Link tải luận văn miễn phí cho ae
MỤC LỤC . i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮVIẾT TẮT . iii
DANH MỤC CÁC BẢNG . iv
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ. v
MỞ ðẦU . 1
Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 2
I.1. INTERFERON . 2
I.1.1. Các dạng Interferon . 2
I.1.2. Cơchếhoạt ñộng của Interferon . 4
I.1.3. Các ứng dụng của Interferon . 6
I.1.4. Tình hình nghiên cứu Interferon hiện nay . 8
I.2. HỆTHỐNG BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS. 8
I.2.1. Các hệthống biểu hiện Interferon alpha 2b . 8
I.2.2. Ưu nhược ñiểm của hệthống biểu hiện Pichia pastoris. 10
Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . 12
II.1. VẬT LIỆU . 12
II.1.1. Dụng cụvà thiết bị. 12
II.1.2. Hóa chất và môi trường . 13
II.1.3. Nguyên vật liệu . 15
II.2. PHƯƠNG PHÁP. 20
II.2.1. Tách chiết DNA người tổng sốbằng Chelex . 20
II.2.2. Phương pháp PCR (dùng ñểkhuếch ñại ñoạn gene mục tiêu và kiểm tra
khuẩn lạc mang gene mục tiêu) . 20
II.2.3. Phương pháp tinh sạch DNA từgel agarose . 21
II.2.4. Phương pháp ñiện biến nạp cho E. coli. 21
II.2.5. Phương pháp cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn . 22
II.2.6. Phương pháp nối DNA bằng enzyme T4 ligase. 22
II.2.7. Phương pháp tách chiết plasmid từtếbàoE. coli. 23
II.2.8. Phương pháp ñiện biến nạp cho Pichia pastoris. 23
II.2.9. Phương pháp lai khuẩn lạc . 24
II.2.10. Phương pháp lên men Pichia pastoris.24
II.2.11. Phương pháp Bradford dùng ñể ño hàm lượng protein . 25
II.2.12. Phương pháp ñiện di SDS-PAGE . 25
II.2.13. Phương pháp Western blot . 27
Trang ii
Chương III KẾT QUẢVÀ BIỆN LUẬN . 28
III.1. TẠO DÒNG ESCHERICHIA COLI MANG GENE MÃ HÓA CHO
INTERFERON ALPHA 2B CỦA NGƯỜI . 28
III.1.1. Tổng hợp gene mã hóa cho Interferon alpha 2b của người . 28
III.1.2. Tạo dòng Escherichia coliDH5αmang vector nhân dòng gene mã hóa
Interferon alpha 2b của người . 30
III.2. TẠO DÒNG PICHIA PASTORISBIỂU HIỆN INTERFERON ALPHA
2B CỦA NGƯỜI . 34
III.2.1. Tạo dòngEscherichia coli DH5αmang vector biểu hiện Interferon alpha
2b của người . 34
III.2.2. Tạo dòng Pichia pastoriscó khảnăng biểu hiện Interferon alpha 2b của
người . 37
III.3. BIỂU HIỆN INTERFERON ALPHA 2B CỦA NGƯỜI . 38
Chương IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 43
IV.1. Kết luận . 43
IV.2. Kiến nghị. 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 44
Trên toàn thế giới khoảng 350 triệu người bị nhiễm HBV (Hepatitis B virus)
mạn tính và hơn 170 triệu người bị nhiễm HCV (Hepatitis C virus) với 3 ñến 4 triệu
ca nhiễm mới mỗi năm [17]. Tính riêng tại Việt Nam, số người ñang nhiễm virus
gây viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu vi C chiếm ñến hơn 25% dân số. Hơn thế
nữa, theo ñánh giá của các nhà kinh tế thì thị trường của HCV tăng từ 2.2 tỷ USD
năm 2005 lên 4.4 tỷ USD vào năm 2010 và 8.8 tỷ USD vào năm 2015. Từ ñó có thể
thấy nhu cầu interferon, vốn ñược xem là loại thuốc cơ bản và duy nhất ñược sử
dụng rộng rãi trong ñiều trị bệnh viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu vi C, là rất
cao. Chỉ trong năm 2005, tổng doanh thu của ngành dược thế giới cho sản phẩm
interferon beta là khoảng 3.8 tỷ USD và interferon alpha là 2.1 tỷ USD [7].
Ở Việt Nam ñang lưu hành 6 loại thuốc interferon với các tên biệt dược như
Uniferon (của hãng Getz pharma), RoferonA (của hãng Roche, Thụy Sỹ), IntronA
(Mỹ), Shanthaferon (Ấn ðộ), La feron (Ucraina), Alpha Feron (Jedang - Hàn Quốc)
và Superferon và IVACFeron (Interferon alpha 2b do Viện Vaccine và Sinh phẩm
Nha Trang ñã nhập và ñóng gói). Tất cả các loại thuốc interferon này ñều phải nhập
từ nước ngoài, dẫn ñến việc ñiều trị bằng interferon (kéo dài trong vòng 4-6 tháng,
mỗi tuần ñiều trị 2-3 lần, mỗi lần tốn 1-4 triệu ñồng) là quá cao ñối với mức thu
nhập của người Việt Nam.
Trước tình hình này, việc nghiên cứu sản xuất interferon alpha không chỉ là
một hướng nghiên cứu mới trong nghiên cứu khoa học cơ bản mà còn có tính ứng
dụng cao, phục vụ cho nền Y học nước nhà. Vì vậy, chúng tui thực hiện ñề tài “Tạo
dòng và biểu hiện Interferon alpha 2b của người trên hệ thống tế bào nấm men
Pichia pastoris” với mục tiêu là tạo ñược chủng tế bào nấm men Pichia pastoris có
khả năng biểu hiện interferon alpha 2b của người (hIFNα2b) với hàm lượng cao ñể
có thể ứng dụng vào sản xuất interferon alpha 2b với số lượng lớn ñáp ứng nhu cầu
trong nước.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
MỤC LỤC . i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮVIẾT TẮT . iii
DANH MỤC CÁC BẢNG . iv
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ. v
MỞ ðẦU . 1
Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 2
I.1. INTERFERON . 2
I.1.1. Các dạng Interferon . 2
I.1.2. Cơchếhoạt ñộng của Interferon . 4
I.1.3. Các ứng dụng của Interferon . 6
I.1.4. Tình hình nghiên cứu Interferon hiện nay . 8
I.2. HỆTHỐNG BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS. 8
I.2.1. Các hệthống biểu hiện Interferon alpha 2b . 8
I.2.2. Ưu nhược ñiểm của hệthống biểu hiện Pichia pastoris. 10
Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . 12
II.1. VẬT LIỆU . 12
II.1.1. Dụng cụvà thiết bị. 12
II.1.2. Hóa chất và môi trường . 13
II.1.3. Nguyên vật liệu . 15
II.2. PHƯƠNG PHÁP. 20
II.2.1. Tách chiết DNA người tổng sốbằng Chelex . 20
II.2.2. Phương pháp PCR (dùng ñểkhuếch ñại ñoạn gene mục tiêu và kiểm tra
khuẩn lạc mang gene mục tiêu) . 20
II.2.3. Phương pháp tinh sạch DNA từgel agarose . 21
II.2.4. Phương pháp ñiện biến nạp cho E. coli. 21
II.2.5. Phương pháp cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn . 22
II.2.6. Phương pháp nối DNA bằng enzyme T4 ligase. 22
II.2.7. Phương pháp tách chiết plasmid từtếbàoE. coli. 23
II.2.8. Phương pháp ñiện biến nạp cho Pichia pastoris. 23
II.2.9. Phương pháp lai khuẩn lạc . 24
II.2.10. Phương pháp lên men Pichia pastoris.24
II.2.11. Phương pháp Bradford dùng ñể ño hàm lượng protein . 25
II.2.12. Phương pháp ñiện di SDS-PAGE . 25
II.2.13. Phương pháp Western blot . 27
Trang ii
Chương III KẾT QUẢVÀ BIỆN LUẬN . 28
III.1. TẠO DÒNG ESCHERICHIA COLI MANG GENE MÃ HÓA CHO
INTERFERON ALPHA 2B CỦA NGƯỜI . 28
III.1.1. Tổng hợp gene mã hóa cho Interferon alpha 2b của người . 28
III.1.2. Tạo dòng Escherichia coliDH5αmang vector nhân dòng gene mã hóa
Interferon alpha 2b của người . 30
III.2. TẠO DÒNG PICHIA PASTORISBIỂU HIỆN INTERFERON ALPHA
2B CỦA NGƯỜI . 34
III.2.1. Tạo dòngEscherichia coli DH5αmang vector biểu hiện Interferon alpha
2b của người . 34
III.2.2. Tạo dòng Pichia pastoriscó khảnăng biểu hiện Interferon alpha 2b của
người . 37
III.3. BIỂU HIỆN INTERFERON ALPHA 2B CỦA NGƯỜI . 38
Chương IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 43
IV.1. Kết luận . 43
IV.2. Kiến nghị. 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 44
Trên toàn thế giới khoảng 350 triệu người bị nhiễm HBV (Hepatitis B virus)
mạn tính và hơn 170 triệu người bị nhiễm HCV (Hepatitis C virus) với 3 ñến 4 triệu
ca nhiễm mới mỗi năm [17]. Tính riêng tại Việt Nam, số người ñang nhiễm virus
gây viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu vi C chiếm ñến hơn 25% dân số. Hơn thế
nữa, theo ñánh giá của các nhà kinh tế thì thị trường của HCV tăng từ 2.2 tỷ USD
năm 2005 lên 4.4 tỷ USD vào năm 2010 và 8.8 tỷ USD vào năm 2015. Từ ñó có thể
thấy nhu cầu interferon, vốn ñược xem là loại thuốc cơ bản và duy nhất ñược sử
dụng rộng rãi trong ñiều trị bệnh viêm gan siêu vi B và viêm gan siêu vi C, là rất
cao. Chỉ trong năm 2005, tổng doanh thu của ngành dược thế giới cho sản phẩm
interferon beta là khoảng 3.8 tỷ USD và interferon alpha là 2.1 tỷ USD [7].
Ở Việt Nam ñang lưu hành 6 loại thuốc interferon với các tên biệt dược như
Uniferon (của hãng Getz pharma), RoferonA (của hãng Roche, Thụy Sỹ), IntronA
(Mỹ), Shanthaferon (Ấn ðộ), La feron (Ucraina), Alpha Feron (Jedang - Hàn Quốc)
và Superferon và IVACFeron (Interferon alpha 2b do Viện Vaccine và Sinh phẩm
Nha Trang ñã nhập và ñóng gói). Tất cả các loại thuốc interferon này ñều phải nhập
từ nước ngoài, dẫn ñến việc ñiều trị bằng interferon (kéo dài trong vòng 4-6 tháng,
mỗi tuần ñiều trị 2-3 lần, mỗi lần tốn 1-4 triệu ñồng) là quá cao ñối với mức thu
nhập của người Việt Nam.
Trước tình hình này, việc nghiên cứu sản xuất interferon alpha không chỉ là
một hướng nghiên cứu mới trong nghiên cứu khoa học cơ bản mà còn có tính ứng
dụng cao, phục vụ cho nền Y học nước nhà. Vì vậy, chúng tui thực hiện ñề tài “Tạo
dòng và biểu hiện Interferon alpha 2b của người trên hệ thống tế bào nấm men
Pichia pastoris” với mục tiêu là tạo ñược chủng tế bào nấm men Pichia pastoris có
khả năng biểu hiện interferon alpha 2b của người (hIFNα2b) với hàm lượng cao ñể
có thể ứng dụng vào sản xuất interferon alpha 2b với số lượng lớn ñáp ứng nhu cầu
trong nước.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links