Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết Nối
Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng xử lý nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở đồng bằng sông Cửu Long
Chƣơng 1: Giới thiệu.......................................................................................1
1.1 Tính cấp thiết của đề tài............................................................................1
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu .............................................................2
1.2.1 Mục tiêu đề tài......................................................................................2
1.2.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................2
1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................3
1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận
án.................................................................................................................3
1.5 Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học .......................................................4
Chƣơng 2: Tổng quan tài liệu.........................................................................5
2.1 Tổng quan về chất thải chăn nuôi heo................................................................5
2.1.1 Đặc điểm của nước thải sau biogas chuồng trại chăn nuôi heo ...........5
2.1.2 Quản lý chất thải chăn nuôi heo trên thế giới.......................................5
2.1.3 Quản lý chất thải chăn nuôi heo tại Việt Nam .....................................6
2.2 Xử lý nƣớc thải trong chăn nuôi...............................................................7
2.2.1 Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng nước .................................................7
2.2.2 Biện pháp xử lý nước thải ....................................................................8
2.3 Kết tụ sinh học trong nƣớc........................................................................9
2.3.1 Kết tụ sinh học (Bioflocculant) ............................................................9
2.3.2 Nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học.............................18
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kết tụ của vi khuẩn ....................23
2.3.4 Ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xử lý nước
thải ........................................................................................................29iv
2.3.5 Quy trình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
trong xử lý nước thải ............................................................................31
Chƣơng 3: Phƣơng pháp nghiên cứu..........................................................33
3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu ............................................................................33
3.1.1 Thời gian...............................................................................................33
3.1.2 Địa điểm ...............................................................................................33
3.1.3 Vật liệu .................................................................................................33
3.1.4 Thiết bị..................................................................................................34
3.1.4 Hóa chất................................................................................................34
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ..........................................................................35
3.2.1 Chuẩn bị mẫu........................................................................................35
3.2.2 Phân lập và làm thuần ..........................................................................36
3.2.3 Phân tích và xử lý số liệu .....................................................................38
3.3 Nội dung nghiên cứu..................................................................................38
3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát..................................................................38
3.3.2 Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kế tụ
sinh học.................................................................................................40
3.3.3 Nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học bằng sinh
học phân tử ...........................................................................................41
3.3.4 Phân tích các chỉ số đa dạng di truyền dựa trên trình tự 16S
rRNA.....................................................................................................46
3.3.5 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp chất
kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn được tuyển chọn.....................47
3.3.6 Ly trích chất kết tụ sinh học ................................................................53
3.3.7 Thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải chăn nuôi heo sau
biogas của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học...............................54
3.7.8 Ứng dụng các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
xử lý nước thải sau biogas ...................................................................55
Chƣơng 4: Kết quả và thảo luận .................................................................56
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học… .................56
4.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ..........57
4.2.1 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
protein ...................................................................................................57
4.2.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
polysaccharide ......................................................................................58v
4.3 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học.............................................................................................................59
4.3.1 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học protein ............................................................................................59
4.3.2 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học polysaccharide................................................................................59
4.4 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cao ở các tỉnh đồng
bằng sông Cửu Long ...............................................................................61
4.4.1 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein.........................................61
4.4.2 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide ............................68
4.5 Phân tích đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học..........................................................................................74
4.5.1 Đa dạng về chủng giữa của các loài vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học dựa vào chỉ số Shannon................................................76
4.5.2 Đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học.................................................................................................77
4.6 Xác định các điều kiện tối ƣu cho khả năng tổng hợp chất kết
tụ sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium LA51P
(protein) và chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai KG12S
(polysaccharide) ......................................................................................91
4.6.1 Mối tương quan giữa thời gian nuôi ủ, tỷ lệ kết tụ và mật độ
vi khuẩn ................................................................................................91
4.6.2 Nhiệt độ nuôi ủ .....................................................................................93
4.6.3 Giá trị pH..............................................................................................94
4.6.4 Sự tương tác giữa các điều kiện nuôi sinh khối về thời gian,
pH và nhiệt độ của hai chủng vi khuẩn ................................................97
4.6.5 Nguồn carbon, nguồn nitrogen và khoáng vô cơ .................................101
4.6.6 Xác định ảnh hưởng tương tác của 3 yếu tố dinh dưỡng đến
hiệu quả kết tụ sinh học ........................................................................102
4.6.7 Ion kim loại bổ sung.............................................................................106
4.6.8 Nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung............................................................108
4.6.9 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số vi khuẩn và
tỷ lệ kết tụ của 2 chủng vi khuẩn sau khi tối ưu ...................................109
4.6.10 Kết quả sử dụng các điều kiện tối ưu của hai chủng vi khuẩn
protein ...................................................................................................110vi
4.6.11 Kết quả sử dụng các điều kiện tối ưu của hai chủng vi khuẩn
polysaccharide ......................................................................................111
4.6.12 Đặc điểm sinh hóa 2 chủng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ sinh học
cao được chọn thử nghiệm hiệu suất ứng dụng ....................................112
4.7 Ly trích chất kết tụ sinh học đƣợc tổng hợp từ hai chủng vi
khuẩn Bacillus megaterium LA51P và Bacillus aryabhattai
KG12S và thử nghiệm hiệu quả kết tụ sinh học..................................113
4.7.1 Kết quả ly trích .....................................................................................113
4.7.2 Hiệu suất kết tụ sinh học ......................................................................114
4.8 Thử nghiệm hiệu quả xử lý nƣớc thải sau biogas từ trại chăn
nuôi heo ....................................................................................................115
4.8.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ kết tụ (%) các chủng vi khuẩn
khi thử nghiệm ở nước thải ngoài thực tế.............................................115
4.8.2 Thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau
biogas của các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở
thể tích 10 lít .........................................................................................119
4.8.3 Thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau
biogas của 2 chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở
thể tích 100 lít .......................................................................................121
4.9 Hiệu quả xử lý nƣớc thải chăn nuôi heo sau biogas của vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở thể tích 1 m3 và 40 m3............122
4.9.1 Hiệu suất xử lý ở thể tích 1 m3 .............................................................122
4.9.2 Hiệu suất xử lý ở thể tích 40 m3 ...........................................................122
Chƣơng 5: Kết luận và đề xuất.......................................................................125
5.1 Kết luận.......................................................................................................125
5.2 Đề xuất ........................................................................................................126
Tài liệu tham khảo ...........................................................................................127
Phụ lục ..............................................................................................................145vii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 Chất kết tụ sinh học được tổng hợp từ các chủng vi khuẩn
khác nhau từ năm 2007 – 2013......................................................... 16
Bảng 2.2 Một số môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ
sinh học............................................................................................. 19
Bảng 2.3 Một số cặp mồi sử dụng để nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học................................................................................... 20
Bảng 2.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen đến hiệu quả tổng
hợp chất kết tụ sinh học đến vi khuẩn Klebsiella sp. ....................... 26
Bảng 2.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ đến
hiệu quả tổng hợp chất kết tụ sinh học đến vi khuẩn Serratia
fiacria ............................................................................................... 27
Bảng 2.6 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến sự kết tụ của các vi sinh
vật tổng hợp chất kết tụ sinh học...................................................... 27
Bảng 2.7 Liều lượng của các vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
khác nhau cho tỷ lệ kết tụ (%) ở dung dịch kaolin........................... 29
Bảng 2.8 Ảnh hưởng của liều lượng, nhiệt độ và pH lên khả năng kết
tụ của chất kết tụ M-1....................................................................... 29
Bảng 2.9 Kết quả xử lý nước thải tinh bột bởi các nhân tố kết tụ ................... 30
Bảng 2.10 Hiệu quả xử lý các loại nước thải bởi chất kết tụ sinh học từ
vi khuẩn Serratia ficaria .................................................................. 31
Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu của nước thải tại trại chăn nuôi heo (sau
biogas) ở huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long ................................... 34
Bảng 3.2 Môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học .......... 35
Bảng 3.3 Thành phần cho 1 mẫu DNA thực hiện phản ứng PCR ................... 42
Bảng 3.4 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 1 ........................................................................................... 47
Bảng 3.5 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 2a ......................................................................................... 49
Bảng 3.6 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 2b ......................................................................................... 49
Bảng 3.7 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 3 ........................................................................................... 50
Bảng 3.8 Nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát sự tương tác 3 yếu tố
thời gian, pH và nhiệt độ ủ đến tỷ lệ kết tụ của hai chủng vi
khuẩn ................................................................................................ 50
Bảng 3.9 Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 yếu
tố nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ ..................................... 51viii
Bảng 3.10 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các tỷ lệ carbon,
nitrogen và khoáng vô cơ ............................................................... 51
Bảng 3.11 Bố trí thí nghiệm thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải ở
điều kiện phòng thí nghiệm............................................................ 54
Bảng 4.1 Số mẫu phân lập và số dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp
chất kết tụ sinh học .......................................................................... 56
Bảng 4.2 Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein có
tỷ lệ kết tụ sinh học cao ở các tỉnh ĐBSCL ..................................... 59
Bảng 4.3 Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide
có tỷ lệ kết tụ sinh học cao ở các tỉnh ĐBSCL................................. 60
Bảng 4.4 Đặc điểm sinh học của 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết
tụ sinh học protein ............................................................................ 62
Bảng 4.5 Kết quả so sánh trình tự 16S rRNA của 18 dòng vi khuẩn với
các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gene ........................................... 64
Bảng 4.6 Kết quả định danh 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học protein ................................................................................ 67
Bảng 4.7 Đặc điểm sinh học của 16 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết
tụ sinh học polysaccharide................................................................ 69
Bảng 4.8 Kết quả so sánh trình tự 16S rRNA của 16 dòng vi khuẩn so
với các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gene ..................................... 71
Bảng 4.9 Kết quả định danh 16 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học polysaccharide.................................................................... 73
Bảng 4.10 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học dựa trên cây phả hệ mối quan hệ di truyền ...................... 75
Bảng 4.11 Chỉ số đa dạng giữa các loài trong quần thể vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học.................................................................. 76
Bảng 4.12 Chỉ số đa dạng giữa các chủng trong quần thể vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học.......................................................... 77
Bảng 4.13 Giá trị Pi và Theta ở 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học........................................................................................... 83
Bảng 4.14 Các giá trị về chỉ số haplotypes của 2 nhóm vi khuẩn ................... 85
Bảng 4.15 Giá trị Pi và Theta ở 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học Bacillus megaterium và Bacillus aryabhattai .................. 87
Bảng 4.16 Các giá trị về chỉ số haplotypes của 2 nhóm vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học Bacillus megaterium và Bacillus
aryabhattai ...................................................................................... 88
Bảng 4.17 Các dạng haplotype của các chủng vi khuẩn Bacillus
megaterium..................................................................................... 88
Bảng 4.18 Các dạng haplotype của các chủng vi khuẩn Bacillus
aryabhattai ..................................................................................... 88ix
Bảng 4.19 Mã di truyền chuỗi nucleotide........................................................ 90
Bảng 4.20 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số tế bào vi
khuẩn và chỉ số OD660 .................................................................... 92
Bảng 4.21 Ảnh hưởng của thời gian, độ pH và nhiệt độ đến tỷ lệ kết tụ
của 2 chủng vi khuẩn...................................................................... 98
Bảng 4.22 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của
yếu tố nhiệt độ, thời gian và pH đến chủng vi khuẩn
Bacillus aryhadtai KG12S............................................................ 100
Bảng 4.23 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ
đến tỷ lệ kết tụ của hai chủng vi khuẩn........................................ 102
Bảng 4.24 Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ tinh bột, glutamate và
CaCl2 đến tỷ lệ kết tụ sinh học ..................................................... 103
Bảng 4.25 Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ glucose, glutamate và
K2HPO4 + KH2PO4 đến tỷ lệ kết tụ sinh học................................ 103
Bảng 4.26 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của 3
nhân tố dinh dưởng của chủng vi khuẩn Bacillus
megaterium LA51P ...................................................................... 105
Bảng 4.27 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của 3
nhân tố dinh dưởng của chủng vi khuẩn Bacillus aryhadtai
KG12S .......................................................................................... 106
Bảng 4.28 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số tế bào của
hai chủng vi khuẩn sau khi tối ưu ................................................ 110
Bảng 4.29 Tỷ lệ kết tụ kaolin của các chủng vi khuẩn có bản chất
protein ở điều kiện tối ưu ............................................................. 111
Bảng 4.30 Tỷ lệ kết tụ kaolin của các chủng vi khuẩn có bản chất
polysaccharide ở điều kiện tối ưu................................................. 112
Bảng 4.31 Đặc điểm sinh hóa 2 chủng vi khuẩn cho tỷ lệ kết tụ sin học
cao ở 2 môi trường phân lập......................................................... 113
Bảng 4.32 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn từ các mẫu chất thải
sau biogas của các trại chăn nuôi heo .......................................... 116
Bảng 4.33 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas của các
chủng vi khuẩn ở thể tích 10 lít.................................................... 120
Bảng 4.34 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hiệu suất xử lý chất thải sau
hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 100 lít....... 121
Bảng 4.35 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hiệu suất xử lý chất thải sau
hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 1 m3 ......... 122
Bảng 4.36 Kết quả phân tích các chỉ tiêu trong nước thải sau hệ thống
biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 40 m3 sau xử lý....... 123x
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Mô hình quản lý chất thải rắn chăn nuôi trên thế giới........................ 6
Hình 2.2 Xử lý nguồn chất thải chăn nuôi ở Việt Nam..................................... 8
Hình 2.3 Công thức cấu tạo kaolin .................................................................. 10
Hình 2.4 Cơ chế kết tụ của chất kết tụ sinh học DYU500............................... 12
Hình 2.5 Cây phả hệ về mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự 16S
rDNA của vi khuẩn 8-37-0-1............................................................ 17
Hình 2.6 Cây phả hệ về mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự 16S
rDNA của vi khuẩn Klebsiella sp..................................................... 17
Hình 2.7 Quy trình phân lập, nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học............................................................................................. 18
Hình 2.8 Đa hình đơn nucleotide (SNPs) và haplotype................................... 21
Hình 2.9 Quy trình ứng dụng chỉ số SNP trong công nghệ sinh học .............. 22
Hình 2.10 Quy trình phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học vào xử lý nước thải ................................. 32
Hình 3.1 Xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏ
giọt.................................................................................................... 37
Hình 3.2 Sơ đồ tổng quát các bước nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học................................................................................... 39
Hình 3.3 Pha loãng mẫu phân lập (A), tách ròng khuẩn lạc (B) các
dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học.................................... 40
Hình 3.4 Tóm tắt các bước nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học bằng kỹ thuật sinh học phân tử .......................................... 41
Hình 3.5 Chu kỳ gia nhiệt (thực hiện phản ứng PCR)..................................... 43
Hình 3.6 Phương pháp xác định tỷ lệ kết tụ sinh học bằng dung dịch
kaolin ................................................................................................ 48
Hình 4.1 Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học .................................................................................................... 57
Hình 4.2 Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
protein............................................................................................... 61
Hình 4.3 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các dòng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học protein ....................................................... 65
Hình 4.4 Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
polysaccharide .................................................................................. 68
Hình 4.5 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các dòng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide........................................... 72
Hình 4.6 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học.................................................................... 78xi
Hình 4.7 Giá trị đa dạng nuleotide (Pi) biến đổi theo trình tự chuỗi
nucleotide ......................................................................................... 79
Hình 4.8 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học protein ....................................................... 81
Hình 4.9 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide........................................... 82
Hình 4.10 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 18 chủng vi khuẩn tổng hợp Protein............................. 84
Hình 4.11 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 16 chủng vi khuẩn tổng hợp polysaccharide ................ 84
Hình 4.12 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 7 chủng vi khuẩn của loài Bacillus megaterium
strain............................................................................................... 87
Hình 4.13 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 7 chủng vi khuẩn của loài Bacillus aryabhattai
strain............................................................................................... 87
Hình 4.14 Ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh khối đến hiệu quả kết tụ
sinh học của 2 chủng vi khuẩn ....................................................... 91
Hình 4.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hiệu quả kết tụ sinh
học của hai chủng vi khuẩn ............................................................ 94
Hình 4.16 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi sinh khối đến hiệu quả
kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn .......................................... 95
Hình 4.17 Ảnh hưởng của pH môi trường kaolin đến hiệu quả kết tụ
sinh học của hai chủng vi khuẩn .................................................... 96
Hình 4.18 Đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng mức của tỷ lệ kết
tụ theo thời gian = 120 giờ, pH = X (5 - 7) và nhiệt độ = Y
(30 - 34) .......................................................................................... 99
Hình 4.19 Đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng mức của tỷ lệ kết
tụ ở nhiệt độ = 33oC, Thời gian = X (96 - 144) và pH = Y
(5 - 7) .............................................................................................. 99
Hình 4.20 Ảnh hưởng của các muối kim loại đến hiệu quả kết tụ sinh
học của hai chủng vi khuẩn .......................................................... 107
Hình 4.21 Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung đến khả
năng kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn ............................... 108
Hình 4.22 Khối lượng chất kết tụ ly trích từ 100 ml dịch nuôi sinh
khối của hai chủng vi khuẩn........................................................ 114
Hình 4.23 Tỷ lệ kết tụ của dịch sinh khối vi khuẩn và chất kết tụ sinh
học của hai chủng vi khuẩn .......................................................... 115xii
Hình 4.24 Mối quan hệ thuận giữa pH chất thải và số dòng vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học........................................................ 117
Hình 4.25 Ảnh hưởng của các muối kim loại đến hiệu quả kết tụ sinh
học của các chủng vi khuẩn.......................................................... 118
Hình 4.26 Nghiệm thức phối hợp chất trợ lắng với dịch vi khuẩn................ 118
Hình 4.27 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở thể
tích 8 lít......................................................................................... 119
Hình 4.28 Thử nghiệm xử lý nước thải sau hệ thống biogas của trại
chăn nuôi heo................................................................................ 119
Hình 4.29 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo biogas ở thể tích 1
m
3
.................................................................................................. 122
Hình 4.30 Mô hình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
xử lý nước thải sau biogas trại chăn nuôi heo.............................. 124
Hình 4.31 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở thể
tích 40 m3...................................................................................... 124
Hình 4.32 Sơ đồ quy trình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học trong xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ............ 126xiii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ANOVA Analysis Of Variance
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
BOD Biochemical Oxygen Demand
Bp Base pair
BTNMT Bộ Tài Nguyên Môi Trường
BVMT Bảo Vệ Môi Trường
C Carbon
CBI Codon Bias Index
CFU Colony-Forming Unit
COD Chemical Oxygen Demand
CTAB Cetyltrimethylammonium bromide
C/N Carbon/Nitrogen
CV Coefficient of Variation
dATP Deoxyadenosine Triphosphate
dCTP Deoxycytidine Triphosphate
ddNTPs Dideoxynucleotide Triphosphates
dGTP Deoxyguanosine triphosphate
DNA Deoxyribonucleic Acid
dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates
dTTP Deoxythymidine Triphosphate
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EPS Exopolysaccharides
FTIR Fourier Transform Infrared
GDP Gross Domestic Product
HPAM Anionic Polyacrylamide
ITS Internal Transcribed Spacer
LSD Least Significant Difference
MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis
MPN Most probable number
NCBI National Center for Biotechnology Information
NC & PT Nghiên Cứu và Phát Triển
NCS Nghiên Cứu Sinh
Ngđ Ngày đêm
OD Optical Density
PAC Poly Aluminum Chloride
PAM Nonionic Polyacrylamidexiv
PCR Polymerase Chain Reaction
PGA Poly-glutamic Acid
Pi Polymorphism in information
QCVN Quy Chuẩn Việt Nam
rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid
RNA Ribonucleic acid
rRNA Ribosomal ribonucleic acid
SBR Sequencing Batch Reactor
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SEM Scanning Electron Microscope
SNP Single Nucleotide Polymorphism
SS Suspended Solid
TAE Tris-acetate-EDTA
TBE Tris-borate-EDTA
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
TE Tris-EDTA
TN Total Nitrogen
TP Total Phosphorus
TSS Total Suspended Solids
UASB Upflow Anaerobic Sludge Blanket
UV Ultraviolet
VSV Vi Sinh Vật
VK Vi Khuẩn
WHO World Health Organization
XPS X-ray Photoelectron Spectroscopyxv
TÓM TẮT
Đề tài “Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng
dụng xử lý nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở đồng bằng sông Cửu
Long” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường thuộc Viện
nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ và các
phòng thí nghiệm có liên quan từ tháng 10/2010 đến tháng 08/2014.
Mục tiêu luận án là (i) phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học có tỷ lệ kết tụ cao từ nước thải sau biogas
của trại chăn nuôi heo ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long; (ii) đánh giá đa
dạng di truyền các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn; (iii) tiến hành tối ưu hóa điều
kiện tổng hợp chất kết tụ sinh học của 2 dòng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ sinh học
cao nhất, đặc trưng cho từng môi trường phân lập và ứng dụng xử lý nước thải
chăn nuôi heo sau biogas.
Kết quả phân lập được 221 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
trên 2 môi trường chọn lọc có tỷ lệ kết tụ từ 1,21 - 80,28%. Khảo sát 34 dòng
vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học được tuyển chọn, có tỷ lệ kết tụ từ
21,34 - 80,28% cho thấy đa số khuẩn lạc hình tròn, có bề mặt ướt và nhày
nhớt, tế bào vi khuẩn chủ yếu có dạng hình que, chuyển động và thuộc nhóm
Gram dương. Xây dựng cây phả hệ di truyền dựa vào trình tự gen 16S rRNA
bằng phương pháp Maximum-Likelihood, đánh giá đa dạng nucleotide thông
qua chỉ số đa hình trình tự nucleotide (Pi), đa hình chiều dài nucleotide (Theta)
và số Haplotype. Kết quả xác định mối quan hệ di truyền 18 dòng vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học protein, có 14/18 dòng vi khuẩn tương đồng 97-
99% với các chủng thuộc loài Bacillus megaterium; có 3/18 dòng vi khuẩn
tương đồng 98-99% với các chủng thuộc loài Bacillus aryabhattai; dòng vi
khuẩn còn lại tương đồng 100% với chủng thuộc chi Bacillus sp.. Qua khảo
sát 16 dòng vi khuẩn tổng hợp hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide có
11/16 dòng vi khuẩn tương đồng với chi Bacillus; 3/16 dòng vi khuẩn tương
đồng với chi Klebsiella; 2/16 dòng vi khuẩn thuộc chi Sphingobacterium. Xác
định mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn, có 24/34 chủng vi khuẩn
tương đồng 99-100% thuộc loài Bacillus megaterium và loài Bacillus
aryabhattai; 10/34 chủng tương đồng 98-100% thuộc loài Klebsiella
pneumoniae, Bacillus amyloliquefaciens và Sphingobacterium sp. và các chỉ
số đa dạng nucleotide giữa các chủng vi khuẩn này lần lượt là Pi = 0,090,
Theta = 0,156 và Haplotypes = 16. Từ các kết quả trên cho thấy sự đa dạng di
truyền của các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cũng như sự đa
dạng sinh học của vi khuẩn trong tự nhiên. Kết quả tối ưu điều kiện tổng hợpxvi
chất kết tụ sinh học của 2 chủng vi khuẩn đặc trưng cho 2 môi trường phân
lập: (1) Điều kiện tối ưu cho chủng vi khuẩn Bacillus megaterium strain
LA51P: pH môi trường nuôi cấy 5,7, nhiệt độ 29oC và thời gian 124 giờ với
thành phần môi trường tối ưu gồm tinh bột (0,85%), glutamate (6,6%) và
CaCl2 (0,9%) cho tỷ lệ kết tụ 95,78% với dung dịch kaolin ở pH 7, sau 5 phút
để lắng, bổ sung dung dịch MgSO4 (0,1%) và 0,2% dịch nuôi sinh khối vi
khuẩn. Khối lượng chất kết tụ sinh học được ly trích ở môi trường tối ưu là
4,9g/l cho tỷ lệ kết tụ tương đương với dịch vi khuẩn. (2) Điều kiện tối ưu cho
chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai strain KG12S: pH môi trường nuôi cấy
5,9, nhiệt độ 29oC và thời gian 122 giờ với thành phần môi trường tối ưu cho
khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học gồm glucose (1,12%), glutamate
(5,7%), K2HPO4 (0,4%) và KH2PO4 (0,8%) cho tỷ lệ kết tụ 96,87% với dung
dịch kaolin sau 5 phút để lắng, bổ sung dung dịch CaCl2 (0,1%) và 0,2% dịch
nuôi sinh khối vi khuẩn. Chất kết tụ sinh học được ly trích ở môi trường tối ưu
là 4,8g/l và tỷ lệ kết tụ với dung dịch kaolin tương đương với dịch vi khuẩn.
Ứng dụng 2 chủng vi khuẩn trong thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải
sau hệ thống biogas của trại chăn nuôi heo đều cho hiệu quả tốt, ở thể tích 40
m
3
các chỉ tiêu phân tích COD (< 75 mg/l), TSS (< 50 mg/l) và BOD (< 30
mg/l) đạt tiêu chuẩn A theo quy chuẩn QCVN_40/2011/BTNMT.
Từ khóa: Bacillus sp, đa dạng di truyền của vi khuẩn, kết tụ sinh học,
nước thải sau biogas, tỷ lệ kết tụ, vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh họcxvii
ABSTRACT
The thesis “Analysis genetic diversity of bioflocculant-producing
bacteria and its application in piggery wastewater treament after biogas system
in Mekong Delta” was carried out in the laboratory of Biotechnology Research
& Development Institute, Can Tho University and other laboratories, from
January, 2010 to August, 2014.
The objectives were (i) isolating and selecting some high flocculant
activity bacterial strains in piggery wastewater treament after biogas system in
Mekong Delta provinces; (ii) evaluating the genetic diversity among these
strains; (iii) two strains with the highest flocculating activity were chosen to
determinate the optimal conditions for bioflocculant-producing and to apply in
piggery wastewater treament after biogas system.
The results revealed that two hundred and twenty-one bacterial isolates
with flocculant activity (from 1.21% to 80.28%) were isolated on selective
media and thirty-four isolates with high flocculating rate (from 21.34% to
80.28%) were selected from thirteen provinces or cities. The colony
characteristics of these isolates are generally round-shaped, wet and mucous
covered. Cells are mostly short rods, mobile and belong to the Gram-positive
bacteria. Then phylogenetic trees were established based on the 16S rRNA
sequences by the Maximum-Likelihood method. Nucleotide diversity were
evaluated from analyzing the sequence polymorphism (Pi), theta per sequence
(Theta) and number of Haplotypes core were done. Eighteen protein
bioflocculant-producing strains with high flocculating rate were tested, the
result showed that fourteen out of them belonged to Bacillus megaterium with
the identity from 97% to 99%; three isolates were identical with Bacillus
aryabhattai from 98% to 99% and one isolate was 100% of the identity with
Bacillus sp. Moreover, eleven out of sixteen polysaccharide bioflocculantproducing isolates with high flocculating rate were related to Bacillus genus
with 98% to 100% identity; three isolates were related to Klebsiella genus
with 98% to 100% identity; two isolates were 98% to 99% of the identity with
Sphingobacterium genus. Based on the nucleotide sequences of thirty-four
bioflocculant-producing bacterial strains, the genetic relationships among
them were determined, twenty-four strains had from 98% to 100% identity to
Bacillus megaterium and Bacillus aryabhattai; ten strains performed the
identity from 98% to 100% with Klebsiella pneumoniae, Bacillus
amyloliquefaciens and Sphingobacterium. Genetic diversity analysis showed
that nucleotide polymorphism was 0.090, sequence polymorphism per site wasxviii
0.156 and number of haplotypes was 16. These results showed that genetic
diversity of bioflocculant-producing bacteria is as well as the biodiversity of
bacteria in the nature. The optimal conditions for the bioflocculant production
varied between two bacterial strains which were selected from selective
media: (1) Bacillus megaterium strain LA51P reached to 95.78% after 124
hours cultivation with initial pH 5.7, cultivating temperature 29oC and the
optimal medium consisting of starch (0.85%), glutamate (6.8%), CaCl2
(0.75%) with kaolin solution after 5 minutes together with MgSO4
(0.1%) and 0.2% inoculant (bacterial liquid). The maximal
bioflocculant production (4.9 g/l) was obtained in the optimal medium
and the flocculant rate was the same as the broth. (2) Bacillus aryabhattai
strain KG12S reached to 96.87% after 122 hours cultivation at initial pH
5.9, cultivating temperature 29oC and the optimal medium for Bacillus
aryabhattai strain KG12S consisting of glucose (1.12%), glutamate (5.7%),
and K2HPO4 (0.4%) + KH2PO4 (0.8%), with kaolin solution after 5
minutes together with CaCl2 (0.1%) and 0.2% inoculant (bacterial
liquid). The maximal bioflocculant production (4.8 g/l) was obtained in
the optimized medium and the flocculant rate was the same as the broth.
From those above results, two strains that were used to treat piggery
wastewater after biogas system performed a great potential for piggery
wastewater pretreament. For the scale of 40 m3, some parameters reached to A
standard of QCVN_40/2011/BTNMT such as Chemical Oxygen Demand
[COD] (< 75 mg/l); total solid suspension [TSS] (< 50 mg/l) and Biochemical
Oxygen Demand [BOD] (< 30 mg/l).
Keywords: Bacillus sp., bioflocculant-producing bacteria, flocculation,
flocculating rate, genetic diversity of bacteria, piggery wastewater1
Chƣơng 1: GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Ô nhiễm môi trường đang là vấn đề của toàn cầu và ngày càng trở nên
nghiêm trọng do sự phát triển mạnh mẽ của công nghiệp và nông nghiệp bao
gồm trồng trọt và chăn nuôi. Đối với chăn nuôi ở dạng cơ sở hay hộ gia đình
thì các chất thải gây ô nhiễm môi trường có tác động trực tiếp đến cộng đồng,
làm giảm sức sống của vật nuôi từ đó dẫn đến hiệu quả chăn nuôi thấp. Theo
WHO (2005) cần có giải pháp làm môi trường chăn nuôi trở nên trong
sạch hơn, cần kiểm soát và xử lý chất thải nhằm giữ vững an toàn sinh
học và tăng cường sức sống của giống vật nuôi.
Biogas là một trong những hệ thống xử lý chất thải chăn nuôi đặc biệt là
chăn nuôi heo. Biogas gồm một chuỗi các quá trình trong đó vi sinh vật có khả
năng phân hủy sinh học các hợp chất trong điều kiện thiếu oxy. Ở ĐBSCL,
biogas được áp dụng để xử lý nước thải chuồng trại chăn nuôi và tổng hợp khí
sinh học. Tuy nhiên, nước thải sau khi qua hệ thống xử lý biogas thì các chỉ số
COD, BOD, TSS… vẫn còn cao hơn so với mức quy định và có mùi khó chịu
gây ảnh hưởng đến khu vực lân cận (Phùng Đức Tiến, 2009).
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm tìm ra những biện pháp cũng
như những kỹ thuật hữu hiệu để loại bỏ các chất ô nhiễm vô cơ hay hữu cơ
trong nước thải chăn nuôi heo một cách hiệu quả. Trong đó, giải pháp phân lập
những vi sinh vật có khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học để ứng dụng xử lý
nước thải chăn nuôi heo sau biogas là một lựa chọn mới sẽ góp phần ngăn
ngừa ô nhiễm môi trường nước trong khu vực.
Sự kết tụ (flocculation) là một quá trình cần thiết giúp lắng tụ các chất lơ
lửng và làm tăng nhanh quá trình phân hủy chất ô nhiễm. Sự kết tụ trong nước
được chia làm 3 nhóm chính gồm: Kết tụ vô cơ (như sử dụng phèn chua -
aluminium sulphate và cloride aluminium), kết tụ hữu cơ tổng hợp (các dẫn
xuất từ polyacrylamide với polyethyleneimine và các chất kết tụ tự nhiên như
chitosan, sodium alginate) và kết tụ sinh học (bioflocculants). Các hóa chất sử
dụng kết tụ có giá thành thấp nhưng lại ảnh hưởng đến sức khỏe con người và
môi trường sống như nhôm là nguyên nhân gây ra bệnh Alzheimer (Kurane et
al., 1994), còn các dẫn xuất từ polyacrylamide là độc tố cho hệ thần kinh và là
chất gây ung thư khó phân hủy trong tự nhiên (Yokoi et al., 1996). Chất kết tụ
sinh học (bioflocculants) là chất được tạo ra từ vi sinh vật, có tác dụng nhanh
chóng và an toàn cho con người và môi trường (Sheng et al., 2006). Trong
những năm gần đây, nhiều loài vi sinh vật đã được tìm thấy có khả năng tổng
hợp và phóng thích hợp chất kết tụ sinh học ở dạng đa phân tử (flocculating2
biopolymer). Theo Sheng et al. (2006) đất và chất thải là những nguồn tốt nhất
để phân lập các vi sinh vật tổng hợp chất kết tụ sinh học (bioflocculantproducing microorganisms).
Các vi sinh vật tổng hợp chất kết tụ sinh học có bản chất là protein,
polysaccharide và hỗn hợp cả hai loại trên (glycoprotein) được ứng dụng trong
xử lý nước thải. Ngoài ra, chất kết tụ sinh học cũng có thể được tinh sạch và
xác định được thành phần cấu tạo. Từ đó, có tiềm năng để cải thiện chất lượng
sản phẩm trong quá trình chế biến sinh học (bioprocessing).
Vì vậy, với yêu cầu xây dựng một nền nông nghiệp bền vững thì đề tài
“Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng
xử lý nƣớc thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở ĐBSCL” sẽ góp phần
ứng dụng công nghệ sinh học vào thực tế cuộc sống và đẩy mạnh chăn nuôi
theo hướng phát triển bền vững. Tính mới của đề tài thể hiện ở nguồn phân lập
vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng vào xử lý nước thải sau
biogas của trại chăn nuôi heo ở ĐBSCL.
1.2 Mục tiêu đề tài và nội dung nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu đề tài
Mục tiêu chính: Tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có khả năng
tổng hợp chất kết tụ sinh học với tỷ lệ kết tụ cao, đánh giá được mức độ đa
dạng di truyền giữa các dòng vi khuẩn tuyển chọn dựa trên trình tự nucleotide
16S rRNA và đánh giá được hiệu suất xử lý nước thải sau biogas từ chuồng
trại chăn nuôi heo.
Mục tiêu cụ thể: (1) Phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học trong nước thải sau hệ thống biogas của chuồng
trại chăn nuôi heo ở các tỉnh ĐBSCL; (2) Xác định được mối quan hệ di
truyền giữa các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cao dựa trên trình
tự 16S rRNA và xác định được các điều kiện tối ưu cho sự tổng hợp chất kết
tụ sinh học của dòng vi khuẩn được tuyển chọn để ứng dụng xử lý nước thải
sau hệ thống biogas; (3) Đánh giá được hiệu suất xử lý nước thải sau biogas từ
chuồng trại chăn nuôi heo của các chủng vi khuẩn ở điều kiện phòng thí
nghiệm và điều kiện thực tế.
1.2.2 Nội dung nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở ĐBSCL dựa trên hình
dạng khuẩn lạc vi khuẩn.Tuyển chọn các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học có tỷ lệ kết tụ cao ở các tỉnh ĐBSCL, đồng thời nhận diện vi khuẩn
dựa trên sự kết hợp phương pháp sinh hóa và phương pháp sinh học phân tử
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng xử lý nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở đồng bằng sông Cửu Long
Chƣơng 1: Giới thiệu.......................................................................................1
1.1 Tính cấp thiết của đề tài............................................................................1
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu .............................................................2
1.2.1 Mục tiêu đề tài......................................................................................2
1.2.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................2
1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................3
1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận
án.................................................................................................................3
1.5 Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học .......................................................4
Chƣơng 2: Tổng quan tài liệu.........................................................................5
2.1 Tổng quan về chất thải chăn nuôi heo................................................................5
2.1.1 Đặc điểm của nước thải sau biogas chuồng trại chăn nuôi heo ...........5
2.1.2 Quản lý chất thải chăn nuôi heo trên thế giới.......................................5
2.1.3 Quản lý chất thải chăn nuôi heo tại Việt Nam .....................................6
2.2 Xử lý nƣớc thải trong chăn nuôi...............................................................7
2.2.1 Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng nước .................................................7
2.2.2 Biện pháp xử lý nước thải ....................................................................8
2.3 Kết tụ sinh học trong nƣớc........................................................................9
2.3.1 Kết tụ sinh học (Bioflocculant) ............................................................9
2.3.2 Nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học.............................18
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kết tụ của vi khuẩn ....................23
2.3.4 Ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xử lý nước
thải ........................................................................................................29iv
2.3.5 Quy trình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
trong xử lý nước thải ............................................................................31
Chƣơng 3: Phƣơng pháp nghiên cứu..........................................................33
3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu ............................................................................33
3.1.1 Thời gian...............................................................................................33
3.1.2 Địa điểm ...............................................................................................33
3.1.3 Vật liệu .................................................................................................33
3.1.4 Thiết bị..................................................................................................34
3.1.4 Hóa chất................................................................................................34
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ..........................................................................35
3.2.1 Chuẩn bị mẫu........................................................................................35
3.2.2 Phân lập và làm thuần ..........................................................................36
3.2.3 Phân tích và xử lý số liệu .....................................................................38
3.3 Nội dung nghiên cứu..................................................................................38
3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát..................................................................38
3.3.2 Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kế tụ
sinh học.................................................................................................40
3.3.3 Nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học bằng sinh
học phân tử ...........................................................................................41
3.3.4 Phân tích các chỉ số đa dạng di truyền dựa trên trình tự 16S
rRNA.....................................................................................................46
3.3.5 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp chất
kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn được tuyển chọn.....................47
3.3.6 Ly trích chất kết tụ sinh học ................................................................53
3.3.7 Thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải chăn nuôi heo sau
biogas của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học...............................54
3.7.8 Ứng dụng các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
xử lý nước thải sau biogas ...................................................................55
Chƣơng 4: Kết quả và thảo luận .................................................................56
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học… .................56
4.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ..........57
4.2.1 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
protein ...................................................................................................57
4.2.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
polysaccharide ......................................................................................58v
4.3 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học.............................................................................................................59
4.3.1 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học protein ............................................................................................59
4.3.2 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học polysaccharide................................................................................59
4.4 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cao ở các tỉnh đồng
bằng sông Cửu Long ...............................................................................61
4.4.1 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein.........................................61
4.4.2 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide ............................68
4.5 Phân tích đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học..........................................................................................74
4.5.1 Đa dạng về chủng giữa của các loài vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học dựa vào chỉ số Shannon................................................76
4.5.2 Đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học.................................................................................................77
4.6 Xác định các điều kiện tối ƣu cho khả năng tổng hợp chất kết
tụ sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium LA51P
(protein) và chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai KG12S
(polysaccharide) ......................................................................................91
4.6.1 Mối tương quan giữa thời gian nuôi ủ, tỷ lệ kết tụ và mật độ
vi khuẩn ................................................................................................91
4.6.2 Nhiệt độ nuôi ủ .....................................................................................93
4.6.3 Giá trị pH..............................................................................................94
4.6.4 Sự tương tác giữa các điều kiện nuôi sinh khối về thời gian,
pH và nhiệt độ của hai chủng vi khuẩn ................................................97
4.6.5 Nguồn carbon, nguồn nitrogen và khoáng vô cơ .................................101
4.6.6 Xác định ảnh hưởng tương tác của 3 yếu tố dinh dưỡng đến
hiệu quả kết tụ sinh học ........................................................................102
4.6.7 Ion kim loại bổ sung.............................................................................106
4.6.8 Nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung............................................................108
4.6.9 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số vi khuẩn và
tỷ lệ kết tụ của 2 chủng vi khuẩn sau khi tối ưu ...................................109
4.6.10 Kết quả sử dụng các điều kiện tối ưu của hai chủng vi khuẩn
protein ...................................................................................................110vi
4.6.11 Kết quả sử dụng các điều kiện tối ưu của hai chủng vi khuẩn
polysaccharide ......................................................................................111
4.6.12 Đặc điểm sinh hóa 2 chủng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ sinh học
cao được chọn thử nghiệm hiệu suất ứng dụng ....................................112
4.7 Ly trích chất kết tụ sinh học đƣợc tổng hợp từ hai chủng vi
khuẩn Bacillus megaterium LA51P và Bacillus aryabhattai
KG12S và thử nghiệm hiệu quả kết tụ sinh học..................................113
4.7.1 Kết quả ly trích .....................................................................................113
4.7.2 Hiệu suất kết tụ sinh học ......................................................................114
4.8 Thử nghiệm hiệu quả xử lý nƣớc thải sau biogas từ trại chăn
nuôi heo ....................................................................................................115
4.8.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ kết tụ (%) các chủng vi khuẩn
khi thử nghiệm ở nước thải ngoài thực tế.............................................115
4.8.2 Thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau
biogas của các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở
thể tích 10 lít .........................................................................................119
4.8.3 Thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau
biogas của 2 chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở
thể tích 100 lít .......................................................................................121
4.9 Hiệu quả xử lý nƣớc thải chăn nuôi heo sau biogas của vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở thể tích 1 m3 và 40 m3............122
4.9.1 Hiệu suất xử lý ở thể tích 1 m3 .............................................................122
4.9.2 Hiệu suất xử lý ở thể tích 40 m3 ...........................................................122
Chƣơng 5: Kết luận và đề xuất.......................................................................125
5.1 Kết luận.......................................................................................................125
5.2 Đề xuất ........................................................................................................126
Tài liệu tham khảo ...........................................................................................127
Phụ lục ..............................................................................................................145vii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 Chất kết tụ sinh học được tổng hợp từ các chủng vi khuẩn
khác nhau từ năm 2007 – 2013......................................................... 16
Bảng 2.2 Một số môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ
sinh học............................................................................................. 19
Bảng 2.3 Một số cặp mồi sử dụng để nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học................................................................................... 20
Bảng 2.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen đến hiệu quả tổng
hợp chất kết tụ sinh học đến vi khuẩn Klebsiella sp. ....................... 26
Bảng 2.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ đến
hiệu quả tổng hợp chất kết tụ sinh học đến vi khuẩn Serratia
fiacria ............................................................................................... 27
Bảng 2.6 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến sự kết tụ của các vi sinh
vật tổng hợp chất kết tụ sinh học...................................................... 27
Bảng 2.7 Liều lượng của các vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
khác nhau cho tỷ lệ kết tụ (%) ở dung dịch kaolin........................... 29
Bảng 2.8 Ảnh hưởng của liều lượng, nhiệt độ và pH lên khả năng kết
tụ của chất kết tụ M-1....................................................................... 29
Bảng 2.9 Kết quả xử lý nước thải tinh bột bởi các nhân tố kết tụ ................... 30
Bảng 2.10 Hiệu quả xử lý các loại nước thải bởi chất kết tụ sinh học từ
vi khuẩn Serratia ficaria .................................................................. 31
Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu của nước thải tại trại chăn nuôi heo (sau
biogas) ở huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long ................................... 34
Bảng 3.2 Môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học .......... 35
Bảng 3.3 Thành phần cho 1 mẫu DNA thực hiện phản ứng PCR ................... 42
Bảng 3.4 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 1 ........................................................................................... 47
Bảng 3.5 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 2a ......................................................................................... 49
Bảng 3.6 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 2b ......................................................................................... 49
Bảng 3.7 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí
nghiệm 3 ........................................................................................... 50
Bảng 3.8 Nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát sự tương tác 3 yếu tố
thời gian, pH và nhiệt độ ủ đến tỷ lệ kết tụ của hai chủng vi
khuẩn ................................................................................................ 50
Bảng 3.9 Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 yếu
tố nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ ..................................... 51viii
Bảng 3.10 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các tỷ lệ carbon,
nitrogen và khoáng vô cơ ............................................................... 51
Bảng 3.11 Bố trí thí nghiệm thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải ở
điều kiện phòng thí nghiệm............................................................ 54
Bảng 4.1 Số mẫu phân lập và số dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp
chất kết tụ sinh học .......................................................................... 56
Bảng 4.2 Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein có
tỷ lệ kết tụ sinh học cao ở các tỉnh ĐBSCL ..................................... 59
Bảng 4.3 Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide
có tỷ lệ kết tụ sinh học cao ở các tỉnh ĐBSCL................................. 60
Bảng 4.4 Đặc điểm sinh học của 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết
tụ sinh học protein ............................................................................ 62
Bảng 4.5 Kết quả so sánh trình tự 16S rRNA của 18 dòng vi khuẩn với
các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gene ........................................... 64
Bảng 4.6 Kết quả định danh 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học protein ................................................................................ 67
Bảng 4.7 Đặc điểm sinh học của 16 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết
tụ sinh học polysaccharide................................................................ 69
Bảng 4.8 Kết quả so sánh trình tự 16S rRNA của 16 dòng vi khuẩn so
với các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gene ..................................... 71
Bảng 4.9 Kết quả định danh 16 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học polysaccharide.................................................................... 73
Bảng 4.10 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học dựa trên cây phả hệ mối quan hệ di truyền ...................... 75
Bảng 4.11 Chỉ số đa dạng giữa các loài trong quần thể vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học.................................................................. 76
Bảng 4.12 Chỉ số đa dạng giữa các chủng trong quần thể vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học.......................................................... 77
Bảng 4.13 Giá trị Pi và Theta ở 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học........................................................................................... 83
Bảng 4.14 Các giá trị về chỉ số haplotypes của 2 nhóm vi khuẩn ................... 85
Bảng 4.15 Giá trị Pi và Theta ở 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học Bacillus megaterium và Bacillus aryabhattai .................. 87
Bảng 4.16 Các giá trị về chỉ số haplotypes của 2 nhóm vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học Bacillus megaterium và Bacillus
aryabhattai ...................................................................................... 88
Bảng 4.17 Các dạng haplotype của các chủng vi khuẩn Bacillus
megaterium..................................................................................... 88
Bảng 4.18 Các dạng haplotype của các chủng vi khuẩn Bacillus
aryabhattai ..................................................................................... 88ix
Bảng 4.19 Mã di truyền chuỗi nucleotide........................................................ 90
Bảng 4.20 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số tế bào vi
khuẩn và chỉ số OD660 .................................................................... 92
Bảng 4.21 Ảnh hưởng của thời gian, độ pH và nhiệt độ đến tỷ lệ kết tụ
của 2 chủng vi khuẩn...................................................................... 98
Bảng 4.22 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của
yếu tố nhiệt độ, thời gian và pH đến chủng vi khuẩn
Bacillus aryhadtai KG12S............................................................ 100
Bảng 4.23 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ
đến tỷ lệ kết tụ của hai chủng vi khuẩn........................................ 102
Bảng 4.24 Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ tinh bột, glutamate và
CaCl2 đến tỷ lệ kết tụ sinh học ..................................................... 103
Bảng 4.25 Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ glucose, glutamate và
K2HPO4 + KH2PO4 đến tỷ lệ kết tụ sinh học................................ 103
Bảng 4.26 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của 3
nhân tố dinh dưởng của chủng vi khuẩn Bacillus
megaterium LA51P ...................................................................... 105
Bảng 4.27 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của 3
nhân tố dinh dưởng của chủng vi khuẩn Bacillus aryhadtai
KG12S .......................................................................................... 106
Bảng 4.28 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số tế bào của
hai chủng vi khuẩn sau khi tối ưu ................................................ 110
Bảng 4.29 Tỷ lệ kết tụ kaolin của các chủng vi khuẩn có bản chất
protein ở điều kiện tối ưu ............................................................. 111
Bảng 4.30 Tỷ lệ kết tụ kaolin của các chủng vi khuẩn có bản chất
polysaccharide ở điều kiện tối ưu................................................. 112
Bảng 4.31 Đặc điểm sinh hóa 2 chủng vi khuẩn cho tỷ lệ kết tụ sin học
cao ở 2 môi trường phân lập......................................................... 113
Bảng 4.32 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn từ các mẫu chất thải
sau biogas của các trại chăn nuôi heo .......................................... 116
Bảng 4.33 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas của các
chủng vi khuẩn ở thể tích 10 lít.................................................... 120
Bảng 4.34 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hiệu suất xử lý chất thải sau
hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 100 lít....... 121
Bảng 4.35 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hiệu suất xử lý chất thải sau
hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 1 m3 ......... 122
Bảng 4.36 Kết quả phân tích các chỉ tiêu trong nước thải sau hệ thống
biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 40 m3 sau xử lý....... 123x
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Mô hình quản lý chất thải rắn chăn nuôi trên thế giới........................ 6
Hình 2.2 Xử lý nguồn chất thải chăn nuôi ở Việt Nam..................................... 8
Hình 2.3 Công thức cấu tạo kaolin .................................................................. 10
Hình 2.4 Cơ chế kết tụ của chất kết tụ sinh học DYU500............................... 12
Hình 2.5 Cây phả hệ về mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự 16S
rDNA của vi khuẩn 8-37-0-1............................................................ 17
Hình 2.6 Cây phả hệ về mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự 16S
rDNA của vi khuẩn Klebsiella sp..................................................... 17
Hình 2.7 Quy trình phân lập, nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học............................................................................................. 18
Hình 2.8 Đa hình đơn nucleotide (SNPs) và haplotype................................... 21
Hình 2.9 Quy trình ứng dụng chỉ số SNP trong công nghệ sinh học .............. 22
Hình 2.10 Quy trình phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học vào xử lý nước thải ................................. 32
Hình 3.1 Xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏ
giọt.................................................................................................... 37
Hình 3.2 Sơ đồ tổng quát các bước nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất
kết tụ sinh học................................................................................... 39
Hình 3.3 Pha loãng mẫu phân lập (A), tách ròng khuẩn lạc (B) các
dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học.................................... 40
Hình 3.4 Tóm tắt các bước nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học bằng kỹ thuật sinh học phân tử .......................................... 41
Hình 3.5 Chu kỳ gia nhiệt (thực hiện phản ứng PCR)..................................... 43
Hình 3.6 Phương pháp xác định tỷ lệ kết tụ sinh học bằng dung dịch
kaolin ................................................................................................ 48
Hình 4.1 Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh
học .................................................................................................... 57
Hình 4.2 Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
protein............................................................................................... 61
Hình 4.3 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các dòng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học protein ....................................................... 65
Hình 4.4 Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
polysaccharide .................................................................................. 68
Hình 4.5 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các dòng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide........................................... 72
Hình 4.6 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học.................................................................... 78xi
Hình 4.7 Giá trị đa dạng nuleotide (Pi) biến đổi theo trình tự chuỗi
nucleotide ......................................................................................... 79
Hình 4.8 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học protein ....................................................... 81
Hình 4.9 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng
hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide........................................... 82
Hình 4.10 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 18 chủng vi khuẩn tổng hợp Protein............................. 84
Hình 4.11 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 16 chủng vi khuẩn tổng hợp polysaccharide ................ 84
Hình 4.12 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 7 chủng vi khuẩn của loài Bacillus megaterium
strain............................................................................................... 87
Hình 4.13 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi
nucleotide 7 chủng vi khuẩn của loài Bacillus aryabhattai
strain............................................................................................... 87
Hình 4.14 Ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh khối đến hiệu quả kết tụ
sinh học của 2 chủng vi khuẩn ....................................................... 91
Hình 4.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hiệu quả kết tụ sinh
học của hai chủng vi khuẩn ............................................................ 94
Hình 4.16 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi sinh khối đến hiệu quả
kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn .......................................... 95
Hình 4.17 Ảnh hưởng của pH môi trường kaolin đến hiệu quả kết tụ
sinh học của hai chủng vi khuẩn .................................................... 96
Hình 4.18 Đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng mức của tỷ lệ kết
tụ theo thời gian = 120 giờ, pH = X (5 - 7) và nhiệt độ = Y
(30 - 34) .......................................................................................... 99
Hình 4.19 Đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng mức của tỷ lệ kết
tụ ở nhiệt độ = 33oC, Thời gian = X (96 - 144) và pH = Y
(5 - 7) .............................................................................................. 99
Hình 4.20 Ảnh hưởng của các muối kim loại đến hiệu quả kết tụ sinh
học của hai chủng vi khuẩn .......................................................... 107
Hình 4.21 Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung đến khả
năng kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn ............................... 108
Hình 4.22 Khối lượng chất kết tụ ly trích từ 100 ml dịch nuôi sinh
khối của hai chủng vi khuẩn........................................................ 114
Hình 4.23 Tỷ lệ kết tụ của dịch sinh khối vi khuẩn và chất kết tụ sinh
học của hai chủng vi khuẩn .......................................................... 115xii
Hình 4.24 Mối quan hệ thuận giữa pH chất thải và số dòng vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học........................................................ 117
Hình 4.25 Ảnh hưởng của các muối kim loại đến hiệu quả kết tụ sinh
học của các chủng vi khuẩn.......................................................... 118
Hình 4.26 Nghiệm thức phối hợp chất trợ lắng với dịch vi khuẩn................ 118
Hình 4.27 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở thể
tích 8 lít......................................................................................... 119
Hình 4.28 Thử nghiệm xử lý nước thải sau hệ thống biogas của trại
chăn nuôi heo................................................................................ 119
Hình 4.29 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo biogas ở thể tích 1
m
3
.................................................................................................. 122
Hình 4.30 Mô hình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
xử lý nước thải sau biogas trại chăn nuôi heo.............................. 124
Hình 4.31 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở thể
tích 40 m3...................................................................................... 124
Hình 4.32 Sơ đồ quy trình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học trong xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ............ 126xiii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ANOVA Analysis Of Variance
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
BOD Biochemical Oxygen Demand
Bp Base pair
BTNMT Bộ Tài Nguyên Môi Trường
BVMT Bảo Vệ Môi Trường
C Carbon
CBI Codon Bias Index
CFU Colony-Forming Unit
COD Chemical Oxygen Demand
CTAB Cetyltrimethylammonium bromide
C/N Carbon/Nitrogen
CV Coefficient of Variation
dATP Deoxyadenosine Triphosphate
dCTP Deoxycytidine Triphosphate
ddNTPs Dideoxynucleotide Triphosphates
dGTP Deoxyguanosine triphosphate
DNA Deoxyribonucleic Acid
dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates
dTTP Deoxythymidine Triphosphate
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EPS Exopolysaccharides
FTIR Fourier Transform Infrared
GDP Gross Domestic Product
HPAM Anionic Polyacrylamide
ITS Internal Transcribed Spacer
LSD Least Significant Difference
MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis
MPN Most probable number
NCBI National Center for Biotechnology Information
NC & PT Nghiên Cứu và Phát Triển
NCS Nghiên Cứu Sinh
Ngđ Ngày đêm
OD Optical Density
PAC Poly Aluminum Chloride
PAM Nonionic Polyacrylamidexiv
PCR Polymerase Chain Reaction
PGA Poly-glutamic Acid
Pi Polymorphism in information
QCVN Quy Chuẩn Việt Nam
rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid
RNA Ribonucleic acid
rRNA Ribosomal ribonucleic acid
SBR Sequencing Batch Reactor
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SEM Scanning Electron Microscope
SNP Single Nucleotide Polymorphism
SS Suspended Solid
TAE Tris-acetate-EDTA
TBE Tris-borate-EDTA
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
TE Tris-EDTA
TN Total Nitrogen
TP Total Phosphorus
TSS Total Suspended Solids
UASB Upflow Anaerobic Sludge Blanket
UV Ultraviolet
VSV Vi Sinh Vật
VK Vi Khuẩn
WHO World Health Organization
XPS X-ray Photoelectron Spectroscopyxv
TÓM TẮT
Đề tài “Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng
dụng xử lý nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở đồng bằng sông Cửu
Long” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường thuộc Viện
nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ và các
phòng thí nghiệm có liên quan từ tháng 10/2010 đến tháng 08/2014.
Mục tiêu luận án là (i) phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi
khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học có tỷ lệ kết tụ cao từ nước thải sau biogas
của trại chăn nuôi heo ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long; (ii) đánh giá đa
dạng di truyền các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn; (iii) tiến hành tối ưu hóa điều
kiện tổng hợp chất kết tụ sinh học của 2 dòng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ sinh học
cao nhất, đặc trưng cho từng môi trường phân lập và ứng dụng xử lý nước thải
chăn nuôi heo sau biogas.
Kết quả phân lập được 221 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học
trên 2 môi trường chọn lọc có tỷ lệ kết tụ từ 1,21 - 80,28%. Khảo sát 34 dòng
vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học được tuyển chọn, có tỷ lệ kết tụ từ
21,34 - 80,28% cho thấy đa số khuẩn lạc hình tròn, có bề mặt ướt và nhày
nhớt, tế bào vi khuẩn chủ yếu có dạng hình que, chuyển động và thuộc nhóm
Gram dương. Xây dựng cây phả hệ di truyền dựa vào trình tự gen 16S rRNA
bằng phương pháp Maximum-Likelihood, đánh giá đa dạng nucleotide thông
qua chỉ số đa hình trình tự nucleotide (Pi), đa hình chiều dài nucleotide (Theta)
và số Haplotype. Kết quả xác định mối quan hệ di truyền 18 dòng vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học protein, có 14/18 dòng vi khuẩn tương đồng 97-
99% với các chủng thuộc loài Bacillus megaterium; có 3/18 dòng vi khuẩn
tương đồng 98-99% với các chủng thuộc loài Bacillus aryabhattai; dòng vi
khuẩn còn lại tương đồng 100% với chủng thuộc chi Bacillus sp.. Qua khảo
sát 16 dòng vi khuẩn tổng hợp hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide có
11/16 dòng vi khuẩn tương đồng với chi Bacillus; 3/16 dòng vi khuẩn tương
đồng với chi Klebsiella; 2/16 dòng vi khuẩn thuộc chi Sphingobacterium. Xác
định mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn, có 24/34 chủng vi khuẩn
tương đồng 99-100% thuộc loài Bacillus megaterium và loài Bacillus
aryabhattai; 10/34 chủng tương đồng 98-100% thuộc loài Klebsiella
pneumoniae, Bacillus amyloliquefaciens và Sphingobacterium sp. và các chỉ
số đa dạng nucleotide giữa các chủng vi khuẩn này lần lượt là Pi = 0,090,
Theta = 0,156 và Haplotypes = 16. Từ các kết quả trên cho thấy sự đa dạng di
truyền của các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cũng như sự đa
dạng sinh học của vi khuẩn trong tự nhiên. Kết quả tối ưu điều kiện tổng hợpxvi
chất kết tụ sinh học của 2 chủng vi khuẩn đặc trưng cho 2 môi trường phân
lập: (1) Điều kiện tối ưu cho chủng vi khuẩn Bacillus megaterium strain
LA51P: pH môi trường nuôi cấy 5,7, nhiệt độ 29oC và thời gian 124 giờ với
thành phần môi trường tối ưu gồm tinh bột (0,85%), glutamate (6,6%) và
CaCl2 (0,9%) cho tỷ lệ kết tụ 95,78% với dung dịch kaolin ở pH 7, sau 5 phút
để lắng, bổ sung dung dịch MgSO4 (0,1%) và 0,2% dịch nuôi sinh khối vi
khuẩn. Khối lượng chất kết tụ sinh học được ly trích ở môi trường tối ưu là
4,9g/l cho tỷ lệ kết tụ tương đương với dịch vi khuẩn. (2) Điều kiện tối ưu cho
chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai strain KG12S: pH môi trường nuôi cấy
5,9, nhiệt độ 29oC và thời gian 122 giờ với thành phần môi trường tối ưu cho
khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học gồm glucose (1,12%), glutamate
(5,7%), K2HPO4 (0,4%) và KH2PO4 (0,8%) cho tỷ lệ kết tụ 96,87% với dung
dịch kaolin sau 5 phút để lắng, bổ sung dung dịch CaCl2 (0,1%) và 0,2% dịch
nuôi sinh khối vi khuẩn. Chất kết tụ sinh học được ly trích ở môi trường tối ưu
là 4,8g/l và tỷ lệ kết tụ với dung dịch kaolin tương đương với dịch vi khuẩn.
Ứng dụng 2 chủng vi khuẩn trong thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải
sau hệ thống biogas của trại chăn nuôi heo đều cho hiệu quả tốt, ở thể tích 40
m
3
các chỉ tiêu phân tích COD (< 75 mg/l), TSS (< 50 mg/l) và BOD (< 30
mg/l) đạt tiêu chuẩn A theo quy chuẩn QCVN_40/2011/BTNMT.
Từ khóa: Bacillus sp, đa dạng di truyền của vi khuẩn, kết tụ sinh học,
nước thải sau biogas, tỷ lệ kết tụ, vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh họcxvii
ABSTRACT
The thesis “Analysis genetic diversity of bioflocculant-producing
bacteria and its application in piggery wastewater treament after biogas system
in Mekong Delta” was carried out in the laboratory of Biotechnology Research
& Development Institute, Can Tho University and other laboratories, from
January, 2010 to August, 2014.
The objectives were (i) isolating and selecting some high flocculant
activity bacterial strains in piggery wastewater treament after biogas system in
Mekong Delta provinces; (ii) evaluating the genetic diversity among these
strains; (iii) two strains with the highest flocculating activity were chosen to
determinate the optimal conditions for bioflocculant-producing and to apply in
piggery wastewater treament after biogas system.
The results revealed that two hundred and twenty-one bacterial isolates
with flocculant activity (from 1.21% to 80.28%) were isolated on selective
media and thirty-four isolates with high flocculating rate (from 21.34% to
80.28%) were selected from thirteen provinces or cities. The colony
characteristics of these isolates are generally round-shaped, wet and mucous
covered. Cells are mostly short rods, mobile and belong to the Gram-positive
bacteria. Then phylogenetic trees were established based on the 16S rRNA
sequences by the Maximum-Likelihood method. Nucleotide diversity were
evaluated from analyzing the sequence polymorphism (Pi), theta per sequence
(Theta) and number of Haplotypes core were done. Eighteen protein
bioflocculant-producing strains with high flocculating rate were tested, the
result showed that fourteen out of them belonged to Bacillus megaterium with
the identity from 97% to 99%; three isolates were identical with Bacillus
aryabhattai from 98% to 99% and one isolate was 100% of the identity with
Bacillus sp. Moreover, eleven out of sixteen polysaccharide bioflocculantproducing isolates with high flocculating rate were related to Bacillus genus
with 98% to 100% identity; three isolates were related to Klebsiella genus
with 98% to 100% identity; two isolates were 98% to 99% of the identity with
Sphingobacterium genus. Based on the nucleotide sequences of thirty-four
bioflocculant-producing bacterial strains, the genetic relationships among
them were determined, twenty-four strains had from 98% to 100% identity to
Bacillus megaterium and Bacillus aryabhattai; ten strains performed the
identity from 98% to 100% with Klebsiella pneumoniae, Bacillus
amyloliquefaciens and Sphingobacterium. Genetic diversity analysis showed
that nucleotide polymorphism was 0.090, sequence polymorphism per site wasxviii
0.156 and number of haplotypes was 16. These results showed that genetic
diversity of bioflocculant-producing bacteria is as well as the biodiversity of
bacteria in the nature. The optimal conditions for the bioflocculant production
varied between two bacterial strains which were selected from selective
media: (1) Bacillus megaterium strain LA51P reached to 95.78% after 124
hours cultivation with initial pH 5.7, cultivating temperature 29oC and the
optimal medium consisting of starch (0.85%), glutamate (6.8%), CaCl2
(0.75%) with kaolin solution after 5 minutes together with MgSO4
(0.1%) and 0.2% inoculant (bacterial liquid). The maximal
bioflocculant production (4.9 g/l) was obtained in the optimal medium
and the flocculant rate was the same as the broth. (2) Bacillus aryabhattai
strain KG12S reached to 96.87% after 122 hours cultivation at initial pH
5.9, cultivating temperature 29oC and the optimal medium for Bacillus
aryabhattai strain KG12S consisting of glucose (1.12%), glutamate (5.7%),
and K2HPO4 (0.4%) + KH2PO4 (0.8%), with kaolin solution after 5
minutes together with CaCl2 (0.1%) and 0.2% inoculant (bacterial
liquid). The maximal bioflocculant production (4.8 g/l) was obtained in
the optimized medium and the flocculant rate was the same as the broth.
From those above results, two strains that were used to treat piggery
wastewater after biogas system performed a great potential for piggery
wastewater pretreament. For the scale of 40 m3, some parameters reached to A
standard of QCVN_40/2011/BTNMT such as Chemical Oxygen Demand
[COD] (< 75 mg/l); total solid suspension [TSS] (< 50 mg/l) and Biochemical
Oxygen Demand [BOD] (< 30 mg/l).
Keywords: Bacillus sp., bioflocculant-producing bacteria, flocculation,
flocculating rate, genetic diversity of bacteria, piggery wastewater1
Chƣơng 1: GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Ô nhiễm môi trường đang là vấn đề của toàn cầu và ngày càng trở nên
nghiêm trọng do sự phát triển mạnh mẽ của công nghiệp và nông nghiệp bao
gồm trồng trọt và chăn nuôi. Đối với chăn nuôi ở dạng cơ sở hay hộ gia đình
thì các chất thải gây ô nhiễm môi trường có tác động trực tiếp đến cộng đồng,
làm giảm sức sống của vật nuôi từ đó dẫn đến hiệu quả chăn nuôi thấp. Theo
WHO (2005) cần có giải pháp làm môi trường chăn nuôi trở nên trong
sạch hơn, cần kiểm soát và xử lý chất thải nhằm giữ vững an toàn sinh
học và tăng cường sức sống của giống vật nuôi.
Biogas là một trong những hệ thống xử lý chất thải chăn nuôi đặc biệt là
chăn nuôi heo. Biogas gồm một chuỗi các quá trình trong đó vi sinh vật có khả
năng phân hủy sinh học các hợp chất trong điều kiện thiếu oxy. Ở ĐBSCL,
biogas được áp dụng để xử lý nước thải chuồng trại chăn nuôi và tổng hợp khí
sinh học. Tuy nhiên, nước thải sau khi qua hệ thống xử lý biogas thì các chỉ số
COD, BOD, TSS… vẫn còn cao hơn so với mức quy định và có mùi khó chịu
gây ảnh hưởng đến khu vực lân cận (Phùng Đức Tiến, 2009).
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm tìm ra những biện pháp cũng
như những kỹ thuật hữu hiệu để loại bỏ các chất ô nhiễm vô cơ hay hữu cơ
trong nước thải chăn nuôi heo một cách hiệu quả. Trong đó, giải pháp phân lập
những vi sinh vật có khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học để ứng dụng xử lý
nước thải chăn nuôi heo sau biogas là một lựa chọn mới sẽ góp phần ngăn
ngừa ô nhiễm môi trường nước trong khu vực.
Sự kết tụ (flocculation) là một quá trình cần thiết giúp lắng tụ các chất lơ
lửng và làm tăng nhanh quá trình phân hủy chất ô nhiễm. Sự kết tụ trong nước
được chia làm 3 nhóm chính gồm: Kết tụ vô cơ (như sử dụng phèn chua -
aluminium sulphate và cloride aluminium), kết tụ hữu cơ tổng hợp (các dẫn
xuất từ polyacrylamide với polyethyleneimine và các chất kết tụ tự nhiên như
chitosan, sodium alginate) và kết tụ sinh học (bioflocculants). Các hóa chất sử
dụng kết tụ có giá thành thấp nhưng lại ảnh hưởng đến sức khỏe con người và
môi trường sống như nhôm là nguyên nhân gây ra bệnh Alzheimer (Kurane et
al., 1994), còn các dẫn xuất từ polyacrylamide là độc tố cho hệ thần kinh và là
chất gây ung thư khó phân hủy trong tự nhiên (Yokoi et al., 1996). Chất kết tụ
sinh học (bioflocculants) là chất được tạo ra từ vi sinh vật, có tác dụng nhanh
chóng và an toàn cho con người và môi trường (Sheng et al., 2006). Trong
những năm gần đây, nhiều loài vi sinh vật đã được tìm thấy có khả năng tổng
hợp và phóng thích hợp chất kết tụ sinh học ở dạng đa phân tử (flocculating2
biopolymer). Theo Sheng et al. (2006) đất và chất thải là những nguồn tốt nhất
để phân lập các vi sinh vật tổng hợp chất kết tụ sinh học (bioflocculantproducing microorganisms).
Các vi sinh vật tổng hợp chất kết tụ sinh học có bản chất là protein,
polysaccharide và hỗn hợp cả hai loại trên (glycoprotein) được ứng dụng trong
xử lý nước thải. Ngoài ra, chất kết tụ sinh học cũng có thể được tinh sạch và
xác định được thành phần cấu tạo. Từ đó, có tiềm năng để cải thiện chất lượng
sản phẩm trong quá trình chế biến sinh học (bioprocessing).
Vì vậy, với yêu cầu xây dựng một nền nông nghiệp bền vững thì đề tài
“Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng
xử lý nƣớc thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở ĐBSCL” sẽ góp phần
ứng dụng công nghệ sinh học vào thực tế cuộc sống và đẩy mạnh chăn nuôi
theo hướng phát triển bền vững. Tính mới của đề tài thể hiện ở nguồn phân lập
vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng vào xử lý nước thải sau
biogas của trại chăn nuôi heo ở ĐBSCL.
1.2 Mục tiêu đề tài và nội dung nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu đề tài
Mục tiêu chính: Tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có khả năng
tổng hợp chất kết tụ sinh học với tỷ lệ kết tụ cao, đánh giá được mức độ đa
dạng di truyền giữa các dòng vi khuẩn tuyển chọn dựa trên trình tự nucleotide
16S rRNA và đánh giá được hiệu suất xử lý nước thải sau biogas từ chuồng
trại chăn nuôi heo.
Mục tiêu cụ thể: (1) Phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn
tổng hợp chất kết tụ sinh học trong nước thải sau hệ thống biogas của chuồng
trại chăn nuôi heo ở các tỉnh ĐBSCL; (2) Xác định được mối quan hệ di
truyền giữa các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cao dựa trên trình
tự 16S rRNA và xác định được các điều kiện tối ưu cho sự tổng hợp chất kết
tụ sinh học của dòng vi khuẩn được tuyển chọn để ứng dụng xử lý nước thải
sau hệ thống biogas; (3) Đánh giá được hiệu suất xử lý nước thải sau biogas từ
chuồng trại chăn nuôi heo của các chủng vi khuẩn ở điều kiện phòng thí
nghiệm và điều kiện thực tế.
1.2.2 Nội dung nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở ĐBSCL dựa trên hình
dạng khuẩn lạc vi khuẩn.Tuyển chọn các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ
sinh học có tỷ lệ kết tụ cao ở các tỉnh ĐBSCL, đồng thời nhận diện vi khuẩn
dựa trên sự kết hợp phương pháp sinh hóa và phương pháp sinh học phân tử
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links