tonluonganh
New Member
uận văn: Nghiên cứu nhân giống In Vitro một số dòng lan huệ (Hippeastrum equestre) : Luận văn ThS. Sinh học: 60 42 01 14
Nhà xuất bản: ĐHKHTN
Ngày: 2014
Miêu tả: 69 tr.
Luận văn ThS. Sinh học thực nghiệm -- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Đại học Quốc gia Hà Nội, 2014
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT..................................................................ii
MỤC LỤC...........................................................................................................iii
DANH MỤC BẢNG ...........................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH ...........................................................................................vii
MỞ ĐẦU..............................................................................................................1
Chương 1 - TỔNG QUAN...................................................................................3
1.1. Giới thiệu chung về cây Lan huệ.....................................................................3
1.1.1. Đặc điểm thực vật học và phân bố của cây Lan huệ .......................................3
1.1.2. Giá trị kinh tế và sử dụng...............................................................................5
1.2. Một số phương pháp nhân giống vô tính cây Lan huệ...................................6
1.2.1. Phương pháp tách củ con ..............................................................................6
1.2.2. Phương pháp cắt lát ......................................................................................7
1.2.3. Phương pháp nhân giống in vitro ...................................................................9
1.3. Quy trình sản xuất cây nuôi cấy mô ..............................................................20
1.3.1. Lấy mẫu và xử lý mẫu .................................................................................20
1.3.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy..................................................................................21
1.3.3. Nhân nhanh chồi..........................................................................................21
1.3.4. Tái sinh rễ....................................................................................................21
1.3.5. Chuyển cây ra vườn ươm.............................................................................22
1.4. Tình hình nghiên cứu về cây Lan huệ...........................................................22
1.4.1. Tình hình nghiên cứu cây Lan huệ trên thế giới ...........................................22
1.4.2. Tình hình nghiên cứu cây Lan huệ ở Việt Nam............................................24
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................26
2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................26
2.1.1. Đối tượng ....................................................................................................26
2.1.2 Vật liệu.........................................................................................................27iv
2.1.3. Điều kiện nuôi cấy.......................................................................................28
2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................28
2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm.....................................................................28
2.2.1. Giai đoạn nuôi cấy khởi động .....................................................................29
2.2.2. Giai đoạn nhân nhanh .................................................................................29
2.2.3. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh .......................................................................32
2.2.4. Giai đoạn vườn ươm ...................................................................................33
2.3. Các chỉ tiêu theo dõi ......................................................................................33
2.4. Phương pháp tiến hành.................................................................................34
2.5. Phương pháp xử lý số liệu.............................................................................37
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................38
3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu tạo nguồn vật liệu nuôi cấy cho
nhân giống in vitro các dòng Lan huệ .........................................................38
Xác định thời gian khử trùng thích hợp .........................................................38
3.2. Ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến
sự phát sinh chồi và hệ số nhân từ vảy củ đôi .............................................39
3.2.1. Ảnh hưởng của BA tới sự phát sinh chồi của mẫu nuôi cấy .........................40
3.2.2. Ảnh hưởng của sự phối hợp BA và Kinetin đến khả năng phát sinh chồi từ
vảy củ đôi .....................................................................................................41
3.2.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp hai nhóm chất auxin và cytokinin đến khả năng nhân nhanh ch
3.3. Nghiên cứu khả năng phát sinh hình thái và nhân nhanh từ đế củ .............45
3.3.1. Ảnh hưởng của 2,4-D tới khả năng phát sinh hình thái từ đế củ ...................45
3.3.2 Ảnh hưởng của α-NAA tới sự phát sinh hình thái từ đế củ............................46
3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng phát sinh hình thái
từ đế củ .........................................................................................................50
3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường tới chất lượng chồi in
vitro của 5 dòng Lan huệ .............................................................................54
3.4.1. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro.................54
3.4.2. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro .....................57
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiv
3.5. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh ...........................................................57
3.5.1. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ..............................58
3.5.2. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ...............61
3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống và sinh
trưởng và phát triển của cây Lan huệ sau in vitro ngoài vườn ươm ...........61
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................................66
Kết luận ................................................................................................................66
Đề nghị .................................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................68
PHỤ LỤC...............................................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng vào mẫu của các dòng
Lan huệ (sau 4 tuần) .............................................................................39
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của vảy củ đôi (sau
4 tuần) ..................................................................................................40
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp BA và Kinetin đến khả năng phát sinh hình
thái của vảy củ đôi (Sau 4 tuần)............................................................44
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BA, Kinetin và α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi in
vitro từ vảy củ đôi (Sau 4 tuần).............................................................44
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của 2,4-D tới khả năng phát sinh hình thái từ đế củ (sau 4
tuần) .....................................................................................................48
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của α-NAA tới khả năng phát sinh hình thái từ đế củ (sau 4
tuần) .....................................................................................................48
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng phát sinh hình thái in vitro
từ đế củ (Sau 4 tuần).............................................................................52
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng phát sinh chồi của mô sẹo từ
đế củ (Sau 4 tuần).................................................................................52
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro (sau 4
tuần) .....................................................................................................56
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro (sau 4
tuần) .....................................................................................................56
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ của 5 dòng Lan
huệ (sau 4 tuần) ....................................................................................60
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ của 5
dòng Lan huệ (sau 4 tuần).....................................................................60
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống, sinh trưởng và phát triển
của cây Lan huệ sau in vitro(Sau4 tuần)................................................63
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phivii
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Hoa Lan huệ (Hippeastrum equestre) .....................................................5
Hình 1.2. Phương pháp cắt lát củ của cây Lan huệ .................................................8
Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của vảy củ đôi (Sau
4 tuần) ..................................................................................................41
Hình 3.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp BA, Kinetin và α-NAA đến khả năng nhân
nhanh chồi in vitro từ vảy củ đôi (sau 4 tuần) .......................................45
Hình 3.4. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo mô sẹo từ đế củ (sau 4 tuần)..49
Hình 3.5. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng tạo mô sẹo từ đế củ (sau 4
tuần) .....................................................................................................51
Hình 3.6. So sánh ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng tạo mô sẹo từ đế củ
(sau 4 tuần )..........................................................................................51
Hình 3.7. Ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng phát sinh chồi từ mô sẹo của
dòng Lan huệ H10 và H18 (sau 4 tuần).................................................54
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nước dừa tới chất lượng chồi in vitro (sau 4 tuần)........55
Hình 3.9. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễvà chất lượng rễ của 5 dòng Lan
huệ nuôi cấy in vitro (sau 4 tuần)..........................................................59
Hình 3.10. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng và phát
triển của cây Lan huệ sau in vitro ngoài vườn ươm...............................63
Hình 3.11. Ảnh hưởng của một số loại giá thểtới số lượng rễ mới và chiều dài rễ cây
in vitro của 5 dòng Lan huệ (sau 2 tuần)…………………………………641
MỞ ĐẦU
Lan huệ (Hippeastrum equestre)là một trong những loài hoa được yêu thích
và rất có tiềm năng phát triển trong những năm gần đây. Lan huệ được trồng khá
phổ biến để làm cảnh do màu sắc đa dạng, khả năng thương mại cao khi là hoa cắt
cành hay được trồng trong chậu cảnh hay vào các dịp lễ, tết. Bên cạnh đó, đây còn
là cây thuốc chữa bệnh vì theo đông y trong củ của nó có chứa các thành phần biệt
dược có giá trị như các ankaloids [21], các lectins có khả năng chống ung thư, cầm
máu, chữa lành vết thương…
Lan huệ ở Việt Nam hiện nay còn cùng kiệt nàn về màu sắc (chủ yếu là màu
đỏ), thời gian ra hoa của chúng lại khá muộn (khoảng từ giữa tháng 3 đến cuối
tháng 5)nên khả năng phát triển loài hoa này còn rất nhiều hạn chế.Bằng con đường
thu thập nguồn gen, lai hữu tính và chọn lọc có thể làm phong phú bộ giống hoa
Lan huệ ở nước ta. Năm 2009 – 2010, Nguyễn Hạnh Hoa và cộng sự đã chọn tạo ra
hàng loạt con lai có màu sắc lạ, đẹp, đa dạng, hoa có độ bền lâu và có thời gian ra
hoa đáp ứng đúng thị trường, điển hình là các dòng H2, H4, H9, H10, H18. Tuy
nhiên, các dòng Lan huệ này lại có nhược điểm là sinh sản vô tính kém (trong điều
kiện tự nhiên), đặc biệt là các dòng Lan huệ H2, H4 và H18. Do vậy, những cá thể
lai có đặc điểm ưu tú được chọn lọc cần nhân giống vô tính nhằm duy trì được
tính trạng ban đầu.Từ nhiều năm nay, để nhân giống vô tính cây Lan huệ có thể sử
dụng các phương pháp: Tách chồi hay củ nhỏ từ cụm cây mẹ; kỹ thuật cắt lát
(Chipping); nhân giống bằng hạt; sử dụng phương pháp nhân giống in vitro. Mặc dù
đơn giản nhưng hiệu quả khi nhân giống bằng phương pháp truyền thống không cao
do thời gian nhân giống dài, hệ số nhân thấp, cây không đồng nhất cũng như không
tạo được cây sạch bệnh. Phương pháp nhân giống in vitro đã khắc phục được những
nhược điểm đó tạo được cây con sạch bệnh, thời gian nhân giống ngắn, hệ số nhân
giống cao, cây đồng nhất, do vậy đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất
lượng cao và tính di truyền ổn định. Để đánh giá và duy trì nguồn vật liệu thì việc
nghiên cứu nhân giống vô tính các dòng Lan huệ trên là rất cần thiết. Năm 2009 –
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi2
2010, một số tác giả trong nướcđã bước đầu xác định kết quả để xây dựng quy trình
nhân nhanh in vitro hoa Loa kèn đỏ nhung (H. equestre Herb.) vàcây Lan huệ mạng
(H. reticulatum var. striatifolium) [10,11]. Bên cạnh việc kế thừa một số kết quả
trên cần có những nghiên cứu tiếp theo nhằm bổ sung và hoàn thiện quy trình
nhân giống in vitro cây hoa Lan huệ để nhân nhanh nguồn gen ưu tú phục vụ cho
công tác chọn tạo giống. Xuất phát từ những yêu cầu đó, chúng tui tiến hành đề
tài:“Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng Lan huệ (Hippeastrum
equestre)”.
Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định được các giai đoạn cơ bản trong quy trình kỹ thuật nhân giống in
vitrocủa một số dòng Lan huệ từ các nguồn vật liệu nuôi cấy khác nhau.
- Góp phần bổ sung và hoàn thiện quy trình nhân giống in vitronhằm nhân
nhanh một số dòng Lan huệ.
Ý nghĩa khoa họcvà thực tiễn
- Cung cấp những dữ liệu khoa học mới về nhân giống vô tính cây Lan huệ
bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ
thuật nuôi cấy mô cây hoa.
- Cung cấp thông tin cần thiết làm cơ sở cho việc xây dựng hoàn thiện quy
trình nhân giống Lan huệ thương mại có thương hiệu riêng và hiệu quả kinh tế cao.
- Đáp ứng sản xuất cây giống Lan huệ có hiệu quả, chất lượng tốt, khắc phục
được những hạn chế của nhân giống truyền thống, duy trì và nhân nhanh kiểu gen
được chọn lọc.3
Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1.Giới thiệu chung về cây Lan huệ
1.1.1.Đặc điểm thực vật học và phân bố của cây Lan huệ
Cây Lan huệ có tên khoa học: Hippeastrum esquetre, thuộc họ Liliaceae, bộ
Hành (Liliales), phân lớp Hành ( Liliidae), lớp thực vật một lá mầm (Monocotyledons)
[2, 3].
Tên của loài hoa này có rất nhiều cách để Việt hóa như: Lan huệ,Loa kèn đỏ
nhung, Huệ đất, Tứ diện xích lan, Huệ loa kèn, Mạc chu lan...Người châu Âu gọi là
Valentine Flower bởi vì Lan huệ nở hoa trong khoảng đầu năm vào dịp lễ hội tình
yêu (14/2).
1.1.1.1.Đặc điểm thực vật học của cây Lan huệ ở Việt Nam
Lan huệ có dạng thân hành, hình cầu, có áo mỏng bao ở ngoài [4].
a. Lá cây
Lá tập trung ở gốc gần như thành 2 dãy, phiến lá hình dải, màu xanh đậm,
kích thước 45-50 cm x 2-4 cm, hình kiếm hay hình dải mác, hơi khum thành hình
máng, dai, cứng, có nhiều gân sọc song song và gân phụ ngang song song, mép hơi
cong xuống, chóp tù. Gốc lá dạng bẹ ôm lấy nhau. Lá bắc tổng bao 2, dạng mo, gồm
2 cái, mỏng, kích thước 6-7 cm x 3-4 cm, màu trắng xanh.
b. Hoa
Cụm hoa tán, 2- 4 hoa, trên một cuống hoa chung có hình trụ, dài 30-50 cm,
đường kính 1,5-2 cm ,thẳng đứng và rỗng, mặt ngoài phủ phấn trắng. Hoa to khi nở
đường kính tới 15 cm, đều, lưỡng tính,màu sắc sặc sỡ, màu đỏ hay đỏ cam, có
cuống dài 4-5 cm, gốc màu xanh, xanh vàng hay vàng trắng.
Bao hoa hình phễu, dài 9-12 cm, nằm ngang hay rủ xuống, 6 mảnh, dạng
tràng, phần dưới dính nhau thành ống, ngắn, dài 2-3,5 cm, họng có 1 vòng vảy ngắn
hay 1 vòng tràng phụ cụp vào trong, phần trên 6 thùy, hình trứng xếp 2 vòng, các
thùy bằng nhau hay các thùy vòng trong hẹp hơn. Nhị 6; chỉ nhị rời nhau, hình trụ
dài 6-7 cm, đầu hơi cong đính ở họng ống bao hoa, nghiêng về một phía; bao phấn
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi4
hình trụ, dài 2-2,5 cm, màu trắng ngà,2 ô, đính lưng, hướng trong, mở bằng khe
dọc.
Bầu hoa, dài 1,2-1,5 cm 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi nhụy
dài tới 10 cm, mảnh; đầu nhụy dạng đầu hay 3 thùy, màu trắng.
Hình 1.1: Hoa Lan huệ (Hippeastrum equestre)
c. Củ và rễ
Củ con: Lan huệ có các củ con (thân hành con) sinh ra từ củ mẹ, chu vi của củ
con từ 3-6 cm, số lượng củ con trung bình từ 1-3 củ/cây.
Rễ:docây thuộc bộ Lilliales nên có hệ rễ chùm gồm nhiều rễ phụ tương đối
đồng đều về kích thước.
d. Quả
Quả nang, hình cầu hay hình thuôn, mở ở khe lưng ô thành 3 mảnh. Hạt nhiều,
dẹp, màu đen nội nhũ nạc bao lấy phôi nhỏ.
1.1.1.2.Yêu cầu ngoại cảnh
Cây Lan huệ mọc tự nhiên ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ, được nhập vào Việt
Nam, trồng làm cảnh trong vườn hay trong chậu. Cây ra hoa vào giai đoạn xuânhè, do đó nếu muốn để hoa nở vào đúng dịp Tết thì các yếu tố ngoại cảnh là điều
kiện vô cùng quan trọng cần chú ý đối với việc sinh trưởng phát triển của cây [2].5
a. Nhiệt độ
Lan huệ có khả năng chịu nóng, ưa khí hậu lạnh và ẩm. Nhiệt độ thích hợp ban
ngày từ 20-28oC, ban đêm 13-17oC, ở ngưỡng nhiệt độ dưới 5oC và trên 30oC cây
sinh trưởng kém, hoa dễ bị mù. Giai đoạn đầu nhiệt độ thấp có lợi cho sinh trưởng
của rễ và sự phân hoá hoa.
b . Ánh sáng
Lan huệ là cây ưa cường độ ánh sáng trung bình, cường độ ánh sáng thích hợp
từ 12.000-15.000lux nhất là thời kỳ cây cao 20-30cm. Muốn điều khiển độ dài của
lá và chiều cao của vòi hoa, chỉ cần điều tiết ánh sáng. Cây nhiều ánh sáng có vòi
hoa và lá ngắn, cây mọc trong bóng râm thường cao và lá dài.
c . Nước
Thời kỳ đầu cây rất cần nước, khi ra hoa giảm bớt nước. Nhiều nước dễ làm
cho củ bị thối, rụng nụ. Độ ẩm đất thay đổi tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của
cây (thường từ 70-85%).
d . Đất
Đất tơi xốp, không chứa mầm bệnh và thoát nước tốt. Lan huệ rất mẫn cảm
với muối, nồng độ muối trong đất cao, cây không hút được nước ảnh hưởng tới sinh
trưởng, ra hoa. Nói chung, hàm lượng muối trong đất không được cao quá
1,5mg/cm2, lượng hợp chất Clo không được vượt quá 1,5mmol/lít, pH = 6,5-7,0.
1.1.1.3.Phân bố
Lan huệ có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được trồng khắp Châu Mỹ nhiệt đới, từ
Mêhico và phía Nam Tây Ấn đến Brazil và Chile [3,4]. Chi Hippeastrumhiện có 70-
76 loài. Ở Việt Nam, chi Hippeastrumcó 2 loài, 1 thứ thường được trồng làm cảnh.
1.1.2.Giá trị kinh tế và sử dụng
Trên thế giới, nhiều loài thuộc chi Hippeastrum được trồng làm cảnh bởi
chúng có ưu điểm là hoa to, đẹp, khá đa dạng về màu sắc, có thể sử dụng dưới dạng
hoa cắt cành, trồng chậu hay trồng thảm. Hoa được sử dụng trong ngày lễ, ngày
tết, được trang trí trong nội thất, hay làm quà tặng rất trang trọng. Hoa mang hương
thơm mát dịu, màu sắc thanh nhã, tính thẩm mỹ cao [5].
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi6
Ở ViệtNam, hoa được sử dụng trong những ngày lễ, ngày tết, được trang
trí trong hội trường, công viên, trong gia đình và làm quà tặng rất trang trọng.
Trong Đông dược, Lan huệ là một vị thuốc quan trọng vì củ có vị ngọt cay,
tính ấm có độc, có tác động tán ứ, tiêu thũng. Thân hành của cây được dùng giã nát
đắp cầm máu và trị tổn thương khi té ngã.
Bên cạnh đó, Lan huệ là một trong những loài hoa có tiềm năng phát triển của
chi Hippeastrum do củ của nó có chứa các biệt dược giá trị như các loại alkaloids
[21], các lectins có hoạt tính chống siêu vi trùng, chống sưng viêm, chống ung thư,
chữa bệnh Alzheimer, cầm máu và chữa vết thương. Các alkaloids trong Lan huệ
đang được nghiên cứu về một số tác động dược học. Trong số các alkaloids,
lycorine (tên cũ Narcissine) là chất được chú ý nhất. Lycorine là một alkaloid loại
isoquinolone (chuyển hóa từ phena thridine), có các hoạt tính sinh học loại cholino
mimetic; ức chế hoạt tính sinh học của men acetylcholinesterase. Các hoạt tính của
Lycorine có tác dụng chống siêu vi trùng, có tác dụng chống sưng-viêm do ức chế
sự sản xuất TNF-alpha (tumor necrosis factor) nơi các đại thực bào của chuột thử
nghiệm; ức chế tiến trình sinh tổng hợp proteins. Vì TNF-alpha là một chất cytokine
căn bản điều hòa tiến trình sưng viêm nên lycorine có triển vọng được dùng làm
thuốc chống sưng, trị thấp khớp.
Hoa Lan huệ ở nước ta hầu như chỉ có màu đỏ, hoa nở trong 1 thời gian ngắn
còn quanh năm nó chỉ có màu xanh biếc của lá.Hoa Lan huệ chỉ trổ bông mỗi năm
một lần, có khi đôi lần nhưng không nhiều cây ra hoa được như thế [5].
1.2.Một số phương pháp nhân giống vô tính cây Lan huệ
1.2.1.Phương pháp tách củ con
Trong quá trình sinh trưởng phát triển, một củ Lan huệ có thể đẻ ra nhiều củ
con ở xung quanh. Có thể tách những củ con đem trồng. Củ con sau khi tách có khả
năng sống rất cao và sớm cho hoa, thông thường sau 18-24 tháng cây sẽ cho hoa.
Khi đường kính củ con được 2-3 cm thì tách khỏi cây mẹ, có thể trồng trong
chậu đất hay chậu nhựa, nếu trồng trong chậu đất thì cần tưới nước thường
xuyên hơn là trong chậu nhựa. Nhúng phần đế của củ cùng với bộ rễ trong nước ấm,7
điều này có tác dụng làm mềm rễ và thuận lợi cho bộ rễ lan ra khắp chậu. Khoét
một hố trên bề mặt đất rộng hơn đường kính củ, đặt củ vào hố sao cho 1/3 củ nổi
trên mặt đất [20].
1.2.2.Phương pháp cắt lát
Kỹ thuật cắt lát (chipping) được sử dụng khá phổ biến nhất là đối với những
cây họ Hành có củ (là những lớp vảy xếp khít nhau xung quanh đỉnh sinh trưởng
trung tâm) như chi Hippeastrum, Narcissus (hoa thủy tiên), Galanthus. Các bước
tiến hành [20]:
1. Chọn những củ Lan huệ bố mẹ khoẻ mạnh không bị nấm bệnh, nhổ củ khi
củ còn ở trạng thái ngủ nghỉ.
2. Dùng dao sắc nhọn sao cho khi cắt lát cắt phẳng, mịn không làm dập nát
củ. Khử trùng bề mặt củ và dao cắt.
3. Cắt bớt phần rễ và phần trên của củ, dùng dao cắt dọc chia đôi củ từ đỉnh
củ xuống phần đế củ, tiếp tục chia nhỏ các nửa hành sao cho mỗi lát đều mang một
phần đế củ. Một củ có thể chia thành 8-16 lát.
4. Các lát được ngâm trong dung dịch thuốc diệt nấm khoảng 10-15 phút lắc
đều, sau đó được vớt ra để ráo nước.
5. Cho mỗi lát vào trong 1 túi nilon có chứa đá trân châu có thêm chất
khoáng, cho nhiều khí vào túi và buộc kín túi. Đưa vào nơi mát và tối với nhiệt độ
thích hợp 20-21oC, thường xuyên kiểm tra dấu hiệu thối hỏng.
6. Sau khoảng 12 tuần các hành con sẽ xuất hiện ở gốc của lát cắt. Tách các
cây con trồng vào giá thể tơi xốp và thoát nước. Cây con rất bé và yếu ớt nên cần
đặt dưới ánh sáng tán xạ một thời gian trước khi đưa ra ngoài ánh sáng trực tiếp.
Phải mất khoảng 2-4 năm cây mới sinh trưởng phát triển thành thục và cho
hoa. Ở Việt Nam, mùa đông không có tuyết và sương giá nên cây sẽ lớn nhanh hơn
và cho hoa sớm hơn so các nước ở xứ lạnh.
Nhân nhanh bằng phương pháp cắt lát củ đã được rất nhiều nhóm tác giả
nghiên cứu cả trong điều kiện in vivovà in vitro. Epharath và cộng sự (2001) đã sử
dụng 7 phương pháp cắt củ [20], chia củ mẹ thành 2, 4, 8, 12, 16, 32 và 48 lát cắt,
mỗi lát cắt đều mang 1 phần đế củ và giâm vào túi nilon có chứa chất khoáng bón
cho cây. Các túi này được đặt trong điều kiện nhiệt độ 230C trong 4 tháng. Kết quả
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi8
cho thấy, khi cắt củ thành 48 phần thì số lượng chồi thu được là cao nhất, 34
chồi/mẫu. Năm 1991, O’Rourke và cộng sự đã cắt củ nhỏ in vitro tạo ra từ vảy củ
đôi trên môi trường tạo củ của loài Hippeastrum hybridum "Apple Blossom” thành 2
hay 4 phần và tiếp tục nuôi cấy trong 10 - 12 tuần. Sau 26 - 28 tuần nuôi cấy, hệ số
nhân thu được đã tăng lên 100 chồi/mẫu ban đầu [32]. Bằng phương pháp cắt củ
này, Slabbert và cộng sự (1993) cũng đã thu được 700 - 1000 cây từ 1 củ ban đầu
sau 12 tháng, cây con thu được khỏe, có sức sống cao [38].
Hình 1.2. Phương pháp cắt lát củ của cây Lan huệ9
1.2.3.Phương pháp nhân giống in vitro
Phương pháp này có ưu điểm là tạo được cây con trẻ hóa và sạch bệnh nên
cây có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao. Đồng thời, thời gian nhân
giống ngắn, hệ số nhân giống cao, cây đồng nhất do vậy đáp ứng được nhu cầu về
số lượng giống có chất lượng cao, ổn định, có thể cung ứng cho sản xuất trên quy
mô rộng.
Đã có một số nghiên cứu bước đầu về nhân in vitro cây Lan huệ, các tác giả
cho biết: Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo chồi ở cây Loa kèn đỏ nhung
(Hippeastrum equestre Herb.) là môi trường MS có bổ sung 5,0 mg/l BA và cây
Lan huệ mạng là môi trường MS có bổ sung 3,0 mg/l BA, 100% mẫu tái sinh tạo
chồi và củ nhỏ. Chồi và củ nhỏ tạo ra được sử dụng cho thí nghiệm nhân nhanh. Đa
số các chồi đều ra rễ. Các cây con in vitro hoàn chỉnh được đưa ra thích nghi với
điều kiện giá thể cát và trấu hun theo tỷ lệ 1:1 [10,11].
1.2.3.1.Cơ sở khoa học
Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người
Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng
minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông, mỗi tế bào được lấy từ bất
kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ thể
hoàn chỉnh. Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền
của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả
năng giống như một hợp tử ban đầu [8].
Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là
khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào. Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của
tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ
thể. Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào chuyên hóa của
cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó – tế bào phôi. Tuy
nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là
khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi10
bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra. Đối với thực vật, khả năng
hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc [25].
Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng sinh
sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được kiểu gen của
mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa. Nhưng ngay từ khi ra đời, công nghệ
nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân giống của con
người [1].
1.2.3.2.Ý nghĩa của phương pháp nhân giống in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô
tính. Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao,
gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitrolà
công cụ vô cùng hữu ích. Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu
tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitrolà
do:
Các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống
cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng
hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần
hóa học. Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất
theo dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều,
làm giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng
nhất về chất lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là
nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với
các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm
lượng các thành phần hoạt chất [1,8].
Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được
áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn. Phương pháp
nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính,
ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền
do duy trì được các tính trạng của cây mẹ, nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho11
sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo
điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của
hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết,
giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu
thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp. Bên cạnh đó, việc sử dụng chính các
bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém.
Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền
thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng
như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều
ưu điểm nổi trội như:
- Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành
hàng triệu cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36
đến 1012 /năm, cao hơn bất cứ cách nhân giống nào.
- Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt
với cây bố mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều
có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế.
- Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được
các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan
tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh
sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch virus.
- Nhân giống in vitrocó thể nhân nhanh cây không kết hạt hay kết hạt kém
trong những điều kiện sinh thái nhất định.
- Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và chiếu
sáng, nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm.
- Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội.
- Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen.
Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitrovẫn không tránh khỏi một
số nhược điểm như:
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi12
- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Nhiều loài thực vật quý hiếm chưa thể
tiến hành nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới lý thuyết nuôi cấy và tái sinh
thực vật.
- Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitrođòi hỏi trang thiết bị hiện đại và
lao động có tay nghề.
- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân là do biến dị
soma, đã làm cho các cây con không giữ được kiểu hình của bố mẹ (đặc biệt là khi
nuôi cấy từ callus).
Trong quá trình nuôi cấy, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình phản
biệt hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh. Mỗi đối tượng thực vật có đặc
tính khác nhau, do đó có những cách thức biến đổi khác nhau, mặc dù kết quả cuối
cùng là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một cách chung
cho tất cả các thực vật.
1.2.3.3.Các cách nhân giống in vitro
Quá trình thực hiện nhân giống in vitrotạo ra các dòng vô tính, theo Shull
(1912) dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được
nhân bằng sinh sản vô tính. Trong nhân giống in vitro, cây con có thể được tái sinh
từ các điểm sinh trưởng có sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc
từ những mô có khả năng hình thành điểm sinh trưởng phụ, các dòng vô tính này sẽ
được tạo ra theo các cách sau [8]:
- Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách.
- Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo.
Tái sinh cây trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm tồn
tại sẵn có trong mô nuôi cấy, phân chia và tái sinh thành cây. Các cây con này được
phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng nhất về
mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ. Tái sinh trực tiếp cũng có
thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng, đó là các đoạn thân,
mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia13
nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng cao
hơn ở trường hợp nói trên.
Với đường hướng tái sinh gián tiếp, mẫu nuôi cấy không tái sinh thành cây
ngay mà phát triển thành khối mô sẹo (callus). Trong môi trường nuôi cấy thích
hợp, thường là với auxin, mẫu nuôi cấy có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào
không tổ chức, đó chính là các tế bào mô sẹo. Sự tăng sinh này có thể được duy trì
nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường
mới theo chu kỳ. Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn
định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới
phát sinh. Nhiều cây tái sinh từ mô sẹo có thể rất khác với cây mẹ về mặt di truyền.
Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong quá trình phát sinh và phát triển của
mô sẹo, thường xuất hiện những tế bào đột biến mang số nhiễm sắc thể không giống
với tế bào ban đầu hay chứa những đột biến gen do hiện tượng nội nguyên nhân
(endomitosits hay endoreduplication). Nội nguyên nhân là hiện tượng nhân đôi
nhiễm sắc thể không kèm theo sự phân bào trong thực tế và là một hiện tượng tự
nhiên trong cơ thể thực vật, nhưng tăng lên dưới ảnh hưởng của cá thành phần của
môi trường dinh dưỡng và điều kiện cũng như phương pháp nuôi cấy, nhất là khi
cấy chuyển nhiều lần. Đột biến tuy không có lợi cho việc duy trì nguyên trạng
những đặc tính di truyền (trueness – to – type) trong quá trình tạo giống nhưng lại
chính là đối tượng tìm kiếm trong quá trình cải tạo giống.Nuôi cấy mô sẹo có vai trò
vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin và cytokinin
trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma; từ đó có
thể tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu
nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt nhân tạo. Hệ số nhân của con đường này
vô cùng lớn. Từ một khối mô sẹo có thể tạo ra phôi soma hay chế ra hạt giống
nhân tạo. Ngoài việc cung cấp những đột biến tự nhiên, mô sẹo còn là đối tượng lý
tưởng để tạo ra những đột biến nhân tạo bằng các tác nhân gây đột biến hay công
nghệ gen.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
<<<<
Kết luận
Từ những kết quảnghiên cứu đã tiến hành rút ra một số kết luận sau:
1. Giai đoạn nuôi cấy khởi động:
Thời gian khử trùng thích hợp bằng HgCl20,1% cho 5 dòng Lan huệH2, H4,
H9, H10, H18 là trong thời gian 9 phút .
Môi trường nền (MTN): MS + 30 g/l Saccharose + 5,8 g/l agar.
Vật liệu nuôi cấy của 5 dòng H2, H4, H9, H10, H18 là: Vảy củ đôi có dính đế
củ và đế củ.
2. Nhân nhanh từ vảy củ đôi
Môi trường tối ưu cho nhân nhanh chồi in vitro từ vảy củ đôi là:
- Dòng H2, H4, H9:
MTN + 5,0mg/lBA + 0,75 mg/lKinetin + 0,25- 0,5 mg/l α-NAA;
- Dòng H10, H18:
MTN + 3,0mg/l BA + 1,0mg/l Kinetin + 0,25 - 0,5 mg/l α-NAA;
Hệ số nhân chồi đạt 4,5 – 5,4 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 10,1 – 13,1 cm.
3. Nhân nhanh từ đế củ
Môi trường tối ưu tạo mô sẹo từ đế củ là:
- Dòng H9, H18: MTN +3,0 mg/l BA + 1,5mg/l α-NAA
- Dòng H2, H4, H10: MTN +2,0 mg/l BA + 1,0 mg/l α-NAA
Môi trường tối ưu phát sinh chồi từ mô sẹo của các dòng Lan huệ là:
- Dòng H10: MTN + 1,0 mg/l Kinetin + 4,0 mg/l BA;
- Dòng H18:MTN + 1,0 mg/l Kinetin + 5,0 mg/l BA;
Hệ số nhân chồi dòng H10 đạt 5,7 chồi/mẫu và 6,5 chồi/mẫu với dòng H18.
4.
Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Bổ sung60ml/l nước dừa hay 60-80g/l Saccharose vào môi trườngcó hiệu
quả tốt trong việc nâng cao chất lượng chồi in vitro của các dòng Lan huệ.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Nhà xuất bản: ĐHKHTN
Ngày: 2014
Miêu tả: 69 tr.
Luận văn ThS. Sinh học thực nghiệm -- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Đại học Quốc gia Hà Nội, 2014
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT..................................................................ii
MỤC LỤC...........................................................................................................iii
DANH MỤC BẢNG ...........................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH ...........................................................................................vii
MỞ ĐẦU..............................................................................................................1
Chương 1 - TỔNG QUAN...................................................................................3
1.1. Giới thiệu chung về cây Lan huệ.....................................................................3
1.1.1. Đặc điểm thực vật học và phân bố của cây Lan huệ .......................................3
1.1.2. Giá trị kinh tế và sử dụng...............................................................................5
1.2. Một số phương pháp nhân giống vô tính cây Lan huệ...................................6
1.2.1. Phương pháp tách củ con ..............................................................................6
1.2.2. Phương pháp cắt lát ......................................................................................7
1.2.3. Phương pháp nhân giống in vitro ...................................................................9
1.3. Quy trình sản xuất cây nuôi cấy mô ..............................................................20
1.3.1. Lấy mẫu và xử lý mẫu .................................................................................20
1.3.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy..................................................................................21
1.3.3. Nhân nhanh chồi..........................................................................................21
1.3.4. Tái sinh rễ....................................................................................................21
1.3.5. Chuyển cây ra vườn ươm.............................................................................22
1.4. Tình hình nghiên cứu về cây Lan huệ...........................................................22
1.4.1. Tình hình nghiên cứu cây Lan huệ trên thế giới ...........................................22
1.4.2. Tình hình nghiên cứu cây Lan huệ ở Việt Nam............................................24
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................26
2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................26
2.1.1. Đối tượng ....................................................................................................26
2.1.2 Vật liệu.........................................................................................................27iv
2.1.3. Điều kiện nuôi cấy.......................................................................................28
2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................28
2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm.....................................................................28
2.2.1. Giai đoạn nuôi cấy khởi động .....................................................................29
2.2.2. Giai đoạn nhân nhanh .................................................................................29
2.2.3. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh .......................................................................32
2.2.4. Giai đoạn vườn ươm ...................................................................................33
2.3. Các chỉ tiêu theo dõi ......................................................................................33
2.4. Phương pháp tiến hành.................................................................................34
2.5. Phương pháp xử lý số liệu.............................................................................37
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................38
3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu tạo nguồn vật liệu nuôi cấy cho
nhân giống in vitro các dòng Lan huệ .........................................................38
Xác định thời gian khử trùng thích hợp .........................................................38
3.2. Ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến
sự phát sinh chồi và hệ số nhân từ vảy củ đôi .............................................39
3.2.1. Ảnh hưởng của BA tới sự phát sinh chồi của mẫu nuôi cấy .........................40
3.2.2. Ảnh hưởng của sự phối hợp BA và Kinetin đến khả năng phát sinh chồi từ
vảy củ đôi .....................................................................................................41
3.2.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp hai nhóm chất auxin và cytokinin đến khả năng nhân nhanh ch
3.3. Nghiên cứu khả năng phát sinh hình thái và nhân nhanh từ đế củ .............45
3.3.1. Ảnh hưởng của 2,4-D tới khả năng phát sinh hình thái từ đế củ ...................45
3.3.2 Ảnh hưởng của α-NAA tới sự phát sinh hình thái từ đế củ............................46
3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng phát sinh hình thái
từ đế củ .........................................................................................................50
3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường tới chất lượng chồi in
vitro của 5 dòng Lan huệ .............................................................................54
3.4.1. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro.................54
3.4.2. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro .....................57
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiv
3.5. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh ...........................................................57
3.5.1. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ..............................58
3.5.2. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ...............61
3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống và sinh
trưởng và phát triển của cây Lan huệ sau in vitro ngoài vườn ươm ...........61
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................................66
Kết luận ................................................................................................................66
Đề nghị .................................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................68
PHỤ LỤC...............................................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng vào mẫu của các dòng
Lan huệ (sau 4 tuần) .............................................................................39
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của vảy củ đôi (sau
4 tuần) ..................................................................................................40
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp BA và Kinetin đến khả năng phát sinh hình
thái của vảy củ đôi (Sau 4 tuần)............................................................44
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BA, Kinetin và α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi in
vitro từ vảy củ đôi (Sau 4 tuần).............................................................44
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của 2,4-D tới khả năng phát sinh hình thái từ đế củ (sau 4
tuần) .....................................................................................................48
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của α-NAA tới khả năng phát sinh hình thái từ đế củ (sau 4
tuần) .....................................................................................................48
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng phát sinh hình thái in vitro
từ đế củ (Sau 4 tuần).............................................................................52
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng phát sinh chồi của mô sẹo từ
đế củ (Sau 4 tuần).................................................................................52
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro (sau 4
tuần) .....................................................................................................56
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro (sau 4
tuần) .....................................................................................................56
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ của 5 dòng Lan
huệ (sau 4 tuần) ....................................................................................60
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ của 5
dòng Lan huệ (sau 4 tuần).....................................................................60
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống, sinh trưởng và phát triển
của cây Lan huệ sau in vitro(Sau4 tuần)................................................63
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phivii
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Hoa Lan huệ (Hippeastrum equestre) .....................................................5
Hình 1.2. Phương pháp cắt lát củ của cây Lan huệ .................................................8
Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của vảy củ đôi (Sau
4 tuần) ..................................................................................................41
Hình 3.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp BA, Kinetin và α-NAA đến khả năng nhân
nhanh chồi in vitro từ vảy củ đôi (sau 4 tuần) .......................................45
Hình 3.4. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo mô sẹo từ đế củ (sau 4 tuần)..49
Hình 3.5. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng tạo mô sẹo từ đế củ (sau 4
tuần) .....................................................................................................51
Hình 3.6. So sánh ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng tạo mô sẹo từ đế củ
(sau 4 tuần )..........................................................................................51
Hình 3.7. Ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng phát sinh chồi từ mô sẹo của
dòng Lan huệ H10 và H18 (sau 4 tuần).................................................54
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nước dừa tới chất lượng chồi in vitro (sau 4 tuần)........55
Hình 3.9. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễvà chất lượng rễ của 5 dòng Lan
huệ nuôi cấy in vitro (sau 4 tuần)..........................................................59
Hình 3.10. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng và phát
triển của cây Lan huệ sau in vitro ngoài vườn ươm...............................63
Hình 3.11. Ảnh hưởng của một số loại giá thểtới số lượng rễ mới và chiều dài rễ cây
in vitro của 5 dòng Lan huệ (sau 2 tuần)…………………………………641
MỞ ĐẦU
Lan huệ (Hippeastrum equestre)là một trong những loài hoa được yêu thích
và rất có tiềm năng phát triển trong những năm gần đây. Lan huệ được trồng khá
phổ biến để làm cảnh do màu sắc đa dạng, khả năng thương mại cao khi là hoa cắt
cành hay được trồng trong chậu cảnh hay vào các dịp lễ, tết. Bên cạnh đó, đây còn
là cây thuốc chữa bệnh vì theo đông y trong củ của nó có chứa các thành phần biệt
dược có giá trị như các ankaloids [21], các lectins có khả năng chống ung thư, cầm
máu, chữa lành vết thương…
Lan huệ ở Việt Nam hiện nay còn cùng kiệt nàn về màu sắc (chủ yếu là màu
đỏ), thời gian ra hoa của chúng lại khá muộn (khoảng từ giữa tháng 3 đến cuối
tháng 5)nên khả năng phát triển loài hoa này còn rất nhiều hạn chế.Bằng con đường
thu thập nguồn gen, lai hữu tính và chọn lọc có thể làm phong phú bộ giống hoa
Lan huệ ở nước ta. Năm 2009 – 2010, Nguyễn Hạnh Hoa và cộng sự đã chọn tạo ra
hàng loạt con lai có màu sắc lạ, đẹp, đa dạng, hoa có độ bền lâu và có thời gian ra
hoa đáp ứng đúng thị trường, điển hình là các dòng H2, H4, H9, H10, H18. Tuy
nhiên, các dòng Lan huệ này lại có nhược điểm là sinh sản vô tính kém (trong điều
kiện tự nhiên), đặc biệt là các dòng Lan huệ H2, H4 và H18. Do vậy, những cá thể
lai có đặc điểm ưu tú được chọn lọc cần nhân giống vô tính nhằm duy trì được
tính trạng ban đầu.Từ nhiều năm nay, để nhân giống vô tính cây Lan huệ có thể sử
dụng các phương pháp: Tách chồi hay củ nhỏ từ cụm cây mẹ; kỹ thuật cắt lát
(Chipping); nhân giống bằng hạt; sử dụng phương pháp nhân giống in vitro. Mặc dù
đơn giản nhưng hiệu quả khi nhân giống bằng phương pháp truyền thống không cao
do thời gian nhân giống dài, hệ số nhân thấp, cây không đồng nhất cũng như không
tạo được cây sạch bệnh. Phương pháp nhân giống in vitro đã khắc phục được những
nhược điểm đó tạo được cây con sạch bệnh, thời gian nhân giống ngắn, hệ số nhân
giống cao, cây đồng nhất, do vậy đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất
lượng cao và tính di truyền ổn định. Để đánh giá và duy trì nguồn vật liệu thì việc
nghiên cứu nhân giống vô tính các dòng Lan huệ trên là rất cần thiết. Năm 2009 –
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi2
2010, một số tác giả trong nướcđã bước đầu xác định kết quả để xây dựng quy trình
nhân nhanh in vitro hoa Loa kèn đỏ nhung (H. equestre Herb.) vàcây Lan huệ mạng
(H. reticulatum var. striatifolium) [10,11]. Bên cạnh việc kế thừa một số kết quả
trên cần có những nghiên cứu tiếp theo nhằm bổ sung và hoàn thiện quy trình
nhân giống in vitro cây hoa Lan huệ để nhân nhanh nguồn gen ưu tú phục vụ cho
công tác chọn tạo giống. Xuất phát từ những yêu cầu đó, chúng tui tiến hành đề
tài:“Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng Lan huệ (Hippeastrum
equestre)”.
Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định được các giai đoạn cơ bản trong quy trình kỹ thuật nhân giống in
vitrocủa một số dòng Lan huệ từ các nguồn vật liệu nuôi cấy khác nhau.
- Góp phần bổ sung và hoàn thiện quy trình nhân giống in vitronhằm nhân
nhanh một số dòng Lan huệ.
Ý nghĩa khoa họcvà thực tiễn
- Cung cấp những dữ liệu khoa học mới về nhân giống vô tính cây Lan huệ
bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ
thuật nuôi cấy mô cây hoa.
- Cung cấp thông tin cần thiết làm cơ sở cho việc xây dựng hoàn thiện quy
trình nhân giống Lan huệ thương mại có thương hiệu riêng và hiệu quả kinh tế cao.
- Đáp ứng sản xuất cây giống Lan huệ có hiệu quả, chất lượng tốt, khắc phục
được những hạn chế của nhân giống truyền thống, duy trì và nhân nhanh kiểu gen
được chọn lọc.3
Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1.Giới thiệu chung về cây Lan huệ
1.1.1.Đặc điểm thực vật học và phân bố của cây Lan huệ
Cây Lan huệ có tên khoa học: Hippeastrum esquetre, thuộc họ Liliaceae, bộ
Hành (Liliales), phân lớp Hành ( Liliidae), lớp thực vật một lá mầm (Monocotyledons)
[2, 3].
Tên của loài hoa này có rất nhiều cách để Việt hóa như: Lan huệ,Loa kèn đỏ
nhung, Huệ đất, Tứ diện xích lan, Huệ loa kèn, Mạc chu lan...Người châu Âu gọi là
Valentine Flower bởi vì Lan huệ nở hoa trong khoảng đầu năm vào dịp lễ hội tình
yêu (14/2).
1.1.1.1.Đặc điểm thực vật học của cây Lan huệ ở Việt Nam
Lan huệ có dạng thân hành, hình cầu, có áo mỏng bao ở ngoài [4].
a. Lá cây
Lá tập trung ở gốc gần như thành 2 dãy, phiến lá hình dải, màu xanh đậm,
kích thước 45-50 cm x 2-4 cm, hình kiếm hay hình dải mác, hơi khum thành hình
máng, dai, cứng, có nhiều gân sọc song song và gân phụ ngang song song, mép hơi
cong xuống, chóp tù. Gốc lá dạng bẹ ôm lấy nhau. Lá bắc tổng bao 2, dạng mo, gồm
2 cái, mỏng, kích thước 6-7 cm x 3-4 cm, màu trắng xanh.
b. Hoa
Cụm hoa tán, 2- 4 hoa, trên một cuống hoa chung có hình trụ, dài 30-50 cm,
đường kính 1,5-2 cm ,thẳng đứng và rỗng, mặt ngoài phủ phấn trắng. Hoa to khi nở
đường kính tới 15 cm, đều, lưỡng tính,màu sắc sặc sỡ, màu đỏ hay đỏ cam, có
cuống dài 4-5 cm, gốc màu xanh, xanh vàng hay vàng trắng.
Bao hoa hình phễu, dài 9-12 cm, nằm ngang hay rủ xuống, 6 mảnh, dạng
tràng, phần dưới dính nhau thành ống, ngắn, dài 2-3,5 cm, họng có 1 vòng vảy ngắn
hay 1 vòng tràng phụ cụp vào trong, phần trên 6 thùy, hình trứng xếp 2 vòng, các
thùy bằng nhau hay các thùy vòng trong hẹp hơn. Nhị 6; chỉ nhị rời nhau, hình trụ
dài 6-7 cm, đầu hơi cong đính ở họng ống bao hoa, nghiêng về một phía; bao phấn
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi4
hình trụ, dài 2-2,5 cm, màu trắng ngà,2 ô, đính lưng, hướng trong, mở bằng khe
dọc.
Bầu hoa, dài 1,2-1,5 cm 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi nhụy
dài tới 10 cm, mảnh; đầu nhụy dạng đầu hay 3 thùy, màu trắng.
Hình 1.1: Hoa Lan huệ (Hippeastrum equestre)
c. Củ và rễ
Củ con: Lan huệ có các củ con (thân hành con) sinh ra từ củ mẹ, chu vi của củ
con từ 3-6 cm, số lượng củ con trung bình từ 1-3 củ/cây.
Rễ:docây thuộc bộ Lilliales nên có hệ rễ chùm gồm nhiều rễ phụ tương đối
đồng đều về kích thước.
d. Quả
Quả nang, hình cầu hay hình thuôn, mở ở khe lưng ô thành 3 mảnh. Hạt nhiều,
dẹp, màu đen nội nhũ nạc bao lấy phôi nhỏ.
1.1.1.2.Yêu cầu ngoại cảnh
Cây Lan huệ mọc tự nhiên ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ, được nhập vào Việt
Nam, trồng làm cảnh trong vườn hay trong chậu. Cây ra hoa vào giai đoạn xuânhè, do đó nếu muốn để hoa nở vào đúng dịp Tết thì các yếu tố ngoại cảnh là điều
kiện vô cùng quan trọng cần chú ý đối với việc sinh trưởng phát triển của cây [2].5
a. Nhiệt độ
Lan huệ có khả năng chịu nóng, ưa khí hậu lạnh và ẩm. Nhiệt độ thích hợp ban
ngày từ 20-28oC, ban đêm 13-17oC, ở ngưỡng nhiệt độ dưới 5oC và trên 30oC cây
sinh trưởng kém, hoa dễ bị mù. Giai đoạn đầu nhiệt độ thấp có lợi cho sinh trưởng
của rễ và sự phân hoá hoa.
b . Ánh sáng
Lan huệ là cây ưa cường độ ánh sáng trung bình, cường độ ánh sáng thích hợp
từ 12.000-15.000lux nhất là thời kỳ cây cao 20-30cm. Muốn điều khiển độ dài của
lá và chiều cao của vòi hoa, chỉ cần điều tiết ánh sáng. Cây nhiều ánh sáng có vòi
hoa và lá ngắn, cây mọc trong bóng râm thường cao và lá dài.
c . Nước
Thời kỳ đầu cây rất cần nước, khi ra hoa giảm bớt nước. Nhiều nước dễ làm
cho củ bị thối, rụng nụ. Độ ẩm đất thay đổi tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của
cây (thường từ 70-85%).
d . Đất
Đất tơi xốp, không chứa mầm bệnh và thoát nước tốt. Lan huệ rất mẫn cảm
với muối, nồng độ muối trong đất cao, cây không hút được nước ảnh hưởng tới sinh
trưởng, ra hoa. Nói chung, hàm lượng muối trong đất không được cao quá
1,5mg/cm2, lượng hợp chất Clo không được vượt quá 1,5mmol/lít, pH = 6,5-7,0.
1.1.1.3.Phân bố
Lan huệ có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được trồng khắp Châu Mỹ nhiệt đới, từ
Mêhico và phía Nam Tây Ấn đến Brazil và Chile [3,4]. Chi Hippeastrumhiện có 70-
76 loài. Ở Việt Nam, chi Hippeastrumcó 2 loài, 1 thứ thường được trồng làm cảnh.
1.1.2.Giá trị kinh tế và sử dụng
Trên thế giới, nhiều loài thuộc chi Hippeastrum được trồng làm cảnh bởi
chúng có ưu điểm là hoa to, đẹp, khá đa dạng về màu sắc, có thể sử dụng dưới dạng
hoa cắt cành, trồng chậu hay trồng thảm. Hoa được sử dụng trong ngày lễ, ngày
tết, được trang trí trong nội thất, hay làm quà tặng rất trang trọng. Hoa mang hương
thơm mát dịu, màu sắc thanh nhã, tính thẩm mỹ cao [5].
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi6
Ở ViệtNam, hoa được sử dụng trong những ngày lễ, ngày tết, được trang
trí trong hội trường, công viên, trong gia đình và làm quà tặng rất trang trọng.
Trong Đông dược, Lan huệ là một vị thuốc quan trọng vì củ có vị ngọt cay,
tính ấm có độc, có tác động tán ứ, tiêu thũng. Thân hành của cây được dùng giã nát
đắp cầm máu và trị tổn thương khi té ngã.
Bên cạnh đó, Lan huệ là một trong những loài hoa có tiềm năng phát triển của
chi Hippeastrum do củ của nó có chứa các biệt dược giá trị như các loại alkaloids
[21], các lectins có hoạt tính chống siêu vi trùng, chống sưng viêm, chống ung thư,
chữa bệnh Alzheimer, cầm máu và chữa vết thương. Các alkaloids trong Lan huệ
đang được nghiên cứu về một số tác động dược học. Trong số các alkaloids,
lycorine (tên cũ Narcissine) là chất được chú ý nhất. Lycorine là một alkaloid loại
isoquinolone (chuyển hóa từ phena thridine), có các hoạt tính sinh học loại cholino
mimetic; ức chế hoạt tính sinh học của men acetylcholinesterase. Các hoạt tính của
Lycorine có tác dụng chống siêu vi trùng, có tác dụng chống sưng-viêm do ức chế
sự sản xuất TNF-alpha (tumor necrosis factor) nơi các đại thực bào của chuột thử
nghiệm; ức chế tiến trình sinh tổng hợp proteins. Vì TNF-alpha là một chất cytokine
căn bản điều hòa tiến trình sưng viêm nên lycorine có triển vọng được dùng làm
thuốc chống sưng, trị thấp khớp.
Hoa Lan huệ ở nước ta hầu như chỉ có màu đỏ, hoa nở trong 1 thời gian ngắn
còn quanh năm nó chỉ có màu xanh biếc của lá.Hoa Lan huệ chỉ trổ bông mỗi năm
một lần, có khi đôi lần nhưng không nhiều cây ra hoa được như thế [5].
1.2.Một số phương pháp nhân giống vô tính cây Lan huệ
1.2.1.Phương pháp tách củ con
Trong quá trình sinh trưởng phát triển, một củ Lan huệ có thể đẻ ra nhiều củ
con ở xung quanh. Có thể tách những củ con đem trồng. Củ con sau khi tách có khả
năng sống rất cao và sớm cho hoa, thông thường sau 18-24 tháng cây sẽ cho hoa.
Khi đường kính củ con được 2-3 cm thì tách khỏi cây mẹ, có thể trồng trong
chậu đất hay chậu nhựa, nếu trồng trong chậu đất thì cần tưới nước thường
xuyên hơn là trong chậu nhựa. Nhúng phần đế của củ cùng với bộ rễ trong nước ấm,7
điều này có tác dụng làm mềm rễ và thuận lợi cho bộ rễ lan ra khắp chậu. Khoét
một hố trên bề mặt đất rộng hơn đường kính củ, đặt củ vào hố sao cho 1/3 củ nổi
trên mặt đất [20].
1.2.2.Phương pháp cắt lát
Kỹ thuật cắt lát (chipping) được sử dụng khá phổ biến nhất là đối với những
cây họ Hành có củ (là những lớp vảy xếp khít nhau xung quanh đỉnh sinh trưởng
trung tâm) như chi Hippeastrum, Narcissus (hoa thủy tiên), Galanthus. Các bước
tiến hành [20]:
1. Chọn những củ Lan huệ bố mẹ khoẻ mạnh không bị nấm bệnh, nhổ củ khi
củ còn ở trạng thái ngủ nghỉ.
2. Dùng dao sắc nhọn sao cho khi cắt lát cắt phẳng, mịn không làm dập nát
củ. Khử trùng bề mặt củ và dao cắt.
3. Cắt bớt phần rễ và phần trên của củ, dùng dao cắt dọc chia đôi củ từ đỉnh
củ xuống phần đế củ, tiếp tục chia nhỏ các nửa hành sao cho mỗi lát đều mang một
phần đế củ. Một củ có thể chia thành 8-16 lát.
4. Các lát được ngâm trong dung dịch thuốc diệt nấm khoảng 10-15 phút lắc
đều, sau đó được vớt ra để ráo nước.
5. Cho mỗi lát vào trong 1 túi nilon có chứa đá trân châu có thêm chất
khoáng, cho nhiều khí vào túi và buộc kín túi. Đưa vào nơi mát và tối với nhiệt độ
thích hợp 20-21oC, thường xuyên kiểm tra dấu hiệu thối hỏng.
6. Sau khoảng 12 tuần các hành con sẽ xuất hiện ở gốc của lát cắt. Tách các
cây con trồng vào giá thể tơi xốp và thoát nước. Cây con rất bé và yếu ớt nên cần
đặt dưới ánh sáng tán xạ một thời gian trước khi đưa ra ngoài ánh sáng trực tiếp.
Phải mất khoảng 2-4 năm cây mới sinh trưởng phát triển thành thục và cho
hoa. Ở Việt Nam, mùa đông không có tuyết và sương giá nên cây sẽ lớn nhanh hơn
và cho hoa sớm hơn so các nước ở xứ lạnh.
Nhân nhanh bằng phương pháp cắt lát củ đã được rất nhiều nhóm tác giả
nghiên cứu cả trong điều kiện in vivovà in vitro. Epharath và cộng sự (2001) đã sử
dụng 7 phương pháp cắt củ [20], chia củ mẹ thành 2, 4, 8, 12, 16, 32 và 48 lát cắt,
mỗi lát cắt đều mang 1 phần đế củ và giâm vào túi nilon có chứa chất khoáng bón
cho cây. Các túi này được đặt trong điều kiện nhiệt độ 230C trong 4 tháng. Kết quả
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi8
cho thấy, khi cắt củ thành 48 phần thì số lượng chồi thu được là cao nhất, 34
chồi/mẫu. Năm 1991, O’Rourke và cộng sự đã cắt củ nhỏ in vitro tạo ra từ vảy củ
đôi trên môi trường tạo củ của loài Hippeastrum hybridum "Apple Blossom” thành 2
hay 4 phần và tiếp tục nuôi cấy trong 10 - 12 tuần. Sau 26 - 28 tuần nuôi cấy, hệ số
nhân thu được đã tăng lên 100 chồi/mẫu ban đầu [32]. Bằng phương pháp cắt củ
này, Slabbert và cộng sự (1993) cũng đã thu được 700 - 1000 cây từ 1 củ ban đầu
sau 12 tháng, cây con thu được khỏe, có sức sống cao [38].
Hình 1.2. Phương pháp cắt lát củ của cây Lan huệ9
1.2.3.Phương pháp nhân giống in vitro
Phương pháp này có ưu điểm là tạo được cây con trẻ hóa và sạch bệnh nên
cây có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao. Đồng thời, thời gian nhân
giống ngắn, hệ số nhân giống cao, cây đồng nhất do vậy đáp ứng được nhu cầu về
số lượng giống có chất lượng cao, ổn định, có thể cung ứng cho sản xuất trên quy
mô rộng.
Đã có một số nghiên cứu bước đầu về nhân in vitro cây Lan huệ, các tác giả
cho biết: Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo chồi ở cây Loa kèn đỏ nhung
(Hippeastrum equestre Herb.) là môi trường MS có bổ sung 5,0 mg/l BA và cây
Lan huệ mạng là môi trường MS có bổ sung 3,0 mg/l BA, 100% mẫu tái sinh tạo
chồi và củ nhỏ. Chồi và củ nhỏ tạo ra được sử dụng cho thí nghiệm nhân nhanh. Đa
số các chồi đều ra rễ. Các cây con in vitro hoàn chỉnh được đưa ra thích nghi với
điều kiện giá thể cát và trấu hun theo tỷ lệ 1:1 [10,11].
1.2.3.1.Cơ sở khoa học
Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người
Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng
minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông, mỗi tế bào được lấy từ bất
kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ thể
hoàn chỉnh. Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền
của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả
năng giống như một hợp tử ban đầu [8].
Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là
khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào. Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của
tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ
thể. Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào chuyên hóa của
cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó – tế bào phôi. Tuy
nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là
khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi10
bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra. Đối với thực vật, khả năng
hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc [25].
Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng sinh
sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được kiểu gen của
mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa. Nhưng ngay từ khi ra đời, công nghệ
nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân giống của con
người [1].
1.2.3.2.Ý nghĩa của phương pháp nhân giống in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô
tính. Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao,
gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitrolà
công cụ vô cùng hữu ích. Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu
tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitrolà
do:
Các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống
cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng
hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần
hóa học. Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất
theo dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều,
làm giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng
nhất về chất lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là
nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với
các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm
lượng các thành phần hoạt chất [1,8].
Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được
áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn. Phương pháp
nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính,
ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền
do duy trì được các tính trạng của cây mẹ, nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho11
sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo
điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của
hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết,
giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu
thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp. Bên cạnh đó, việc sử dụng chính các
bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém.
Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền
thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng
như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều
ưu điểm nổi trội như:
- Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành
hàng triệu cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36
đến 1012 /năm, cao hơn bất cứ cách nhân giống nào.
- Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt
với cây bố mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều
có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế.
- Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được
các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan
tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh
sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch virus.
- Nhân giống in vitrocó thể nhân nhanh cây không kết hạt hay kết hạt kém
trong những điều kiện sinh thái nhất định.
- Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và chiếu
sáng, nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm.
- Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội.
- Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen.
Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitrovẫn không tránh khỏi một
số nhược điểm như:
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi12
- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Nhiều loài thực vật quý hiếm chưa thể
tiến hành nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới lý thuyết nuôi cấy và tái sinh
thực vật.
- Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitrođòi hỏi trang thiết bị hiện đại và
lao động có tay nghề.
- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân là do biến dị
soma, đã làm cho các cây con không giữ được kiểu hình của bố mẹ (đặc biệt là khi
nuôi cấy từ callus).
Trong quá trình nuôi cấy, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình phản
biệt hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh. Mỗi đối tượng thực vật có đặc
tính khác nhau, do đó có những cách thức biến đổi khác nhau, mặc dù kết quả cuối
cùng là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một cách chung
cho tất cả các thực vật.
1.2.3.3.Các cách nhân giống in vitro
Quá trình thực hiện nhân giống in vitrotạo ra các dòng vô tính, theo Shull
(1912) dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được
nhân bằng sinh sản vô tính. Trong nhân giống in vitro, cây con có thể được tái sinh
từ các điểm sinh trưởng có sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc
từ những mô có khả năng hình thành điểm sinh trưởng phụ, các dòng vô tính này sẽ
được tạo ra theo các cách sau [8]:
- Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách.
- Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo.
Tái sinh cây trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm tồn
tại sẵn có trong mô nuôi cấy, phân chia và tái sinh thành cây. Các cây con này được
phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng nhất về
mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ. Tái sinh trực tiếp cũng có
thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng, đó là các đoạn thân,
mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia13
nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng cao
hơn ở trường hợp nói trên.
Với đường hướng tái sinh gián tiếp, mẫu nuôi cấy không tái sinh thành cây
ngay mà phát triển thành khối mô sẹo (callus). Trong môi trường nuôi cấy thích
hợp, thường là với auxin, mẫu nuôi cấy có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào
không tổ chức, đó chính là các tế bào mô sẹo. Sự tăng sinh này có thể được duy trì
nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường
mới theo chu kỳ. Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn
định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới
phát sinh. Nhiều cây tái sinh từ mô sẹo có thể rất khác với cây mẹ về mặt di truyền.
Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong quá trình phát sinh và phát triển của
mô sẹo, thường xuất hiện những tế bào đột biến mang số nhiễm sắc thể không giống
với tế bào ban đầu hay chứa những đột biến gen do hiện tượng nội nguyên nhân
(endomitosits hay endoreduplication). Nội nguyên nhân là hiện tượng nhân đôi
nhiễm sắc thể không kèm theo sự phân bào trong thực tế và là một hiện tượng tự
nhiên trong cơ thể thực vật, nhưng tăng lên dưới ảnh hưởng của cá thành phần của
môi trường dinh dưỡng và điều kiện cũng như phương pháp nuôi cấy, nhất là khi
cấy chuyển nhiều lần. Đột biến tuy không có lợi cho việc duy trì nguyên trạng
những đặc tính di truyền (trueness – to – type) trong quá trình tạo giống nhưng lại
chính là đối tượng tìm kiếm trong quá trình cải tạo giống.Nuôi cấy mô sẹo có vai trò
vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin và cytokinin
trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma; từ đó có
thể tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu
nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt nhân tạo. Hệ số nhân của con đường này
vô cùng lớn. Từ một khối mô sẹo có thể tạo ra phôi soma hay chế ra hạt giống
nhân tạo. Ngoài việc cung cấp những đột biến tự nhiên, mô sẹo còn là đối tượng lý
tưởng để tạo ra những đột biến nhân tạo bằng các tác nhân gây đột biến hay công
nghệ gen.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
<<<<
Kết luận
Từ những kết quảnghiên cứu đã tiến hành rút ra một số kết luận sau:
1. Giai đoạn nuôi cấy khởi động:
Thời gian khử trùng thích hợp bằng HgCl20,1% cho 5 dòng Lan huệH2, H4,
H9, H10, H18 là trong thời gian 9 phút .
Môi trường nền (MTN): MS + 30 g/l Saccharose + 5,8 g/l agar.
Vật liệu nuôi cấy của 5 dòng H2, H4, H9, H10, H18 là: Vảy củ đôi có dính đế
củ và đế củ.
2. Nhân nhanh từ vảy củ đôi
Môi trường tối ưu cho nhân nhanh chồi in vitro từ vảy củ đôi là:
- Dòng H2, H4, H9:
MTN + 5,0mg/lBA + 0,75 mg/lKinetin + 0,25- 0,5 mg/l α-NAA;
- Dòng H10, H18:
MTN + 3,0mg/l BA + 1,0mg/l Kinetin + 0,25 - 0,5 mg/l α-NAA;
Hệ số nhân chồi đạt 4,5 – 5,4 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 10,1 – 13,1 cm.
3. Nhân nhanh từ đế củ
Môi trường tối ưu tạo mô sẹo từ đế củ là:
- Dòng H9, H18: MTN +3,0 mg/l BA + 1,5mg/l α-NAA
- Dòng H2, H4, H10: MTN +2,0 mg/l BA + 1,0 mg/l α-NAA
Môi trường tối ưu phát sinh chồi từ mô sẹo của các dòng Lan huệ là:
- Dòng H10: MTN + 1,0 mg/l Kinetin + 4,0 mg/l BA;
- Dòng H18:MTN + 1,0 mg/l Kinetin + 5,0 mg/l BA;
Hệ số nhân chồi dòng H10 đạt 5,7 chồi/mẫu và 6,5 chồi/mẫu với dòng H18.
4.
Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Bổ sung60ml/l nước dừa hay 60-80g/l Saccharose vào môi trườngcó hiệu
quả tốt trong việc nâng cao chất lượng chồi in vitro của các dòng Lan huệ.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator: