nam_lun_di_dong_a1
New Member
Download miễn phí Luận văn Bước đầu xây dựng quy trình phát hiện aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin trên ngũ cốc bằng phương pháp phát quang
MỤC LỤC
Lời cảm ơn--------------------------------------------------------------------------------------i
Mục lục------------------------------------------------------------------------------------------ii
Danh mục chữviết tắt ------------------------------------------------------------------------ iv
Danh mục Bảng --------------------------------------------------------------------------------v
Danh mục Hình ----------------------------------------------------------------------------- viii
MỞ ĐẦU.1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.5
1.1. Vài nét về đối tượng nghiên cứu .5
1.1.1. Hình thái:.5
1.1.2. Sinh thái .5
1.1.3. Độc tốaflatoxin do Aspergillus flavussản sinh.8
1.1.4. Biện pháp phòng ngừa đảm bảo vệsinh an toàn thực phẩm: .13
1.2. Tổng quan vềAflatoxin .16
1.2.1. Lịch sửphát hiện aflatoxin [8]:.16
1.2.2. Công thức cấu tạo và một sốtính chất lý hoá của Aflatoxin [8] .16
1.2.3. Sựhiện diện và phát triển của Aflatoxin B1 trong tựnhiên: .17
1.2.4. Tác hại của Aflatoxin:.19
1.2.5. Mức cho phép tối đa của các loại độc tốtrong thức ăn chăn nuôi [2]:.24
1.3. Phương pháp phát hiện A. flavus.27
1.3.1. Dựa vào đặc điểm hình thái [17], [18]: .27
1.3.2. Dựa trên phương pháp sinh học phân tử[18]: .28
1.4. Đặc tính và ứng dụng Cylodextrin [19] .30
1.4.1. Đặc tính .30
1.4.2. Cấu trúc và tính chất của các cyclodextrin .32
1.4.3. Đặc điểm của phức bao cyclodextrin .33
1.4.4. Ứng dụng của phức bao: .35
1.4.5. Tương tác của cyclodextrin với aflatoxin [12, 15].35
1.5. Một sốkhái niệm trong quy trình xác nhận hiệu lực của phương pháp [14] .37
1.5.1. Giới hạn phát hiện .37
1.5.2. Độnhạy, độ đặc hiệu và tỷlệdương tính giả, tỷlệâm tính giả.37
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .38
2.1. Vật liệu: .38
2.1.1. Chủng chuẩn Aspergillusvà mẫu thực phẩm.38
2.1.2. Thiết bịvà dụng cụchính.39
2.1.3. Môi trường và hóa chất .40
2.2. Phương pháp nghiên cứu.40
2.2.1. Phương pháp chuẩn bịphòng ẩm nuôi cấy mốc [13].40
2.2.2. Phương pháp định danh nấm mốc theo FAO – 1992 [10] .41
2.2.3. Phương pháp gây nhiễm chủng nấm mốc vào mẫu thực phẩm [14].41
2.2.4. Phương pháp tách chiết mẫu (đĩa thạch) đểphân tích HPLC [11] .44
2.2.5. Phương pháp khảo sát sựphát huỳnh quang của các chủng Aspergillus
flavussinh aflatoxin .44
2.2.6. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sựbiểu hiện đặc tính
sinh aflatoxin dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang. .45
2.2.7. Phương pháp xác định giới hạn phát hiện [14] .47
2.2.8. Xác định các thuộc tính của phương pháp [14] .48
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢVÀ BÀN LUẬN .51
3.1. Kết quảkhảo sát đặc tính sinh Aflatoxin (dựa vào đặc điểm phát huỳnh
quang trên môi trường thạch) của một sốchủng Aspergillus flavus. .51
3.2. Kết quảkhảo sát các điều kiện tác động đến sựphát triển và khảnăng phát
huỳnh quang của các chủng A. flavus.56
3.2.1. Kết quảkhảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sựphát triển và khả
năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: .57
3.2.2. Kết quảkhảo sát ảnh hưởng của môi trường đến sựphát triển và khả
năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: .61
3.2.3. Kết quảkhảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sựphát triển và khả
năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: .66
3.2.4. Kết quảkhảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến sựphát triển và
khảnăng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus:.70
3.2.5. Kết quảkhảo sát ảnh hưởng của nồng độcyclodextrin đến sựphát
triển và khảnăng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: .74
3.2.6. Kết quảkhảo sát ảnh hưởng của ảnh hưởng của kháng sinh
(Chloramphenicol) đến sựphát triển và khảnăng phát huỳnh quang
của các chủng A. flavus: .78
3.3. Xây dựng dựthảo phương pháp phát hiện A. flavussinh độc tốAflatoxin B1
trong ngũcốc và thức ăn chăn nuôi dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang
của Aflatoxin khi kết hợp với cyclodextrin. .80
3.4. Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp mới xây dựng. .80
3.5. Xác định các thông sốphương pháp mới:.85
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN & ĐỀNGHỊ.90
4.1. Kết luận .90
4.2. Đềnghị: .90
TÀI LIỆU THAM KHẢO.91
PHỤLỤC 1: MÔI TRƯỜNG .94
PHỤLỤC 2: KẾT QUẢKIỂM TRA AFLATOXIN BẰNG HPLC .97
PHỤLỤC 3: QUY TRÌNH ĐỀXUẤT .98
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 1 MỞ ĐẦUHVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ
MỞ ĐẦU
Hiện nay, chất lượng thực phẩm được quan tâm nhiều bởi có thể ảnh hưởng
đến sức khỏe con người. Có rất nhiều mối quan tâm, bên cạnh vấn đề giá trị dinh
dưỡng, vấn đề an toàn thực phẩm được đặc biệt chú trọng, trong đó nhiễm các chất
gây hại cho người như các độc tố nấm mốc, vi khuẩn, kim lọai nặng, dư lượng
thuốc trừ sâu, dư lượng phân bón,…
Trong điều kiện khí hậu nước ta, khí hậu gió mùa, chế độ mưa ẩm cao, điều
kiện bảo quản trong các kho nhỏ lẻ chưa được quan tâm gây ảnh hưởng đến chất
lượng lương thực thực phẩm cung cấp cho người dân. Trong điều kiện như vậy,
nấm mốc có thể phát triển sinh độc tố được gọi là độc tố nấm (mycotoxin), gây ảnh
hưởng đáng kể đến sức khỏe người tiêu dùng, đặc biệt là gây ung thư. Trong đó, có
thể kể đến Aflatoxin B1 (AFB1).
Độc chất Aflatoxin được tạo ra từ các lọai nấm mốc thuộc giống Aspergillus,
mọc trên các loài ngũ cốc, trong đó Aflatoxin B1 (AFB1) chủ yếu do loài
Aspergillus flavus sinh ra có độc tính rất cao (Nabil Saad, 2004; Victoria, 2001;
Roberts, 2002) [8]. Các loài động vật, kể cả con người, nếu ăn phải thức ăn có chứa
AFB1, hay sử dụng nguyên liệu, thức ăn có nguồn gốc từ ngũ cốc bị nhiễm nấm
mốc Aspergillus flavus có thể nguy hại đến tính mạng. Trong khi hầu hết các chủng
Aspergillus parasiticus đều sinh độc tố thì ở Aspergillus flavus sự sản sinh độc tố
Aflatoxin thay đổi theo từng chủng. Mặt khác, nó còn phụ thuộc vào điều kiện xung
quanh, sự sản sinh Aflatoxin là kết quả của sự tác động qua lại giữa kiểu gen của
chủng đó và điều kiện phát triển của nó [3].
Phương pháp phân tích định danh loài nấm mốc Aspergillus flavus hiện nay
chủ yếu dựa vào các đặc tính hình thái như: Tiêu chuẩn ngành y tế 52 TCN – TQTP
0001:2003: “Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc Aspergillus flavus,
Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus trong thực phẩm” [1] dựa trên các đặc
điểm hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào để định danh. Tuy nhiên, đối với
phương pháp định danh dựa vào hình thái và màu sắc thì rất khó phân biệt với loài
GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 2 MỞ ĐẦU
HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ
Aspergillus oryzae mà chỉ có các chuyên gia có kinh nghiệm mới phân biệt được hai
loài này. Do đó, để kiểm soát được chất lượng nông sản, các nhà quản lý cần kiểm
soát cả hai yếu tố : sinh học - có nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus hay không và
yếu tố hóa học - có nhiễm độc tố Aflatoxin vượt ngưỡng cho phép hay không từ đó
có thể đề xuất những biện pháp kỹ thuật phù hợp nhằm tránh được những nguy
hại của các loại ngũ cốc có chứa Aflatoxin.
Bên cạnh đó, trên thế giới để kiểm soát chất lượng thực phẩm đã sử dụng
quy trình định lượng nấm mốc A. flavus theo hướng dẫn của FAO 1414-1992 chủ
yếu cũng dựa trên đặc điểm hình thái để phân lập định danh [10].
Gần đây, nhóm tác giả Fente C.A., Jaimez Ordaz J., B. I., Vázquez C. M.
(2001) [11] đã nghiên cứu đưa ra phương pháp mới dùng để sàng lọc các chủng
nấm mốc sinh độc tố Aflatoxin bằng cách thêm cyclodextrin vào môi trường nuôi
cấy nấm mốc để kích thích sự phát huỳnh quang của Aflatoxin. Sự phát huỳnh
quang được quan sát trực tiếp trên môi trường nuôi cấy dưới đèn UV ở bước sóng
365 nm. Khả năng phát huỳnh quang của Aflatoxin có được là do sự hình thành cấu
trúc dị vòng 5 bị oxi hóa. Cyclodextrin là những phân tử được hình thành do phản
ứng của enzyme cyd – transglycolase lên dextrans. Các phân tử cyclodextrin có các
kích thước khác nhau [cyclodextrin chứa 6- 8 đơn phân glucose liên kết với nhau
bằng liên kết (1-4) do đó chúng được gọi là -, -, or -cyd]. Các phân tử này được
dùng để làm tăng khả năng phát huỳnh quang của Aflatoxin.
Với cơ sở lý thuyết nêu trên và với mục tiêu xây dựng phương pháp phát hiện
nấm mốc A. flavus sinh độc tố Aflatoxin, được sự đồng ý của Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên và cán bộ hướng dẫn khoa học, chúng tui tiến hành đề tài nghiên cứu:
“Bước đầu xây dựng phương pháp phát hiện Aspergillus flavus sinh độc tố
Aflatoxin trong ngũ cốc bằng phương pháp phát quang”
GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 3 MỞ ĐẦU
HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ
* Mục tiêu của đề tài:
Xây dựng quy trình phát hiện nấm mốc Aspergillus flavus có khả năng
sinh độc tố Aflatoxin nhằm kiểm soát chất lượng ngũ cốc cũng như cung cấp
những dẫn liệu khoa học về những sự tồn tại khả năng có hay không có sinh độc
tố Aflatoxin để có biện pháp xử lý hiệu quả.
* Luận điểm mới của đề tài:
Ở nước ta hiện nay, trong các quy trình phát hiện nấm mốc A. flavus dựa trên
đặc điểm hình thái là chủ yếu và do đó chỉ phân biệt được loài mà không phân biệt
được khả năng sinh độc tố Aflatoxin của loài đó. Vì vậy, điểm mới của đề tài là xây
dựng được phương pháp phát hiện nấm mốc A. flavus trong đó có thể phân biệt
được những loài có khả năng sinh độc tố với những loài không có khả năng sinh
độc tố.
Với đối tượng đã chọn, chúng tui đã khảo sát các yếu tố tác động đến việc
sinh Aflatoxin để đưa ra các điều kiện tối ưu nhằm xây dựng một phương pháp mới
phát hiện nấm mốc Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin được ghi nhận bằng
việc phát huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc khi quan sát dười đèn UV ở bước
sóng 365nm.
Ngoài ra, chúng tui còn tiến hành đánh giá, xác nhận hiệu lực sơ cấp của
phương pháp mới theo tiêu chuẩn ISO 16140:2003 [14] trên 2 dạng nền mẫu thức
ăn chăn nuôi có cấu trúc khác nhau: dạng hạt và dạng bột làm cơ sở để mở rộng
phạm vi áp dụng trên các nền mẫu khác như ngũ cốc dạng hạt và dạng bột…
* Ý nghĩa đề tài
¾ Ý nghĩa khoa học:
- Làm cơ sở để xây dựng phương pháp định danh, định lượng và phân tích nấm
mốc trong lương thực thực phẩm, trong thức ăn chăn nuôi.
- Làm cơ sở cho việc nghiên cứu sự đa dạng của A. flavus và các loại nấm mốc
khác sinh Aflatoxin.
GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 4 MỞ ĐẦU
HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ
¾ Ý nghĩa thực tiễn:
- Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện và hiệu quả hơn so với các phương
pháp nuôi cấy hiện nay.
- Việc phát hiện A. flavus sinh độc tố Aflatoxin là công cụ quan trọng trong việc
kiểm tra, quản lý chất lượng nông sản, lương thực thực phẩm và thức ăn trong
chăn nuôi.
* Nội dung nghiên cứu
¾ Sàng lọc các chủng A. flavus sinh Aflatoxin dựa trên đặc điểm phát
huỳnh quang
¾ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát huỳnh quang của các
chủng A. flavus sinh Aflatoxin
¾ Xây dựng dự thảo phương pháp “ Phát hiện Aspergillus flavus sinh
độc tố Aflatoxin trên ngũ cốc bằng phương pháp phát quang”.
¾ Xác nhận hiệu lực sơ cấp của phương pháp
* Nơi thực hiện
- Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 4
- Trung tâm Quốc gia Quan trắc, thông báo Môi trường và Phòng ngừa dịch
bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II.
* Thời gian thực hiện:
Từ tháng 07/2008 đến tháng 7/2009
...