Chia sẻ miễn phí cho các bạn tài liệu: Nghiên cứu và xây dựng quy trình phát hiện một số đột biến gen gây bệnh β-thalassemia
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Bệnh β-thalassemia 3
1.1.1. Lịch sử bệnh thalassemia 3
1.1.2. Đặc điểm dịch tễ học. 3
1.1.3. Sơ lược về hemoglobin. 4
1.1.4. Phân loại bệnh thalassemia 6
1.1.5. Sinh lý bệnh. 6
1.1.6. Các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng. 8
1.1.7. Cơ chế di truyền 12
1.1.8. Bệnh học phân tử bệnh β-thalassemia 13
1.2. Một số kỹ thuật ứng dụng trong sinh học phân tử để phát hiện đột biến gen. 15
1.2.1. Phản ứng PCR. 15
1.2.2. Giải trình tự gen trực tiếp 17
1.2.3 Enzym giới hạn. 17
1.2.4. Phản ứng nối chuỗi 17
1.2.5. Hệ thống phát hiện đột biến bền với nhiệt 17
1.2.6. Phản ứng Multiplex PCR. 18
1.3. Một số kỹ thuật đang nghiên cứu và ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh β-thalassemia tại Việt Nam. 18
1.3.1. Kỹ thuật điện di huyết sắc tố. 18
1.3.2. Kỹ thuật giải trình tự gen. 19
1.3.3. Kỹ thuật ARMS-PCR. 20
1.3.4. Kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR. 20
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 21
2.1. Đối tượng và bệnh phẩm. 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu. 21
2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị 21
2.2.2 Quy trình kỹ thuật 23
2.2.3. Quy trình phát hiện đột biến 27
2.2.4. Điện di DNA trên gel agarose 28
2.2.5. Giải trình tự. 30
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32
3.1. Kết quả tách chiết DNA 32
3.2. Kiểm tra chất lượng mồi và chuẩn hóa quy trình. 34
3.2.1. Chuẩn hóa PCR đơn mồi. 34
3.2.2. Kết quả chuẩn hóa quy trình multiplex-PCR 36
3.3. Kết quả xác định đột biến trên bệnh nhân. 38
3.4. Tổng kết đột biến trên bệnh nhân . 40
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 41
4.1. Kết quả tách chiết DNA 41
4.2. Kết quả PCR 42
KẾT LUẬN 45
KIẾN NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ĐẶT VẤN ĐỀ
Thalassemia là tên một loại bệnh thiếu máu do di truyền. Nguyên nhân do giảm hay mất khả năng tổng hợp chuỗi globin trong phân tử hemoglobin. Thalassemia là một thuật ngữ tiếng Hy Lạp ghép từ 2 từ thalass (biển) và haima (máu), do bệnh lần đầu tiên được phát hiện và phổ biến ở vùng Địa Trung Hải. Tùy theo sự thiếu hụt khả năng tổng hợp chuỗi alpha (α), chuỗi beta (β) hay chuỗi delta (δ) mà tên gọi của bệnh là α-thalassemia, β-thalassemia hay δ-thalassemia [1].
β-thalassemia là một nhóm hội chứng thiếu máu đặc trưng bởi sự giảm hay mất khả năng tổng hợp chuỗi β globin, điều này gây nên sự thiếu hụt hemoglobin trong tế bào hồng cầu, giảm sản xuất hồng cầu và gây thiếu máu. β-thalassemia được phân thành 3 thể nặng, trung gian và nhẹ. Ngoài ra bệnh cũng liên quan tới sự bất thường của hemoglobin như HbE, HbC, HbS.
Hàng năm tỷ lệ mắc của trẻ sơ sinh ước tính khoảng 1 trong 100.000 trẻ trên toàn thế giới và 1 trong 10.000 trẻ ở châu Âu [2]. Trong các nước khu vực Đông Nam Á có tỷ lệ mắc thay đổi từ 3 đến 10%. Ở việt nam theo nghiên cứu của Nguyễn Công Khanh năm 1993, β-thalassemia là nguyên nhân hàng đầu gây thiếu máu ở trẻ em. Tỷ lệ người mang gen gây bệnh phân bố rộng khắp cả nước và khác nhau theo vùng miền, dân tộc. Đặc biệt, tỷ lệ này khá cao ở các dân tộc ít người như Mông(25%), Catu (14%), Tày (11%), Pako (8,33%) [1].
Hiện nay, có khoảng hơn 200 đột biến trên đoạn gen tổng hợp chuỗi β globin đã được xác định. Theo một nghiên cứu trên quần thể người Việt Nam của M.L.Saovarros Svasti và Trần Minh Hiếu năm 2002 cho thấy các đột biến chính gây bệnh β-thalassemia là Cd17(AAG-TAG), Cd41/42(-TCTT), Cd71/72(+A), IVS1-1(G>T), IVS1-5(G>C), -28(A-G), IVS2-654(C>T) và Cd26(GAG>AAG) [3].
Bệnh nhân trước đây được chẩn đoán thiếu máu β-thalassemia chủ yếu dựa trên các triệu chứng lâm sàng và các thông số huyết học. Tuy nhiên các chẩn đoán này là chưa đầy đủ và ít có ý nghĩa trong chẩn đoán trước sinh. Ngày nay trên sự phát triển của công nghệ đặc biệt là sinh học phân tử giúp cho sự chẩn đoán đột biến gen gây bệnh là dễ dàng và chính xác giúp cho sự hạn chế trẻ sơ sinh mang gen đột biến. Ở nước ta các kỹ thuật giúp cho sự chẩn đoán đột biến gen đang được nghiên cứu và đạt được một số thành tựu nhất định. Tuy nhiên sử dụng các kỹ thuật này trong chẩn đoán đột biến gen β-thalassemia mới chỉ đang nghiên cứu chứ chưa được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán trước sinh.
Từ những vấn đề nêu trên chúng ta cần tiến hành đề tài “Nghiên cứu và xây dựng quy trình phát hiện một số đột biến gen gây bệnh β-thalassemia” với mục tiêu:
Áp dụng kỹ thuật Multiplex -PCR sàng lọc và xác định một số đột biến phổ biến gây bệnh β-thalassemia.
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Bệnh β-thalassemia
1.1.1. Lịch sử bệnh thalassemia
β-thalassemia được phát hiện từ khá sớm 1925 bởi Lee và Cooley. Ca bệnh đầu tiên có ngồn gốc từ Hy Lạp và Italy, đã đặt tên là bệnh thiếu máu Cooley. Tới năm 1936, Wippe và Bradford phát hiện ra có nhiều bệnh nhân thiếu máu tại vùng Địa Trung Hải giống với trường hợp năm 1925 và đặt tên cho bệnh là thiếu máu β-thalassemia (theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là thiếu máu vùng biển) [4].
1.1.2. Đặc điểm dịch tễ học.
Thalassemia là bệnh di truyền có sự phân bố liên quan chặt chẽ tới nguồn gốc dân tộc , tập tính di cư và kết hôn. Bệnh phát hiện trên nhiều nước trên thế giới, chủ yếu có ở vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Bắc Phi, Đông Nam Á. Theo ước tính WHO (1981) trên thế giới có khoảng 70 triệu người mắc bệnh β-thalassemia, trong đó có khoảng 60 triệu ở Châu Á và 4800 người ở Châu Âu[2].
Theo nghiên cứu của Renzo Galannello, Raffaella và Origa cứ 100.000 trẻ sơ sinh trên thế giới được sinh ra thì có 1 trẻ mắc bệnh. Trong đó cứ 10.000 trẻ sơ sinh tại châu Âu thì có 1 trẻ mắc bệnh [2].
Ở Việt Nam, trường hợp bệnh α-thalassemia và β-thalassemia được phát hiện trên cả nước. β-thalassemia gặp nhiều ở dân tộc ít người ở miền bắc, người Mường 25%, người thái 16,6%, người Nùng 7,1%[5]. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thanh Liêm khi khảo sát nhóm dân tộc Mường tại Kim Bôi Hòa Bình thấy phát hiên đột biến tần số 10,67%. Ngoài ra nghiên cứu phát hiện tỷ lệ người mang bệnh HbE khoảng 11,65%. Theo Nguyễn Công Khanh, tần suất HbE xuất hiện khá cao ở nhiều dân tộc ít người ở miền Trung và Nam: Êđê 41%, Khơme 36,8%, Stieng 55,9% [6]. Người mang bệnh HbE có biểu hiện lâm sàng giống với bệnh β-thalassemia và thường có sự tương tác của bệnh β-thalassemia với các bất thường hemoglobin khác.
1.1.3. Sơ lược về hemoglobin.
1.1.3.1. Chuỗi globin thường
Hemoglobin là một protein cấu trúc nằm trong hồng cầu có vai trò quan trọng trong việc vận chuyển O¬2 đến các tổ chức và vận chuyển các sản phẩm chuyển hóa H+ và CO2 đến thận và phổi để đào thải. Ngoài ra hemoglobin còn có chức năng như một enzyme và hệ thống đệm.
Cấu trúc phân tử Hb gồm nhân hem và chuỗi globin trong đó:
Globin có cấu trúc là 2 cặp chuỗi polipeptid. Ở người trưởng thành HbA chiếm 95% được cấu tạo từ 4 chuỗi globin: 2 chuỗi α và 2 chuỗi β.
Chuỗi alpha tổng hợp từ đoạn gen nằm trên cánh ngắn NST 16 có kích thước 141 acid amin.
Chuỗi beta tổng hợp từ đoạn gen nằm trên cánh ngắn NST 11 có kích thước 146 acid amin.
Ngoài ra kích thước chuỗi delta, gama là 146 acid amin.
Nhân hem thuộc loại porphyrin là chất có khả năng kết hợp với các phân tử kim loại. Hem ở người là loại porphyrin ІX kết hợp với FeІI+ [7].
Hình 1.1 Mô hình cấu trúc phân tử hemoglobin[8]
1.1.3.2. Các loại hemoglobin sinh lý.
Ở người có sáu loại hemoglobin (Hb) biến đổi phát triển qua từng thời kỳ phát triển.Ở thời kỳ phôi thai có Hb Gower, Hb Gower2 và Hb Porland. Hemoglobin ở thời kỳ thai nhi tới trưởng thành là HbA1, HbA2 và HbF. Thành phần các loại hemoglobin có một tỷ lệ giới hạn nhất định theo lứa tuổi, thay đổi tỷ lệ này là bệnh lý. [9]
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
- Bạn nào có tài liệu gì hay thì up lên đây chia sẻ cùng anh em.
- Ai cần tài liệu gì mà không tìm thấy ở forum, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Bệnh β-thalassemia 3
1.1.1. Lịch sử bệnh thalassemia 3
1.1.2. Đặc điểm dịch tễ học. 3
1.1.3. Sơ lược về hemoglobin. 4
1.1.4. Phân loại bệnh thalassemia 6
1.1.5. Sinh lý bệnh. 6
1.1.6. Các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng. 8
1.1.7. Cơ chế di truyền 12
1.1.8. Bệnh học phân tử bệnh β-thalassemia 13
1.2. Một số kỹ thuật ứng dụng trong sinh học phân tử để phát hiện đột biến gen. 15
1.2.1. Phản ứng PCR. 15
1.2.2. Giải trình tự gen trực tiếp 17
1.2.3 Enzym giới hạn. 17
1.2.4. Phản ứng nối chuỗi 17
1.2.5. Hệ thống phát hiện đột biến bền với nhiệt 17
1.2.6. Phản ứng Multiplex PCR. 18
1.3. Một số kỹ thuật đang nghiên cứu và ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh β-thalassemia tại Việt Nam. 18
1.3.1. Kỹ thuật điện di huyết sắc tố. 18
1.3.2. Kỹ thuật giải trình tự gen. 19
1.3.3. Kỹ thuật ARMS-PCR. 20
1.3.4. Kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR. 20
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 21
2.1. Đối tượng và bệnh phẩm. 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu. 21
2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị 21
2.2.2 Quy trình kỹ thuật 23
2.2.3. Quy trình phát hiện đột biến 27
2.2.4. Điện di DNA trên gel agarose 28
2.2.5. Giải trình tự. 30
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32
3.1. Kết quả tách chiết DNA 32
3.2. Kiểm tra chất lượng mồi và chuẩn hóa quy trình. 34
3.2.1. Chuẩn hóa PCR đơn mồi. 34
3.2.2. Kết quả chuẩn hóa quy trình multiplex-PCR 36
3.3. Kết quả xác định đột biến trên bệnh nhân. 38
3.4. Tổng kết đột biến trên bệnh nhân . 40
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 41
4.1. Kết quả tách chiết DNA 41
4.2. Kết quả PCR 42
KẾT LUẬN 45
KIẾN NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ĐẶT VẤN ĐỀ
Thalassemia là tên một loại bệnh thiếu máu do di truyền. Nguyên nhân do giảm hay mất khả năng tổng hợp chuỗi globin trong phân tử hemoglobin. Thalassemia là một thuật ngữ tiếng Hy Lạp ghép từ 2 từ thalass (biển) và haima (máu), do bệnh lần đầu tiên được phát hiện và phổ biến ở vùng Địa Trung Hải. Tùy theo sự thiếu hụt khả năng tổng hợp chuỗi alpha (α), chuỗi beta (β) hay chuỗi delta (δ) mà tên gọi của bệnh là α-thalassemia, β-thalassemia hay δ-thalassemia [1].
β-thalassemia là một nhóm hội chứng thiếu máu đặc trưng bởi sự giảm hay mất khả năng tổng hợp chuỗi β globin, điều này gây nên sự thiếu hụt hemoglobin trong tế bào hồng cầu, giảm sản xuất hồng cầu và gây thiếu máu. β-thalassemia được phân thành 3 thể nặng, trung gian và nhẹ. Ngoài ra bệnh cũng liên quan tới sự bất thường của hemoglobin như HbE, HbC, HbS.
Hàng năm tỷ lệ mắc của trẻ sơ sinh ước tính khoảng 1 trong 100.000 trẻ trên toàn thế giới và 1 trong 10.000 trẻ ở châu Âu [2]. Trong các nước khu vực Đông Nam Á có tỷ lệ mắc thay đổi từ 3 đến 10%. Ở việt nam theo nghiên cứu của Nguyễn Công Khanh năm 1993, β-thalassemia là nguyên nhân hàng đầu gây thiếu máu ở trẻ em. Tỷ lệ người mang gen gây bệnh phân bố rộng khắp cả nước và khác nhau theo vùng miền, dân tộc. Đặc biệt, tỷ lệ này khá cao ở các dân tộc ít người như Mông(25%), Catu (14%), Tày (11%), Pako (8,33%) [1].
Hiện nay, có khoảng hơn 200 đột biến trên đoạn gen tổng hợp chuỗi β globin đã được xác định. Theo một nghiên cứu trên quần thể người Việt Nam của M.L.Saovarros Svasti và Trần Minh Hiếu năm 2002 cho thấy các đột biến chính gây bệnh β-thalassemia là Cd17(AAG-TAG), Cd41/42(-TCTT), Cd71/72(+A), IVS1-1(G>T), IVS1-5(G>C), -28(A-G), IVS2-654(C>T) và Cd26(GAG>AAG) [3].
Bệnh nhân trước đây được chẩn đoán thiếu máu β-thalassemia chủ yếu dựa trên các triệu chứng lâm sàng và các thông số huyết học. Tuy nhiên các chẩn đoán này là chưa đầy đủ và ít có ý nghĩa trong chẩn đoán trước sinh. Ngày nay trên sự phát triển của công nghệ đặc biệt là sinh học phân tử giúp cho sự chẩn đoán đột biến gen gây bệnh là dễ dàng và chính xác giúp cho sự hạn chế trẻ sơ sinh mang gen đột biến. Ở nước ta các kỹ thuật giúp cho sự chẩn đoán đột biến gen đang được nghiên cứu và đạt được một số thành tựu nhất định. Tuy nhiên sử dụng các kỹ thuật này trong chẩn đoán đột biến gen β-thalassemia mới chỉ đang nghiên cứu chứ chưa được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán trước sinh.
Từ những vấn đề nêu trên chúng ta cần tiến hành đề tài “Nghiên cứu và xây dựng quy trình phát hiện một số đột biến gen gây bệnh β-thalassemia” với mục tiêu:
Áp dụng kỹ thuật Multiplex -PCR sàng lọc và xác định một số đột biến phổ biến gây bệnh β-thalassemia.
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Bệnh β-thalassemia
1.1.1. Lịch sử bệnh thalassemia
β-thalassemia được phát hiện từ khá sớm 1925 bởi Lee và Cooley. Ca bệnh đầu tiên có ngồn gốc từ Hy Lạp và Italy, đã đặt tên là bệnh thiếu máu Cooley. Tới năm 1936, Wippe và Bradford phát hiện ra có nhiều bệnh nhân thiếu máu tại vùng Địa Trung Hải giống với trường hợp năm 1925 và đặt tên cho bệnh là thiếu máu β-thalassemia (theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là thiếu máu vùng biển) [4].
1.1.2. Đặc điểm dịch tễ học.
Thalassemia là bệnh di truyền có sự phân bố liên quan chặt chẽ tới nguồn gốc dân tộc , tập tính di cư và kết hôn. Bệnh phát hiện trên nhiều nước trên thế giới, chủ yếu có ở vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Bắc Phi, Đông Nam Á. Theo ước tính WHO (1981) trên thế giới có khoảng 70 triệu người mắc bệnh β-thalassemia, trong đó có khoảng 60 triệu ở Châu Á và 4800 người ở Châu Âu[2].
Theo nghiên cứu của Renzo Galannello, Raffaella và Origa cứ 100.000 trẻ sơ sinh trên thế giới được sinh ra thì có 1 trẻ mắc bệnh. Trong đó cứ 10.000 trẻ sơ sinh tại châu Âu thì có 1 trẻ mắc bệnh [2].
Ở Việt Nam, trường hợp bệnh α-thalassemia và β-thalassemia được phát hiện trên cả nước. β-thalassemia gặp nhiều ở dân tộc ít người ở miền bắc, người Mường 25%, người thái 16,6%, người Nùng 7,1%[5]. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thanh Liêm khi khảo sát nhóm dân tộc Mường tại Kim Bôi Hòa Bình thấy phát hiên đột biến tần số 10,67%. Ngoài ra nghiên cứu phát hiện tỷ lệ người mang bệnh HbE khoảng 11,65%. Theo Nguyễn Công Khanh, tần suất HbE xuất hiện khá cao ở nhiều dân tộc ít người ở miền Trung và Nam: Êđê 41%, Khơme 36,8%, Stieng 55,9% [6]. Người mang bệnh HbE có biểu hiện lâm sàng giống với bệnh β-thalassemia và thường có sự tương tác của bệnh β-thalassemia với các bất thường hemoglobin khác.
1.1.3. Sơ lược về hemoglobin.
1.1.3.1. Chuỗi globin thường
Hemoglobin là một protein cấu trúc nằm trong hồng cầu có vai trò quan trọng trong việc vận chuyển O¬2 đến các tổ chức và vận chuyển các sản phẩm chuyển hóa H+ và CO2 đến thận và phổi để đào thải. Ngoài ra hemoglobin còn có chức năng như một enzyme và hệ thống đệm.
Cấu trúc phân tử Hb gồm nhân hem và chuỗi globin trong đó:
Globin có cấu trúc là 2 cặp chuỗi polipeptid. Ở người trưởng thành HbA chiếm 95% được cấu tạo từ 4 chuỗi globin: 2 chuỗi α và 2 chuỗi β.
Chuỗi alpha tổng hợp từ đoạn gen nằm trên cánh ngắn NST 16 có kích thước 141 acid amin.
Chuỗi beta tổng hợp từ đoạn gen nằm trên cánh ngắn NST 11 có kích thước 146 acid amin.
Ngoài ra kích thước chuỗi delta, gama là 146 acid amin.
Nhân hem thuộc loại porphyrin là chất có khả năng kết hợp với các phân tử kim loại. Hem ở người là loại porphyrin ІX kết hợp với FeІI+ [7].
Hình 1.1 Mô hình cấu trúc phân tử hemoglobin[8]
1.1.3.2. Các loại hemoglobin sinh lý.
Ở người có sáu loại hemoglobin (Hb) biến đổi phát triển qua từng thời kỳ phát triển.Ở thời kỳ phôi thai có Hb Gower, Hb Gower2 và Hb Porland. Hemoglobin ở thời kỳ thai nhi tới trưởng thành là HbA1, HbA2 và HbF. Thành phần các loại hemoglobin có một tỷ lệ giới hạn nhất định theo lứa tuổi, thay đổi tỷ lệ này là bệnh lý. [9]
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
- Bạn nào có tài liệu gì hay thì up lên đây chia sẻ cùng anh em.
- Ai cần tài liệu gì mà không tìm thấy ở forum, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
