Underwear_daquang
New Member
Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết Nối
TÓM TẮT
BÙI THỊ THANH TỊNH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, “Hoàn thiện
quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α”, đƣợc thƣc hiện
tại Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh và Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật-Trƣờng
Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Giáo viên hƣớng dẫn: thầy Lê Đình Đôn.
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 02 năm 2006 đến tháng 08 năm 2006 với các nội
dung:
Hoàn thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp theo phƣơng pháp sử dụng
hoá chất.
Hoàn thiện quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α..
Hoàn thiện quy trình chiết tách plasmid, phản ứng cắt plasmid để kiểm tra.
Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ phản ứng PCR và plasmid sau khi
cắt.
Thiết lập phản ứng chèn đoạn DNA vào plasmid pBluescript.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Thiết lập đƣợc quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hoá chất, tế bào khả
nạp có thể giữ ở -70oC với glycerol trong thời gian 2 tháng.
Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli DH5α.
Chiết tách plasmid không lẫn tạp theo quy trình của Sambrook và cộng sự có
sửa đổi.iii
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn...................................................................................................................i
Tóm tắt........................................................................................................................ii
Mục lục ......................................................................................................................iii
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................vii
Danh sách các hình ...................................................................................................vii
Danh sách các bảng ...................................................................................................ix
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề.............................................................................................................1
1.2 Mục tiêu của đề tài................................................................................................2
1.3 Nội dung thực hiện ...............................................................................................2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................3
2.1 Hiện tƣơng biến nạp ở vi khuẩn ...........................................................................3
2.1.1 Giới thiệu về hiện tƣợng biến nạp................................................................3
2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tƣợng biến nạp................................3
2.1.3 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp...................................................................5
2.1.4 Vai trò của hiện tƣợng biến nạp...................................................................5
2.1.5 Ứng dụng của hiện tƣợng biến nạp..............................................................5
2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp .....................................................6
2.2.1 Khái niệm chung các vector.........................................................................6
2.2.2 Plasmid.........................................................................................................7
2.2.2.1 Cấu trúc ...............................................................................................7
2.2.2.2 Tính chất của plasmid..........................................................................8
2.2.2.3 Phân loại plasmid ................................................................................8
2.2.3 Phage............................................................................................................9
2.2.4 Chủng chủ E.coli..........................................................................................9
2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp .........................................................................10
2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) .....................................................................11
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiiv
2.3.1.1 Hiện tƣợng giới hạn...........................................................................11
2.3.1.2 Tên gọi các RE ..................................................................................11
2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn ....................................................................12
2.3.1.4 Các RE loại II ....................................................................................12
2.3.2 Các enzym thông dụng khác ......................................................................15
2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I)........................................................15
2.3.2.2 Taq polymerase .................................................................................15
2.3.2.3 Terminal transferase ..........................................................................15
2.3.2.4 Các DNase .........................................................................................15
2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa .........................................................16
2.3.3 Các enzym nối DNA..................................................................................16
2.3.3.1 E.coli DNA ligase..............................................................................16
2.3.3.2 T4 DNA ligase...................................................................................16
2.4 Các phƣơng pháp sử dụng trong biến nạp ..........................................................17
2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp.............................................................................17
2.4.1.1 Phƣơng pháp hóa biến nạp ................................................................17
2.4.1.2 Phƣơng pháp điện biến nạp ...............................................................18
2.4.2 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp...................18
2.4.3 Chiết tách DNA plasmid............................................................................19
2. 5 Điện di (Electrophoresis)...................................................................................19
2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nƣớc và ngoài nƣớc ..................................20
2.6.1 Ngoài nƣớc.................................................................................................20
2.6.2 Trong nƣớc.................................................................................................21
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................22
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp .......................................22
3.2 Vật liệu nghiên cứu.............................................................................................22
3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α...............................................................................22
3.2.2 pBluescript II SK(+/-) ................................................................................22
3.2.3 Đoạn DNA .................................................................................................23
3.3 công cụ và hóa chất ...........................................................................................23
3.3.1 công cụ thí nghiệm....................................................................................23v
3.3.2 Các thiết bị máy móc .................................................................................23
3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn......................................................23
3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm ...................................................24
3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm......................................................24
3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................25
3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn .......................................25
3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn
E.coli DH5α và kiểm tra ..........................................................................26
3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E.coli DH5α trên môi trƣờng LB ...............................27
3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp.............................................................................27
3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn
E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
(theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi).................................27
3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra...............................29
3.4.6.1 Chiết tách plasmid .............................................................................29
3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid
(quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) ......................................32
3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose .....................................................32
3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR..................................33
3.4.7.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA.............................................................33
3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel ........................................................33
3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX...................34
3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR ...............................35
3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn
DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) ................................................36
3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α
khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) ............37
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................38
4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn..........................................38
4.2 Tách chiết DNA plasmid ....................................................................................40
4.2.1 Tách chiết DNA plasmid ...........................................................................40
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phivi
4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTM Plasmid Mini Kit .....................42
4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV...................................42
4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII................................44
4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA..................................................................................44
4.4.2 Tinh sạch plasmid ......................................................................................45
4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp................................................................................46
4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp .............................................................................46
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................48
5.1 Kết luận...............................................................................................................48
5.2 Kiến nghị ............................................................................................................49vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp base pair
CFU Colony Form Unit
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP 3’- Deoxyribonucleoside- 5’- triphosphate
ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside
MCS Multiple cloning Site
OD Optical Density
PCR Polymerase Chain Reaction
RE Restriction Enzyme
RNA Ribonucleic acid
RFLP Restriction fragment length polymorphism
SDS Sodium dodecyl sulfate
TAE Tris Acetate EDTA
Taq Thermus aquaticus
Kb kilobase
dATP deoxyadenosine triphosphate
dGTP deoxyguanosine triphosphate
dCTP deoxycytidine triphosphate
dTTP deoxythymidine triphosphate
Tris- HCL (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride
UV Ultraviolet (light)
X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dglactopyranoside
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiviii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp ..................................................................6
Hình 2.2 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning ........................................................8
Hình 2.3 Hình thái của Escherichia coli .................................................................10
Hình 2.4 Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn.................................................................13
Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA .................................35
Hình 4.1 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 10:1.5............................38
Hình 4.2 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 3:0.5..............................39
Hình 4.3 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 1)............................41
Hình 4.4 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 2).........................41
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm tách
chiết DNA plasmid bằng Kit trên gel agarose 1% ...................................................42
Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt
plasmid bằng EcoRV trên gel 1% (lần 1) .................................................................42
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% (lần 2) ........................43
Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1%.................43
Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1% ....................43
Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn
DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX.............................................45
Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA
bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX.......................................................45
Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch trên gel agarose1%................................46
Hình 1 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) ....................................................................55
Hình 2 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-) .........................................................56ix
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BẢNG
Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MCS của plasmid pBluescript II SK (+/-).........................23
Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. Coli ........................25
Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA
vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra......................................................................26
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay với sự phát triển nhƣ vũ bão của khoa học công nghệ, đặc biệt trong
đó công nghệ sinh học là lĩnh vực đã đạt đƣợc những thành quả quan trọng và hứa hẹn
đem lại những lợi ích vô cùng to lớn trong tƣơng lai cho con ngƣời. Các nghiên cứu
hiện nay đang tập trung vào việc chuyển gen để tăng năng suất cây trồng, tạo ra những
giống mới có chức năng vƣợt trội.
Tuy nhiên, việc nghiên cứu và phân tích ở mức phân tử DNA thƣờng gặp khó
khăn lớn về số lƣợng và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm. Để giải quyết
vấn đề này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt động của gen, sự
biểu hiện ra protein và cấu trúc của protein, ngƣời ta chú trọng tới việc phân lập và thu
nhận đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lƣợng lớn để tiến hành
nghiên cứu. Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen
chúng ta quan tâm thƣờng chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào. Vì vậy chúng
ta không thể sử dụng các phƣơng pháp sinh hoá thông thƣờng để phân lập gen mục
tiêu trên bộ gen.
Những vấn đề trên có thể đƣợc giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có
khả năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phƣơng tiện mang gen, biến nạp gen,
tăng bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen. Các cấu trúc DNA
dùng cho mục tiêu này gọi là vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào
thích hợp sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ
gen của tế bào. Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ. Tế
bào chủ thƣờng đƣợc chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và
các đặc tính thuận lợi cho các thao tác trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi
là dòng tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp hay dùng
cho các thao tác trên gen. Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA
cloning. Mục đích của tạo dòng nhằm thu đƣợc số lƣợng lớn và tinh khiết các trình tự
DNA hay thu nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu.
Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến
thức về kĩ thuật di truyền đƣợc tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tui tiến hành2
thực hiện đề tài “ Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.
coli DH5α” phát triển từ đề tài: “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế
bào vi khuẩn E. coli DH5α” do Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trƣờng đại học Nông
Lâm TPHCM thực hiện.
1.2 Mục tiêu của đề tài
Hoàn thiện quy trình chèn một đoạn DNA bất kỳ vào plasmid pBluescript và
chuyển plasmid tái tổ hợp này vào tế bào kí chủ E. coli DH5α.
1.3 Nội dung thực hiện
- Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli DH5α.
- Thiết lập qui trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất.
- Thiết lập phƣơng pháp biến nạp plasmid DNA chƣa tái tổ hợp vào tế bào vi
khuẩn E. coli DH5α bằng hóa chất và sốc nhiệt.
- Phƣơng pháp tách chiết plasmid chƣa tái tổ hợp bằng SDS-kiềm thể biến nạp,
kết hợp với phản ứng cắt enzyme giới hạn để kiểm tra.
- Chuẩn bị đoạn DNA để chèn.
- Cắt và tinh sạch vector.
- Phản ứng sữa chữa sai sót trên đoạn DNA từ sản phẩm PCR chèn, nhằm tạo ra
đoạn DNA có đầu bằng.
- Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid sau khi cắt bằng enzyme giới hạn
- Phản ứng nối giữa vector và DNA chèn.
- Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào.
- Kiểm tra thể biến nạp trên môi trƣờng có chứa Ampicillin, X-gal, IPTG.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn
2.1.1 Giới thiệu về hiện tƣợng biến nạp
Biến nạp là phƣơng pháp đơn giản nhất hiện có để đƣa DNA tái tổ hợp vào
trong tế bào. Trong trƣờng hợp các tế bào E. coli thì biến nạp có nghĩa là đƣa DNA
plasmid vào trong tế bào. Biến nạp còn đƣợc sử dụng với nghĩa rộng hơn, cụ thể là đƣa
bất kỳ DNA nào vào bất kỳ tế bào nào.
Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn đƣợc Frederick Griffith mô tả vào năm 1928
trong thí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là “nguyên lí biến nạp”. Trên thực tế phát
minh này về sau đã chứng minh rằng các gen đƣợc cấu thành từ DNA. Tuy nhiên
không phải tất cả vi khuẩn đều biến nạp một cách dễ dàng. Để cho biến nạp ở E. coli
có hiệu quả, các tế bào cần trở nên khả biến (competent). Để đạt đƣợc điều này, ngƣời
ta ngâm các tế bào trong dung dịch calcium chloride lạnh đông đá, khi đó các tế bào
trở nên khả biến theo một cách mà cho đến nay chƣa rõ nguyên nhân. Việc biến nạp
các tế bào khả biến đƣợc thực hiện bằng cách trộn DNA plasmid với các tế bào, rồi ủ
trong đá 20 đến 30 phút, sau đó tạo một sốc nhiệt ngắn (2 phút ở 420C), làm nhƣ vậy
DNA sẽ chui vào tế bào. Các tế bào biến nạp thƣờng đƣợc ủ trong nƣớc thịt dinh
dƣỡng ở 370C trong vòng 60 đến 90 phút để làm cho các plasmid ổn định và biểu hiện
các tính trạng của chúng ra kiểu hình. Sau đó, các tế bào đƣợc đƣa lên môi trƣờng
chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmid (Lê Đình Lƣơng, 2001).
2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tƣợng biến nạp
Hiện tƣợng biến nạp đòi hỏi sự thể hiện của gen mã hóa cho những thành phần
mà DNA gắn vào, sau đó sẽ đƣợc hấp thụ.
Trong tự nhiên, khi nồng độ các chất dinh dƣỡng hay nồng độ oxy giảm đến
mức tối thiểu ảnh hƣởng đến sự sống của vi khuẩn, lúc này tế bào sẽ bị thay đổi về cấu
trúc cũng nhƣ đặc tính sinh lý sinh hóa, màng tế bào bị biến tính dẫn đến sự hình thành
các kênh vận chuyển dạng lỏng, DNA sẽ theo các kênh này đi vào nhờ việc tiếp xúc
với màng và nhận đƣợc sự hỗ trợ của hệ thống vận chuyển bên trong tế bào.
Hệ thống vận chuyển này đƣợc hình thành trên cơ sở enzym gây biến tính một
số protein màng. Enzym ComC có bản chất là một peptidase phân cắt protein ComG4
của màng tế bào làm cho nó không còn tính trọn vẹn của một protein màng, từ đó
chúng đƣợc hoạt hoá. Có 7 protein cùng dạng với ComG, tất cả chúng đều có thể tạo
ra cấu trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA. ComEA là thể nhận để DNA đi vào tế
bào. ComEC có thể tạo ra kênh vận chuyển dạng dịch và qua đó DNA đi vào tế bào
(Leendert W.Hamoen và cộng sự, 1998).
ComFA là một dạng helycase có chức năng phối hợp với ComEA và ComEC
để đƣa sợi DNA mạch đơn vào tế bào. Trong quá trình chuyển nạp sợi DNA mạch đôi
bám vào đầu Carboxyl của ComEA và đƣợc phân ra thành những đoạn dƣới tác động
của endonuclease (hiện nay đã xác định đó là NucA), phần đầu cuối mới đƣợc cắt ra
này đƣợc đƣa tới ComEC và ComEA để chúng vận chuyển vào tế bào.
Sự phiên mã của gen “late competence” mã hoá cho bộ máy gắn kết và hấp thụ
DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) cũng nhƣ các yếu tố cần cho sự tái tổ hợp (recA,
addAB) đòi hỏi một yếu tố có khả năng kích hoạt sự phiên mã.
ComK là yếu tố hoạt hoá sự phiên mã. ComK đƣợc điều chỉnh chính xác sự
biểu hiện của nó. Sự biểu hiện của ComK đƣợc quy định bởi một mạng lƣới phức tạp
bao gồm AbrB, ComA, sinR và MecAB. Trong các thí nghiệm thực hiện năm 1998,
Leendert W.Hamoen và cộng sự đã chỉ ra rằng ComK nhận biết một vùng trình tự
ngắn giàu A/T, đƣợc sắp xếp trong một khung đọc đặc trƣng và linh động dọc theo sợi
xoắn DNA. Phân tích footfrinting các gốc hydroxyl của ComK bám vào addAB
promoter cho phép họ kết luận rằng ComK bám vào vùng trình tự giàu A/T
AAAAN5TTTT.
ComK đƣợc điều hoà âm bởi sự bám vào của AbrB và CodY, đƣợc hoạt hoá
dƣơng bởi AbrB, sinR, DegU. CodY là một GTP-binding protein nhạy cảm với nồng
độ GTP nội bào nhƣ là một chỉ thị về dinh dƣỡng, nó điều hoà sự phiên mã ở phần đầu
phare ổn định và sự phiên mã của gen quy định sự hình thành bào tử. Từ đó, cho phép
tế bào thích nghi với những giới hạn về dinh dƣỡng. DegU giúp cho ComK bám chặt
hơn vào ComK promoter, điều này đảm bảo sự phiên mã chính xác ngay cả khi nồng
độ ComK thấp.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi5
2.1.3 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp
Tế bào vi khuẩn có thể cho DNA xâm nhập vào tế bào đƣợc là do trong một
giai đoạn tăng trƣởng nào đó của tế bào, trên bề mặt của tế bào có hiện diện những
điểm tiếp nhận đặc biệt gọi là nhân tố dung nạp (competent factor). Nhân tố này có
khả năng tiếp nhận đoạn ngắn DNA từ môi trƣờng bên ngoài để đƣa vào bên trong tế
bào vi khuẩn, nhờ đó xảy ra tái tổ hợp.
Muốn thực hiện sự biến nạp cần có 2 điều kiện: (1) Phải có trong môi
trƣờng các đoạn DNA, (2) Khả năng dung nạp DNA của vi khuẩn nhận.
Không phải tất cả các vi khuẩn đều nhận DNA vào nhƣ nhau, mà cần sử
dụng một số chất để tạo lỗ trên vách tế bào, giúp sự xâm nhập dễ dàng của DNA nhƣ:
CaCl2 50mmol, LiCl.
Quá trình biến nạp gồm 5 giai đoạn:
- Sự tiếp xúc của DNA lạ với tế bào nhận
- Sự xâm nhập của DNA vào tế bào nhận
- Sự liên kết của DNA lạ với đoạn tƣơng đồng của nhiễm sắc thể tế bào nhận
- Sự đồng hóa phân tử DNA lạ vào DNA của tế bào nhận nhờ tái tổ hợp
- Sự nhân lên của nhiễm sắc thể có DNA biến nạp
2.1.4 Vai trò của hiện tƣợng biến nạp
Hiện tƣợng biến nạp giúp các loài vi khuẩn có thêm các tính trạng mới dễ thích
nghi với môi trƣờng sống.
Đó là cơ sở của tiến hóa và đa dạng vi sinh vật.
2.1.5 Ứng dụng của hiện tƣợng biến nạp
Biến nạp DNA vào vi khuẩn là bƣớc đầu trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp.
Kỹ thuật tái tổ hợp cho phép chuyển một gen từ động vật, cây trồng vào vi khuẩn
và ở đó một lƣợng lớn sản phẩm mong muốn của gen sẽ đƣợc tạo ra, sau đó kết hợp với
các phƣơng pháp chiết xuất và tinh sạch để phục vụ cho mục đích của con ngƣời.
Biến nạp gen vào vi khuẩn còn giúp thực hiện những nghiên cứu khác nhƣ
đọc trình tự gen, kiểm tra đa dạng sinh học, hay bảo quản sự ổn định của đoạn gen
đƣợc dễ dàng.6
2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp
2.2.1 Khái niệm chung các vector
Vector có bản chất là DNA, thƣờng dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó
có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và mƣợn bộ máy tế bào của vi khuẩn để tạo
ra nhiều bản sao khác giống hệt vector ban đầu. Một vector cần có các đặc điểm tiêu
chuẩn nhƣ sau:
- Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc sự sao
chép bộ gen tế bào chủ.
- Có những đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứa
chúng. Các đặc tính này thƣờng đƣợc mã hoá bởi các gen chọn lọc. Thông thƣờng là
các gen kháng kháng sinh (ampicillin, tetracyline). Ngoài ra, gen chọn lọc cũng có thể
là gen mã hóa cho enzyme (ví dụ β-galactosidase, luciferase) chuyển hóa cơ chất cho
phép quan sát một cách dễ dàng (tạo màu hay phát sáng theo thứ tự)
Chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 2 (ở thể tích biến nạp là 3:0.5, và dịch biến
nạp đã pha loãng ½ khi trang lên đĩa) cho kết quả tốt hơn chọn lọc thể biến nạp theo
quy trình 1 (ở thể tích biến nạp 3:0.5, và dịch biến nạp không pha loãng khi trang lên
đĩa) và chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 3 (ở thể tích biến nạp là 10:1.5).
Biến nạp theo quy trình 1 cho kết quả chỉ vài khuẩn lạc xanh xuất hiện và có rất
nhiều khuẩn lạc màu trắng trên môi trƣờng. Điều này có thể giải thích là do trong quá
trình làm thí nghiệm đã có một số tế bào tự bản thân nó có khả năng kháng lại với
kháng sinh hay là do thao tác trang X-gal không đều ở xung quanh đĩa nên các tế bào
đã tiếp nhận plasmid nhƣng không có X-gal để phân hủy vì vậy chỉ cho khuẩn lạc
trắng hay tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng quá trình phục hồi và biểu hiện của gen
LacZ diễn ra chậm (đối với khuẩn lạc này khi quan sát kỹ sẽ thấy màu xanh nhạt).
Kết quả biến nạp theo quy trình 2 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và khuẩn lạc
trắng ít hơn rất nhiều so với biến nạp theo quy trình 1. Nhƣ vậy cho thấy quy trình 2
hiệu quả biến nạp tốt hơn và thể tích biến nạp nhƣ vậy là hợp lí. Khuẩn lạc mọc rời
rạc, dễ cho thao tác chọn khuẩn lạc để cấy chuyền sang môi trƣờng lỏng nhân sinh
khối để li trích đƣợc plasmid.
Kết quả biến nạp theo quy trình 3 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và cũng cho
nhiều khuẩn lạc trắng hơn so với biến nạp theo quy trình 2. Khuẩn lạc xanh tuy nhiều
nhƣng mọc dày rất khó cho việc chọn khuẩn lạc tăng sinh trong môi trƣờng lỏng.
Nhƣ vậy, qua kết quả chọn lọc thể biến nạp trên môi trƣờng LB agar/Amp/Xgal/IPTG chúng tui thấy biến nạp theo quy trình 2 là thích hợp.
4.2 Tách chiết DNA plasmid.
4.2.1 Tách chiết DNA plasmid
Bắt những khuẩn lạc xanh trên môi trƣờng đĩa và tiến hành cấy sang ống
nghiệm chứa 3ml môi trƣờng LB lỏng với nồng độ kháng sinh là 60µg/ml nuôi cấy lắc
ở 370C qua đêm, chọn ống có sinh khối và tiến hành tách chiết plasmid thu đƣợc kết
quả nhƣ sau:
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
TÓM TẮT
BÙI THỊ THANH TỊNH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, “Hoàn thiện
quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α”, đƣợc thƣc hiện
tại Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh và Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật-Trƣờng
Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Giáo viên hƣớng dẫn: thầy Lê Đình Đôn.
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 02 năm 2006 đến tháng 08 năm 2006 với các nội
dung:
Hoàn thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp theo phƣơng pháp sử dụng
hoá chất.
Hoàn thiện quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α..
Hoàn thiện quy trình chiết tách plasmid, phản ứng cắt plasmid để kiểm tra.
Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ phản ứng PCR và plasmid sau khi
cắt.
Thiết lập phản ứng chèn đoạn DNA vào plasmid pBluescript.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Thiết lập đƣợc quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hoá chất, tế bào khả
nạp có thể giữ ở -70oC với glycerol trong thời gian 2 tháng.
Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli DH5α.
Chiết tách plasmid không lẫn tạp theo quy trình của Sambrook và cộng sự có
sửa đổi.iii
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn...................................................................................................................i
Tóm tắt........................................................................................................................ii
Mục lục ......................................................................................................................iii
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................vii
Danh sách các hình ...................................................................................................vii
Danh sách các bảng ...................................................................................................ix
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề.............................................................................................................1
1.2 Mục tiêu của đề tài................................................................................................2
1.3 Nội dung thực hiện ...............................................................................................2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................3
2.1 Hiện tƣơng biến nạp ở vi khuẩn ...........................................................................3
2.1.1 Giới thiệu về hiện tƣợng biến nạp................................................................3
2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tƣợng biến nạp................................3
2.1.3 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp...................................................................5
2.1.4 Vai trò của hiện tƣợng biến nạp...................................................................5
2.1.5 Ứng dụng của hiện tƣợng biến nạp..............................................................5
2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp .....................................................6
2.2.1 Khái niệm chung các vector.........................................................................6
2.2.2 Plasmid.........................................................................................................7
2.2.2.1 Cấu trúc ...............................................................................................7
2.2.2.2 Tính chất của plasmid..........................................................................8
2.2.2.3 Phân loại plasmid ................................................................................8
2.2.3 Phage............................................................................................................9
2.2.4 Chủng chủ E.coli..........................................................................................9
2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp .........................................................................10
2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) .....................................................................11
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiiv
2.3.1.1 Hiện tƣợng giới hạn...........................................................................11
2.3.1.2 Tên gọi các RE ..................................................................................11
2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn ....................................................................12
2.3.1.4 Các RE loại II ....................................................................................12
2.3.2 Các enzym thông dụng khác ......................................................................15
2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I)........................................................15
2.3.2.2 Taq polymerase .................................................................................15
2.3.2.3 Terminal transferase ..........................................................................15
2.3.2.4 Các DNase .........................................................................................15
2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa .........................................................16
2.3.3 Các enzym nối DNA..................................................................................16
2.3.3.1 E.coli DNA ligase..............................................................................16
2.3.3.2 T4 DNA ligase...................................................................................16
2.4 Các phƣơng pháp sử dụng trong biến nạp ..........................................................17
2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp.............................................................................17
2.4.1.1 Phƣơng pháp hóa biến nạp ................................................................17
2.4.1.2 Phƣơng pháp điện biến nạp ...............................................................18
2.4.2 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp...................18
2.4.3 Chiết tách DNA plasmid............................................................................19
2. 5 Điện di (Electrophoresis)...................................................................................19
2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nƣớc và ngoài nƣớc ..................................20
2.6.1 Ngoài nƣớc.................................................................................................20
2.6.2 Trong nƣớc.................................................................................................21
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................22
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp .......................................22
3.2 Vật liệu nghiên cứu.............................................................................................22
3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α...............................................................................22
3.2.2 pBluescript II SK(+/-) ................................................................................22
3.2.3 Đoạn DNA .................................................................................................23
3.3 công cụ và hóa chất ...........................................................................................23
3.3.1 công cụ thí nghiệm....................................................................................23v
3.3.2 Các thiết bị máy móc .................................................................................23
3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn......................................................23
3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm ...................................................24
3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm......................................................24
3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................25
3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn .......................................25
3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn
E.coli DH5α và kiểm tra ..........................................................................26
3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E.coli DH5α trên môi trƣờng LB ...............................27
3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp.............................................................................27
3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn
E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
(theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi).................................27
3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra...............................29
3.4.6.1 Chiết tách plasmid .............................................................................29
3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid
(quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) ......................................32
3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose .....................................................32
3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR..................................33
3.4.7.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA.............................................................33
3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel ........................................................33
3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX...................34
3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR ...............................35
3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn
DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) ................................................36
3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α
khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) ............37
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................38
4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn..........................................38
4.2 Tách chiết DNA plasmid ....................................................................................40
4.2.1 Tách chiết DNA plasmid ...........................................................................40
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phivi
4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTM Plasmid Mini Kit .....................42
4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV...................................42
4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII................................44
4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA..................................................................................44
4.4.2 Tinh sạch plasmid ......................................................................................45
4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp................................................................................46
4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp .............................................................................46
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................48
5.1 Kết luận...............................................................................................................48
5.2 Kiến nghị ............................................................................................................49vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp base pair
CFU Colony Form Unit
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP 3’- Deoxyribonucleoside- 5’- triphosphate
ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside
MCS Multiple cloning Site
OD Optical Density
PCR Polymerase Chain Reaction
RE Restriction Enzyme
RNA Ribonucleic acid
RFLP Restriction fragment length polymorphism
SDS Sodium dodecyl sulfate
TAE Tris Acetate EDTA
Taq Thermus aquaticus
Kb kilobase
dATP deoxyadenosine triphosphate
dGTP deoxyguanosine triphosphate
dCTP deoxycytidine triphosphate
dTTP deoxythymidine triphosphate
Tris- HCL (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride
UV Ultraviolet (light)
X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dglactopyranoside
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiviii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp ..................................................................6
Hình 2.2 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning ........................................................8
Hình 2.3 Hình thái của Escherichia coli .................................................................10
Hình 2.4 Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn.................................................................13
Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA .................................35
Hình 4.1 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 10:1.5............................38
Hình 4.2 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 3:0.5..............................39
Hình 4.3 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 1)............................41
Hình 4.4 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 2).........................41
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm tách
chiết DNA plasmid bằng Kit trên gel agarose 1% ...................................................42
Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt
plasmid bằng EcoRV trên gel 1% (lần 1) .................................................................42
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% (lần 2) ........................43
Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1%.................43
Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1% ....................43
Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn
DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX.............................................45
Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA
bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX.......................................................45
Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch trên gel agarose1%................................46
Hình 1 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) ....................................................................55
Hình 2 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-) .........................................................56ix
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BẢNG
Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MCS của plasmid pBluescript II SK (+/-).........................23
Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. Coli ........................25
Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA
vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra......................................................................26
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay với sự phát triển nhƣ vũ bão của khoa học công nghệ, đặc biệt trong
đó công nghệ sinh học là lĩnh vực đã đạt đƣợc những thành quả quan trọng và hứa hẹn
đem lại những lợi ích vô cùng to lớn trong tƣơng lai cho con ngƣời. Các nghiên cứu
hiện nay đang tập trung vào việc chuyển gen để tăng năng suất cây trồng, tạo ra những
giống mới có chức năng vƣợt trội.
Tuy nhiên, việc nghiên cứu và phân tích ở mức phân tử DNA thƣờng gặp khó
khăn lớn về số lƣợng và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm. Để giải quyết
vấn đề này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt động của gen, sự
biểu hiện ra protein và cấu trúc của protein, ngƣời ta chú trọng tới việc phân lập và thu
nhận đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lƣợng lớn để tiến hành
nghiên cứu. Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen
chúng ta quan tâm thƣờng chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào. Vì vậy chúng
ta không thể sử dụng các phƣơng pháp sinh hoá thông thƣờng để phân lập gen mục
tiêu trên bộ gen.
Những vấn đề trên có thể đƣợc giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có
khả năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phƣơng tiện mang gen, biến nạp gen,
tăng bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen. Các cấu trúc DNA
dùng cho mục tiêu này gọi là vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào
thích hợp sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ
gen của tế bào. Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ. Tế
bào chủ thƣờng đƣợc chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và
các đặc tính thuận lợi cho các thao tác trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi
là dòng tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp hay dùng
cho các thao tác trên gen. Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA
cloning. Mục đích của tạo dòng nhằm thu đƣợc số lƣợng lớn và tinh khiết các trình tự
DNA hay thu nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu.
Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến
thức về kĩ thuật di truyền đƣợc tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tui tiến hành2
thực hiện đề tài “ Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.
coli DH5α” phát triển từ đề tài: “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế
bào vi khuẩn E. coli DH5α” do Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trƣờng đại học Nông
Lâm TPHCM thực hiện.
1.2 Mục tiêu của đề tài
Hoàn thiện quy trình chèn một đoạn DNA bất kỳ vào plasmid pBluescript và
chuyển plasmid tái tổ hợp này vào tế bào kí chủ E. coli DH5α.
1.3 Nội dung thực hiện
- Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli DH5α.
- Thiết lập qui trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất.
- Thiết lập phƣơng pháp biến nạp plasmid DNA chƣa tái tổ hợp vào tế bào vi
khuẩn E. coli DH5α bằng hóa chất và sốc nhiệt.
- Phƣơng pháp tách chiết plasmid chƣa tái tổ hợp bằng SDS-kiềm thể biến nạp,
kết hợp với phản ứng cắt enzyme giới hạn để kiểm tra.
- Chuẩn bị đoạn DNA để chèn.
- Cắt và tinh sạch vector.
- Phản ứng sữa chữa sai sót trên đoạn DNA từ sản phẩm PCR chèn, nhằm tạo ra
đoạn DNA có đầu bằng.
- Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid sau khi cắt bằng enzyme giới hạn
- Phản ứng nối giữa vector và DNA chèn.
- Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào.
- Kiểm tra thể biến nạp trên môi trƣờng có chứa Ampicillin, X-gal, IPTG.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn
2.1.1 Giới thiệu về hiện tƣợng biến nạp
Biến nạp là phƣơng pháp đơn giản nhất hiện có để đƣa DNA tái tổ hợp vào
trong tế bào. Trong trƣờng hợp các tế bào E. coli thì biến nạp có nghĩa là đƣa DNA
plasmid vào trong tế bào. Biến nạp còn đƣợc sử dụng với nghĩa rộng hơn, cụ thể là đƣa
bất kỳ DNA nào vào bất kỳ tế bào nào.
Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn đƣợc Frederick Griffith mô tả vào năm 1928
trong thí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là “nguyên lí biến nạp”. Trên thực tế phát
minh này về sau đã chứng minh rằng các gen đƣợc cấu thành từ DNA. Tuy nhiên
không phải tất cả vi khuẩn đều biến nạp một cách dễ dàng. Để cho biến nạp ở E. coli
có hiệu quả, các tế bào cần trở nên khả biến (competent). Để đạt đƣợc điều này, ngƣời
ta ngâm các tế bào trong dung dịch calcium chloride lạnh đông đá, khi đó các tế bào
trở nên khả biến theo một cách mà cho đến nay chƣa rõ nguyên nhân. Việc biến nạp
các tế bào khả biến đƣợc thực hiện bằng cách trộn DNA plasmid với các tế bào, rồi ủ
trong đá 20 đến 30 phút, sau đó tạo một sốc nhiệt ngắn (2 phút ở 420C), làm nhƣ vậy
DNA sẽ chui vào tế bào. Các tế bào biến nạp thƣờng đƣợc ủ trong nƣớc thịt dinh
dƣỡng ở 370C trong vòng 60 đến 90 phút để làm cho các plasmid ổn định và biểu hiện
các tính trạng của chúng ra kiểu hình. Sau đó, các tế bào đƣợc đƣa lên môi trƣờng
chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmid (Lê Đình Lƣơng, 2001).
2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tƣợng biến nạp
Hiện tƣợng biến nạp đòi hỏi sự thể hiện của gen mã hóa cho những thành phần
mà DNA gắn vào, sau đó sẽ đƣợc hấp thụ.
Trong tự nhiên, khi nồng độ các chất dinh dƣỡng hay nồng độ oxy giảm đến
mức tối thiểu ảnh hƣởng đến sự sống của vi khuẩn, lúc này tế bào sẽ bị thay đổi về cấu
trúc cũng nhƣ đặc tính sinh lý sinh hóa, màng tế bào bị biến tính dẫn đến sự hình thành
các kênh vận chuyển dạng lỏng, DNA sẽ theo các kênh này đi vào nhờ việc tiếp xúc
với màng và nhận đƣợc sự hỗ trợ của hệ thống vận chuyển bên trong tế bào.
Hệ thống vận chuyển này đƣợc hình thành trên cơ sở enzym gây biến tính một
số protein màng. Enzym ComC có bản chất là một peptidase phân cắt protein ComG4
của màng tế bào làm cho nó không còn tính trọn vẹn của một protein màng, từ đó
chúng đƣợc hoạt hoá. Có 7 protein cùng dạng với ComG, tất cả chúng đều có thể tạo
ra cấu trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA. ComEA là thể nhận để DNA đi vào tế
bào. ComEC có thể tạo ra kênh vận chuyển dạng dịch và qua đó DNA đi vào tế bào
(Leendert W.Hamoen và cộng sự, 1998).
ComFA là một dạng helycase có chức năng phối hợp với ComEA và ComEC
để đƣa sợi DNA mạch đơn vào tế bào. Trong quá trình chuyển nạp sợi DNA mạch đôi
bám vào đầu Carboxyl của ComEA và đƣợc phân ra thành những đoạn dƣới tác động
của endonuclease (hiện nay đã xác định đó là NucA), phần đầu cuối mới đƣợc cắt ra
này đƣợc đƣa tới ComEC và ComEA để chúng vận chuyển vào tế bào.
Sự phiên mã của gen “late competence” mã hoá cho bộ máy gắn kết và hấp thụ
DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) cũng nhƣ các yếu tố cần cho sự tái tổ hợp (recA,
addAB) đòi hỏi một yếu tố có khả năng kích hoạt sự phiên mã.
ComK là yếu tố hoạt hoá sự phiên mã. ComK đƣợc điều chỉnh chính xác sự
biểu hiện của nó. Sự biểu hiện của ComK đƣợc quy định bởi một mạng lƣới phức tạp
bao gồm AbrB, ComA, sinR và MecAB. Trong các thí nghiệm thực hiện năm 1998,
Leendert W.Hamoen và cộng sự đã chỉ ra rằng ComK nhận biết một vùng trình tự
ngắn giàu A/T, đƣợc sắp xếp trong một khung đọc đặc trƣng và linh động dọc theo sợi
xoắn DNA. Phân tích footfrinting các gốc hydroxyl của ComK bám vào addAB
promoter cho phép họ kết luận rằng ComK bám vào vùng trình tự giàu A/T
AAAAN5TTTT.
ComK đƣợc điều hoà âm bởi sự bám vào của AbrB và CodY, đƣợc hoạt hoá
dƣơng bởi AbrB, sinR, DegU. CodY là một GTP-binding protein nhạy cảm với nồng
độ GTP nội bào nhƣ là một chỉ thị về dinh dƣỡng, nó điều hoà sự phiên mã ở phần đầu
phare ổn định và sự phiên mã của gen quy định sự hình thành bào tử. Từ đó, cho phép
tế bào thích nghi với những giới hạn về dinh dƣỡng. DegU giúp cho ComK bám chặt
hơn vào ComK promoter, điều này đảm bảo sự phiên mã chính xác ngay cả khi nồng
độ ComK thấp.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi5
2.1.3 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp
Tế bào vi khuẩn có thể cho DNA xâm nhập vào tế bào đƣợc là do trong một
giai đoạn tăng trƣởng nào đó của tế bào, trên bề mặt của tế bào có hiện diện những
điểm tiếp nhận đặc biệt gọi là nhân tố dung nạp (competent factor). Nhân tố này có
khả năng tiếp nhận đoạn ngắn DNA từ môi trƣờng bên ngoài để đƣa vào bên trong tế
bào vi khuẩn, nhờ đó xảy ra tái tổ hợp.
Muốn thực hiện sự biến nạp cần có 2 điều kiện: (1) Phải có trong môi
trƣờng các đoạn DNA, (2) Khả năng dung nạp DNA của vi khuẩn nhận.
Không phải tất cả các vi khuẩn đều nhận DNA vào nhƣ nhau, mà cần sử
dụng một số chất để tạo lỗ trên vách tế bào, giúp sự xâm nhập dễ dàng của DNA nhƣ:
CaCl2 50mmol, LiCl.
Quá trình biến nạp gồm 5 giai đoạn:
- Sự tiếp xúc của DNA lạ với tế bào nhận
- Sự xâm nhập của DNA vào tế bào nhận
- Sự liên kết của DNA lạ với đoạn tƣơng đồng của nhiễm sắc thể tế bào nhận
- Sự đồng hóa phân tử DNA lạ vào DNA của tế bào nhận nhờ tái tổ hợp
- Sự nhân lên của nhiễm sắc thể có DNA biến nạp
2.1.4 Vai trò của hiện tƣợng biến nạp
Hiện tƣợng biến nạp giúp các loài vi khuẩn có thêm các tính trạng mới dễ thích
nghi với môi trƣờng sống.
Đó là cơ sở của tiến hóa và đa dạng vi sinh vật.
2.1.5 Ứng dụng của hiện tƣợng biến nạp
Biến nạp DNA vào vi khuẩn là bƣớc đầu trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp.
Kỹ thuật tái tổ hợp cho phép chuyển một gen từ động vật, cây trồng vào vi khuẩn
và ở đó một lƣợng lớn sản phẩm mong muốn của gen sẽ đƣợc tạo ra, sau đó kết hợp với
các phƣơng pháp chiết xuất và tinh sạch để phục vụ cho mục đích của con ngƣời.
Biến nạp gen vào vi khuẩn còn giúp thực hiện những nghiên cứu khác nhƣ
đọc trình tự gen, kiểm tra đa dạng sinh học, hay bảo quản sự ổn định của đoạn gen
đƣợc dễ dàng.6
2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp
2.2.1 Khái niệm chung các vector
Vector có bản chất là DNA, thƣờng dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó
có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và mƣợn bộ máy tế bào của vi khuẩn để tạo
ra nhiều bản sao khác giống hệt vector ban đầu. Một vector cần có các đặc điểm tiêu
chuẩn nhƣ sau:
- Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc sự sao
chép bộ gen tế bào chủ.
- Có những đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứa
chúng. Các đặc tính này thƣờng đƣợc mã hoá bởi các gen chọn lọc. Thông thƣờng là
các gen kháng kháng sinh (ampicillin, tetracyline). Ngoài ra, gen chọn lọc cũng có thể
là gen mã hóa cho enzyme (ví dụ β-galactosidase, luciferase) chuyển hóa cơ chất cho
phép quan sát một cách dễ dàng (tạo màu hay phát sáng theo thứ tự)
Chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 2 (ở thể tích biến nạp là 3:0.5, và dịch biến
nạp đã pha loãng ½ khi trang lên đĩa) cho kết quả tốt hơn chọn lọc thể biến nạp theo
quy trình 1 (ở thể tích biến nạp 3:0.5, và dịch biến nạp không pha loãng khi trang lên
đĩa) và chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 3 (ở thể tích biến nạp là 10:1.5).
Biến nạp theo quy trình 1 cho kết quả chỉ vài khuẩn lạc xanh xuất hiện và có rất
nhiều khuẩn lạc màu trắng trên môi trƣờng. Điều này có thể giải thích là do trong quá
trình làm thí nghiệm đã có một số tế bào tự bản thân nó có khả năng kháng lại với
kháng sinh hay là do thao tác trang X-gal không đều ở xung quanh đĩa nên các tế bào
đã tiếp nhận plasmid nhƣng không có X-gal để phân hủy vì vậy chỉ cho khuẩn lạc
trắng hay tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng quá trình phục hồi và biểu hiện của gen
LacZ diễn ra chậm (đối với khuẩn lạc này khi quan sát kỹ sẽ thấy màu xanh nhạt).
Kết quả biến nạp theo quy trình 2 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và khuẩn lạc
trắng ít hơn rất nhiều so với biến nạp theo quy trình 1. Nhƣ vậy cho thấy quy trình 2
hiệu quả biến nạp tốt hơn và thể tích biến nạp nhƣ vậy là hợp lí. Khuẩn lạc mọc rời
rạc, dễ cho thao tác chọn khuẩn lạc để cấy chuyền sang môi trƣờng lỏng nhân sinh
khối để li trích đƣợc plasmid.
Kết quả biến nạp theo quy trình 3 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và cũng cho
nhiều khuẩn lạc trắng hơn so với biến nạp theo quy trình 2. Khuẩn lạc xanh tuy nhiều
nhƣng mọc dày rất khó cho việc chọn khuẩn lạc tăng sinh trong môi trƣờng lỏng.
Nhƣ vậy, qua kết quả chọn lọc thể biến nạp trên môi trƣờng LB agar/Amp/Xgal/IPTG chúng tui thấy biến nạp theo quy trình 2 là thích hợp.
4.2 Tách chiết DNA plasmid.
4.2.1 Tách chiết DNA plasmid
Bắt những khuẩn lạc xanh trên môi trƣờng đĩa và tiến hành cấy sang ống
nghiệm chứa 3ml môi trƣờng LB lỏng với nồng độ kháng sinh là 60µg/ml nuôi cấy lắc
ở 370C qua đêm, chọn ống có sinh khối và tiến hành tách chiết plasmid thu đƣợc kết
quả nhƣ sau:
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Tags: Cắt và tinh sạch plasmid
Last edited by a moderator: