sisi_hateyou

New Member
Download miễn phí Giáo trình Thí nghiệm Sinh học phân tử

Trong nuôi cấy invitro, một cách đơn giản và thường hay được sử dụng để tái sinh chồi invitro là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Hiểu một cách đúng nghĩa thì nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là sử dụng phần mô phân sinh ngọn với 3-4 tiền phát khởi lá, tức là các đỉnh sinh trưởng có kích thước từ 0,1 –0,15mm tính từ chóp sinh trưởng. Kỹ thuật này khá phức tạp, phải thực hiện dưới kính lúp và khả năng sống sót của mẫu cấy có kích thước nhỏ như thế thường không cao, do đó chỉ được tiến hành khi cần nuôi cấy với mục đích tạo các cây con invitro sạch virus.
Trên thực tế người ta thường nuôi cả đỉnh chồi non với kích thước khoảng vài mm. Đó có thể là đỉnh chồi ngọn hay đỉnh chồi nách. Mỗi đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay
nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triễn thành cây hoàn chỉnh. Xét về nguồn gốc của các cây đó, có thể có ba khả năng:
- Cây phát triễn từ chồi ngọn
- Cây phát triễn từ chồi nách phá ngủ
- Cây phát triễn từ chồi mới phát sinh, ví dụ: nuôi cấy đoạn trụ hạ diệp của cây mãng cầu (Annona squamosa) sẽ cho rất nhiều mầm (buds) trên mô cấy và một số mầm sau đó sẽ phát triễn thành chồi và sau đó sẽ thành cây invitro hoàn chỉnh. Tuy nhiên thông thường rất khó phân biệt chồi phá ngủ và chối mới phát sinh. Các cách phát triễn cây hoàn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy như sau:
BÀI 1:
MỞ ĐẦU
 ^ ! ^ 
1.CÁC THIẾT BỊ CƠ BẢN CỦA MỘT PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT
a. Phòng rửa và cất nước
- Máy cất nước 1 lần
- Máy cất nước 2 lần
b. Phòng hấp – sấy
- Autoclave
- Tủ sấy 60 – 200oC
c. Phòng chuẩn bị môi trường
- Cân phân tích (chính xác đến 0,0001 g)
- Cân kỹ thuật (chính xác đến 0,01 g)
- pH kế
- Máy khuấy từ
- Tủ lạnh
- Lò vi sóng (microwave)
d. Phòng thao tác nuôi cấy
- Tủ cấy vô trùng (laminar)
- Quạt thông gió
- Đèn tử ngoại treo tường
e. Phòng nuôi cây
- Các giàn kệ có gắn đèn huỳnh quang
- Máy điều hòa nhiệt độ
- Máy lắc nằm ngang
- Tủ ấm
f. Phòng thí nghiệm:
(phòng này dùng để tiến hành các phân tích sinh hóa, phân tử và di truyền)
- Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần)
- Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần)
- Microtome
- Máy ảnh kỹ thuật số
- Hệ thống đèn chiếu
- Quang phổ kế …

2.CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO THÀNH CÔNG TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
Có 3 nhân tố chính:
- Bảo đảm điều kiện vô trùng
- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách
- Chọn mô cấy và xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.
2.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, vitamin, muối khoáng… rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hay vi khuẩn thì chỉ
sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hay nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần.
2.2 Nguồn tạp nhiễm
Có 3 nguồn tạp nhiễm chính:
- công cụ thuỷ tinh, môi trường nuôi cấy và nút đậy không được vô
trùng tuyệt đối
- Trên bề mặt hay bên trong mô cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấm
hay vi khuẩn
- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hay vi khuẩn theo bụi lên bề
mặt môi trường
2.3 Kỹ thuật vô trùng
2.3.1 Vô trùng công cụ thuỷ tinh, nút đậy và môi trường
a. công cụ thuỷ tinh
Thông thường các công cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm thường được xử lý bằng dung dịch sulfocromate một lần đầu trước khi đưa vào sử dụng; về sau chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước cất và để thật ráo trước khi sử dụng.
Trong trường hợp các công cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi vô trùng, có thể khử trùng trong tủ sấy ở nhiệt độ cao trong nhiều phút hay nhiều giờ. Các công cụ này luôn được gói trong giấy nhôm hay hộp kim loại để tránh bị nhiễm trở lại sau khi đã khử
trùng.
Bảng 1.1: Thời gian khử trùng công cụ thuỷ tinh bằng nhiệt và nhiệt độ khử
trùng
Nhiệt độ (oC) Thời gian khử trùng(phút)
160 45
170 18
180 7,5
190 1,5

b. Nút đậy
Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông gòn không thấm nước.Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời nước từ môi trường không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông không thấm nước là loại nút đơn giản nhất nhưng có các nhược điểm sau:
- Nếu khi hấp nút bông bị ướt hay dính môi trường thì về sau sẽ rất dễ bị nhiễm nấm, nhất là với những thí nghiệm tiến hành trong một thời gian dài
- Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên qui
mô lớn
- Chỉ dùng được vài lần là phải bỏ
Hiện nay người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút bông. Các hãng sản xuất công cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C mà không bị biến dạng. Một số phòng thí nghiệm dùng nắp ống nghiệm bằng
inox hay cao su rất thuận tiện cho việc vô trùng khô hay ướt. Cũng có thể sử dụng giấy nhôm để làm nắp đậy…
c. Môi trường
Môi trường nuôi cấy thường được hấp khử trùng trong nồi hấp (autoclave), khử trùng bằng áp suất hơi nước bão hòa. Thời gian hấp từ 15-30 phút ở áp suất hơi nước bão hòa là 103,4 kPa (1atm) tương đương với nhiệt độ 1210C. Ở nhiệt độ 1210C, hầu hết các sinh vật có trong môi trường đều bị tiêu diệt, kể cả ở dạng bào tử. Sau khi vô trùng cần làm khô nắp ống nghiệm hay nút bông để tránh bị nhiễm trở lại.
Bảng 2: Thời gian khử trùng dung dịch và các môi trường lỏng bằng
nồi hấp (autoclave) ở 121oC tại 103,4 kPa

Thể tích môi trường (mL) Thời gian hấp khử trùng(phút)

<50 15
75 20
250-500 25
1000 30
Việc hấp khử trùng bằng nồi hấp thì không thích hợp với nhiều hoá chất nhạy cảm với nhiệt độ như: các acid amin, các vitamin, các hormon tăng trưởng, và các chất kháng sinh. Các chất như vậy thường phải được khử trùng bằng cách lọc vô trùng. Màng lọc được làm bằng màng polyethylen hay sợI cellulose. Các lỗ trên màng siêu lọc này được thiết kế hiệu quả cho việc giữ lại các vi sinh vật gây nhiễm.
d. Lọc vô trùng
Phương pháp đơn giản nhất là dùng các màng lọc Millipore hay dùng các phểu lọc thủy tinh xốp số 5. Một số loại màng lọc vô trùng của hàng Millipore. Đây là loại màng lọc đã được khử trùng bằng chiếu xạ và chỉ dùng 1 lần
Phương pháp sử dụng màng lọc Millipore: hãng Millipore cung cấp màng lọc và giá đỡ bằng nhựa hịu nhiệt. Dưới đây mô tả màng lọc loại Millipore Swinex có đường kính 25mm. Bộ lọc gồm có giá đỡ bằng loại nhựa chịu nhiệt gồm nắp và đế, vòng cao su và màng lọc. Đặt màng lọc (có kích thước lỗ 0,25µm) trên đế, đặt vòng cao su lên và vặn chặt nắp vào đế. Gói toàn bộ bộ lọc vào trong một tờ giấy nhôm và khử trùng trong autoclave ở 121oC trong 15-20 phút. Đồng thời cũng hấp vô trùng một bình huỷ tinh để hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua bộ lọc.

2.3.2 Khử trùng mô thực vật
Mô cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ…tuỳ theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Đòng lúa non khi còn trong bẹ, mô thịt bên trong quả… thường ít bị nhiễm vi sinh vật; ngược lại, lá, thân đặc biệt ở các bộ phận nằm sâu trong đất như rễ, củ… có lượng nấm, khuẩn tạp rất cao. Hầu như không thể vô trùng mô cấy được nếu nấm, khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong mô chứ không hạn chế ở bề mặt. Lá khoai lang có thể vô trùng dễ dàng trong mùa khô nhưng không thể làm được trong mùa mưa. Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng 30s trong rượu ethylic 70% sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn. Đồng thời người ta thêm các chất giảm sức căng bề mặt như Tween 80, Fotoflo, Teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn. Để có khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy, xin dẫn tài liệu nghiên cứu của Street (1974) ở bảng sau:

Tác nhân vô trùng Nồng độ % Thời gian xử lý Hiệu quả
( phút)
Calci hypochlorit 9 – 10 5 – 30 Rất tốt
Natri hypochlorit 2 5 – 30 Rất tốt
Hydro peroxid 10 – 12 5 – 15 Tốt
Nước Brom 1-2 2 – 10 Rất tốt
HgCl2 0.1 – 1 2 – 10 Trung bình
Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60 Khá tốt

Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận có nhiều bụi cát, trước khi xử lý nên rửa cẩn thận bằng nước xà phòng bột và rửa sạch lại bằng nước máy. Khi xử lý xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (tối thiểu là 3 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần được cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng của tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp ngoài cùng này sẽ được lột bỏ đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay từ lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chăn sẽ đạt kết quả. Có thể dùng kháng sinh để kiểm soát hay loại bỏ sự nhiễm nấm trên mô cấy. Hầu hết các kháng sinh nhạy cảm với nhiệt do đó không thể hấp vô trùng. Chúng hoà tan được trong nước hay dung môi thích hợp khác, lọc vô trùng và thêm vào môi trường vô trùng khi môi trường này đã được làm nguội còn 45-50oC. Không phải tất cả các kháng sinh đều thích hợp cho sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật. Các kháng sinh như Streptomycin, Kanamycin và Neomycin thường độc cho mô thực vật và không hoạt động tốt trong một phạm vi pH nhất định. Tetracylin cũng là độc tố thực vật, có khuynh hướng ức chế sự tăng trưởng của mô thực vật sau khi bị xử lý trong một thời giandài. Chloramphenicol có phổ hoạt động rộng nhưng độc cho thực vật (và người) ở nồng độ thấp. Các kháng sinh thường được dùng trong nuôi cấy mô thực vật gồm Rifampicin (thường được dùng kết hợp với các kháng sinh khác), các polymicin và vancomycin.
Link Download bản DOC
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:

 

29031980

New Member
Re: [Free] Giáo trình Thí nghiệm Sinh học phân tử

Cho mình xin link down Admin ơi!
 

tctuvan

New Member
Re: [Free] Giáo trình Thí nghiệm Sinh học phân tử

link mới cập nhật, mời bạn xem lại bài đầu để tải nhé
 

Các chủ đề có liên quan khác

Top