Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối
Chương 1. TỔNG QUAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.Tổng quan về vùng phiên mã nội của ADN ribosom (ITS-rADN) . . . . . . . . . . . 3
1.1.1.Cấu trúc ITS-rADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.2.Vai trò của ITS-rADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.1.3.Ứng dụng của ITS-rADN trong nghiên cứu cây thuốc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cây thuốc trên thế giới và ở Việt Nam 8
1.2.1.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cây thuốc trên thế giới . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.2.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cây thuốc ở Việt Nam . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3.Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.3.1.Giới thiệu về họ Cam (Rutaceae) và chi Xuyên tiêu (Zanthoxylum). . . . . . . . . 10
1.3.2.Loài Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3.3.Tình hình nghiên cứu và sử dụng loài Muồng truổng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.1.Đối tượng nghiên cứu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.2.Hóa chất, sinh phẩm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.3.Trang thiết bị . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.2.Phương pháp nghiên cứu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.2.1.Phương pháp tách chiết ADN tổng số . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2.2.Phương pháp khuếch đại ADN bằng PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2.3.Phương pháp điện di ADN trên gel agarose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.2.4.Phương pháp tách dòng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.2.5.Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào khả biến E.coli . . . . . . . . . . . 22
2.2.6.Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.2.7.Phương pháp cắt ADN bằng enzym giới hạn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.2.8.Phương pháp tinh sạch ADN plasmid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.2.9.Phương pháp giải trình tự ADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.2.10.Phương pháp so sánh trình tự ADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Chương 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.1.Kết quả tách chiết ADN tổng số từ lá cây Muồng truổng …………………….……28
3.2.Kết quả khuếch đại ADN bằng PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.3.Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.4.Kết quả tinh sạch plasmid tái tổ hợp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.5. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của 5 mẫu Muồng truổng . . . . . . . . . 33
3.6.Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.6.1.Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu Muồng truổng.35
3.6.2.Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu Muồng truổng với 2 trình tự
của chi Zanthoxylum được công bố trên ngân hàng gen thế giới . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.6.3.Kết quả cây phân loại trình tự ITS-rADN của 5 mẫu Muồng truổng. . . . . . . . 38
Chương 4. BÀN LUẬN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1. Về quy trình xác định trình tự ITS-rADN của loài Muồng truổng. . . . . . . . 40
4.2. Về sự đa dạng di truyền của loài Muồng truổng ở Việt Nam . . . . . . . . . . . . . 41
KẾT LUẬN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
ĐỀ XUẤT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam được đánh giá là quốc gia có nguồn cây thuốc tự nhiên phong phú và đa dạng
về chủng loại lẫn công dụng làm thuốc. Tuy nhiên hiện nay chỉ có khoảng 5% số loài có công
dụng làm thuốc được giới thiệu và đưa vào khai thác, số loài chưa được nghiên cứu và đánh giá
hiện còn rất lớn [3]. Cùng với đó nhu cầu sử dụng cây thuốc hàng năm trong nước ngày càng
tăng, trong khi nguồn cây thuốc tự nhiên lại chưa được quản lý khai thác chặt chẽ dẫn đến cạn
kiệt về số lượng và mất dần tính đa dạng. Trong bối cảnh như vậy cần nhanh chóng thực hiện
những biện pháp nhằm bảo vệ, sử dụng và phát triển nguồn cây thuốc một cách hợp lý. Trong số
những biện pháp cần thiết hiện nay, đánh giá đa dạng di truyền nguồn cây thuốc có vai trò đặc
biệt quan trọng. Việc làm này có nhiều ý nghĩa trong nghiên cứu, khai thác và sử dụng nguồn
cây thuốc, như: xây dựng và bảo tồn nguồn gen; chọn tạo giống cho năng suất cao, chất lượng
tốt; xác định nguồn gốc, quan hệ tiến hóa; nhận diện dược liệu một cách chính xác. Ngoài ra
những dữ liệu về cấu trúc gen của các quần thể cây thuốc còn cần thiết cho chiến lược khai thác
và sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên cây thuốc [14], [30].
Để đánh giá đa dạng di truyền cây thuốc, hiện nay trên thế giới có nhiều loại chỉ thị ADN
và marker phân tử được sử dụng như RAPD-PCR, AFLP, ITS-rADN, ADN lạp thể… Trong số
đó trình tự vùng phiên mã nội của ADN ribosom (ITS-rADN) được biết đến là marker phân tử
có nhiều ưu điểm nổi trội trong đánh giá đa dạng di truyền như tính chất vừa bảo thủ, vừa siêu
biến có thể giúp xác định nguồn gốc và quan hệ tiến hóa giữa các loài hay giữa các cá thể trong
cùng một loài, hay có độ lặp lại cao trong ADN nhân giúp thực hiện các kĩ thuật khuếch đại, giải
trình tự dễ dàng hơn [16], [40]. Mặc dù được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền thực
vật trên thế giới nhưng trình tự vùng phiên mã nội của ADN ribosom lại hầu như chưa được sử
dụng trong đánh giá đa dạng di truyền cây thuốc ở Việt Nam.
Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) là vị thuốc từ lâu đã được dân gian
sử dụng để chữa bệnh mẩn ngứa, lở loét [10]. Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy
tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư, tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Muồng
truổng [21], [43]. Bên cạnh đó rễ, lá cây Muồng truổng chứa nhiều hợp chất thuộc các nhóm:
alkaloid (chiếm phần lớn là berberin), terpenoid (tinh dầu), flavanoid và coumarin [5]. Có thể
thấy Muồng truổng là cây thuốc có nhiều tiềm năng trong nghiên cứu sản xuất dược phẩm. Tuy
nhiên ở nước ta hiện chưa có nhiều nghiên cứu về loài Muồng truổng, những nghiên cứu về
Muồng truổng mới chỉ dừng lại ở việc xác định thành phần hóa học. Do vậy cần đẩy mạnh nhiều
nghiên cứu trên loài Muồng truổng hơn nữa, trong đó bao gồm các nghiên cứu về di truyền, bảo
tồn gen.
Xuất phát từ những lý do trên đề tài
“Đánh giá đa dạng trình tự ADN ITS của loài Muồng truổng ở Việt Nam” được
thực hiên với hai mục tiêu sau:
1. Xác định trình tự vùng ITS-rADN của 5 mẫu loài Muồng truổng (Zanthoxylum
avicennae (Lam.) DC.) thu hái ở các vùng khác nhau của Việt Nam.
2. So sánh trình tự vùng ITS-rADN giữa 5 cá thể loài Muồng truổng (Zanthoxylum
avicennae (Lam.) DC.) ở Việt Nam với nhau và với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen thế
giới, qua đó đánh giá đa dạng di truyền loài Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.)
ở Việt Nam.
Chương 1. TỔNG QUAN
Tổng quan về vùng phiên mã nội của ADN ribosom (ITS-rADN)
Cấu trúc ITS-rADN
Trong cả chuỗi ADN nhân của tế bào thực vật, khu vực được nghiên cứu nhiều nhất là
vùng ADN ribosom 18S-26S và hai vùng phiên mã nội (ITS1, ITS2) với nhiều đoạn lặp về trình
tự nucleotid [15]. Dưới đây là sơ đồ thể hiện cấu trúc tổng thể của ADN ribosom .
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Chương 1. TỔNG QUAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.Tổng quan về vùng phiên mã nội của ADN ribosom (ITS-rADN) . . . . . . . . . . . 3
1.1.1.Cấu trúc ITS-rADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.2.Vai trò của ITS-rADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.1.3.Ứng dụng của ITS-rADN trong nghiên cứu cây thuốc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cây thuốc trên thế giới và ở Việt Nam 8
1.2.1.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cây thuốc trên thế giới . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.2.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cây thuốc ở Việt Nam . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3.Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.3.1.Giới thiệu về họ Cam (Rutaceae) và chi Xuyên tiêu (Zanthoxylum). . . . . . . . . 10
1.3.2.Loài Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3.3.Tình hình nghiên cứu và sử dụng loài Muồng truổng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.1.Đối tượng nghiên cứu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.2.Hóa chất, sinh phẩm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.3.Trang thiết bị . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.2.Phương pháp nghiên cứu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.2.1.Phương pháp tách chiết ADN tổng số . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2.2.Phương pháp khuếch đại ADN bằng PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2.3.Phương pháp điện di ADN trên gel agarose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.2.4.Phương pháp tách dòng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.2.5.Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào khả biến E.coli . . . . . . . . . . . 22
2.2.6.Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.2.7.Phương pháp cắt ADN bằng enzym giới hạn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.2.8.Phương pháp tinh sạch ADN plasmid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.2.9.Phương pháp giải trình tự ADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.2.10.Phương pháp so sánh trình tự ADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Chương 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.1.Kết quả tách chiết ADN tổng số từ lá cây Muồng truổng …………………….……28
3.2.Kết quả khuếch đại ADN bằng PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.3.Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.4.Kết quả tinh sạch plasmid tái tổ hợp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.5. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của 5 mẫu Muồng truổng . . . . . . . . . 33
3.6.Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.6.1.Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu Muồng truổng.35
3.6.2.Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu Muồng truổng với 2 trình tự
của chi Zanthoxylum được công bố trên ngân hàng gen thế giới . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.6.3.Kết quả cây phân loại trình tự ITS-rADN của 5 mẫu Muồng truổng. . . . . . . . 38
Chương 4. BÀN LUẬN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1. Về quy trình xác định trình tự ITS-rADN của loài Muồng truổng. . . . . . . . 40
4.2. Về sự đa dạng di truyền của loài Muồng truổng ở Việt Nam . . . . . . . . . . . . . 41
KẾT LUẬN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
ĐỀ XUẤT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam được đánh giá là quốc gia có nguồn cây thuốc tự nhiên phong phú và đa dạng
về chủng loại lẫn công dụng làm thuốc. Tuy nhiên hiện nay chỉ có khoảng 5% số loài có công
dụng làm thuốc được giới thiệu và đưa vào khai thác, số loài chưa được nghiên cứu và đánh giá
hiện còn rất lớn [3]. Cùng với đó nhu cầu sử dụng cây thuốc hàng năm trong nước ngày càng
tăng, trong khi nguồn cây thuốc tự nhiên lại chưa được quản lý khai thác chặt chẽ dẫn đến cạn
kiệt về số lượng và mất dần tính đa dạng. Trong bối cảnh như vậy cần nhanh chóng thực hiện
những biện pháp nhằm bảo vệ, sử dụng và phát triển nguồn cây thuốc một cách hợp lý. Trong số
những biện pháp cần thiết hiện nay, đánh giá đa dạng di truyền nguồn cây thuốc có vai trò đặc
biệt quan trọng. Việc làm này có nhiều ý nghĩa trong nghiên cứu, khai thác và sử dụng nguồn
cây thuốc, như: xây dựng và bảo tồn nguồn gen; chọn tạo giống cho năng suất cao, chất lượng
tốt; xác định nguồn gốc, quan hệ tiến hóa; nhận diện dược liệu một cách chính xác. Ngoài ra
những dữ liệu về cấu trúc gen của các quần thể cây thuốc còn cần thiết cho chiến lược khai thác
và sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên cây thuốc [14], [30].
Để đánh giá đa dạng di truyền cây thuốc, hiện nay trên thế giới có nhiều loại chỉ thị ADN
và marker phân tử được sử dụng như RAPD-PCR, AFLP, ITS-rADN, ADN lạp thể… Trong số
đó trình tự vùng phiên mã nội của ADN ribosom (ITS-rADN) được biết đến là marker phân tử
có nhiều ưu điểm nổi trội trong đánh giá đa dạng di truyền như tính chất vừa bảo thủ, vừa siêu
biến có thể giúp xác định nguồn gốc và quan hệ tiến hóa giữa các loài hay giữa các cá thể trong
cùng một loài, hay có độ lặp lại cao trong ADN nhân giúp thực hiện các kĩ thuật khuếch đại, giải
trình tự dễ dàng hơn [16], [40]. Mặc dù được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền thực
vật trên thế giới nhưng trình tự vùng phiên mã nội của ADN ribosom lại hầu như chưa được sử
dụng trong đánh giá đa dạng di truyền cây thuốc ở Việt Nam.
Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) là vị thuốc từ lâu đã được dân gian
sử dụng để chữa bệnh mẩn ngứa, lở loét [10]. Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy
tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư, tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Muồng
truổng [21], [43]. Bên cạnh đó rễ, lá cây Muồng truổng chứa nhiều hợp chất thuộc các nhóm:
alkaloid (chiếm phần lớn là berberin), terpenoid (tinh dầu), flavanoid và coumarin [5]. Có thể
thấy Muồng truổng là cây thuốc có nhiều tiềm năng trong nghiên cứu sản xuất dược phẩm. Tuy
nhiên ở nước ta hiện chưa có nhiều nghiên cứu về loài Muồng truổng, những nghiên cứu về
Muồng truổng mới chỉ dừng lại ở việc xác định thành phần hóa học. Do vậy cần đẩy mạnh nhiều
nghiên cứu trên loài Muồng truổng hơn nữa, trong đó bao gồm các nghiên cứu về di truyền, bảo
tồn gen.
Xuất phát từ những lý do trên đề tài
“Đánh giá đa dạng trình tự ADN ITS của loài Muồng truổng ở Việt Nam” được
thực hiên với hai mục tiêu sau:
1. Xác định trình tự vùng ITS-rADN của 5 mẫu loài Muồng truổng (Zanthoxylum
avicennae (Lam.) DC.) thu hái ở các vùng khác nhau của Việt Nam.
2. So sánh trình tự vùng ITS-rADN giữa 5 cá thể loài Muồng truổng (Zanthoxylum
avicennae (Lam.) DC.) ở Việt Nam với nhau và với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen thế
giới, qua đó đánh giá đa dạng di truyền loài Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.)
ở Việt Nam.
Chương 1. TỔNG QUAN
Tổng quan về vùng phiên mã nội của ADN ribosom (ITS-rADN)
Cấu trúc ITS-rADN
Trong cả chuỗi ADN nhân của tế bào thực vật, khu vực được nghiên cứu nhiều nhất là
vùng ADN ribosom 18S-26S và hai vùng phiên mã nội (ITS1, ITS2) với nhiều đoạn lặp về trình
tự nucleotid [15]. Dưới đây là sơ đồ thể hiện cấu trúc tổng thể của ADN ribosom .
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links