh hoá hiện đại.
Nxb Giáo dục - Hà Nội.
4. Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị
Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Du