Download Luận văn Xây dựng qui trình phát hiện escherichia coli trong thực phẩm bằng phương pháp PCR (polymerase chain reaction) và thử nghiệm ứng dụng
ĐẶT VẤN ĐỀ
Vấn đề vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong những chương trình phát triển của các quốc gia. Trong những năm gần đây, tình hình ngộ độc thực phẩm có xu hướng gia tăng cả về số lượng lẫn qui mô tác hại ở nhiều nước. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), có đến hơn 50% các vụ ngộ độc thực phẩm là do tác nhân vi sinh vật gây ra [20].
Hiện nay, xuất khẩu thực phẩm đang chiếm tỷ trọng quan trọng trong kinh tế xuất khẩu của nước ta. Sự hội nhập kinh tế theo xu hướng toàn cầu hóa có tác động rất lớn đến các tiêu chuẩn về chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm. Việc đẩy mạnh xây dựng qui trình, cải tiến các trang thiết bị được xem là giải pháp đóng vai trò quyết định, giúp nâng cao năng lực kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm. Về mặt này việc kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm như E. coli, Samonella, Shigella, Virio... có vai trò rất quan trọng.
E. coli được xem là vi sinh vật chỉ thị nhiễm khuẩn thực phẩm, là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội có thể gây viêm ruột và tiêu chảy ở trẻ nhỏ, tiêu chảy hội chứng lỵ hay tiêu chảy hội chứng tả. Ngoài ra, E. coli còn gây bệnh viêm đường niệu, viêm khuẩn bàng quang, thận, tuyến tiền liệt, ống dẫn trứng... Qui trình kiểm tra E. coli gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp truyền thống thường chậm, tốn thời gian (kéo dài 3 - 4 ngày) và độ nhạy thấp. Trong khi đó các phương pháp chẩn đoán phân tử dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử như lai phân tử, PCR... có khả năng khắc phục được các nhược điểm này, đang được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới.
Từ bối cảnh nêu trên, thực tiễn sản xuất ở nước ta đã đặt ra yêu cầu cần có phương pháp phát hiện nhanh E. coli gây bệnh trong thực phẩm, thay thế các phương pháp truyền thống, cho phép giám sát tính an toàn và giảm tối đa nguy cơ gây bệnh từ nhóm vi khuẩn này trong thực phẩm.
Do vậy, mục tiêu của đề tài luận văn này là thiết lập qui trình phát hiện E. coli trong thực phẩm bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) để thay thế các phương pháp truyền thống.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
PHẦN I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM VÀ VI SINH VẬT GÂY BỆNH QUA THỰC PHẨM
1.1. Một số khái niệm liên quan
Trong lĩnh vực thực phẩm hiện nay, có hai khái niệm đang được sử dụng rộng rãi là vệ sinh thực phẩm và an toàn thực phẩm và một số khái niệm quan trọng khác cần được phân biệt.
- Vệ sinh thực phẩm (food hygiene) [7,9] : là khái niệm để biểu thị thực phẩm không chứa vi sinh vật gây bệnh và không chứa độc tố. Khái niệm này cũng bao hàm tình trạng vệ sinh trong khi vận chuyển, chế biến và bảo quản thực phẩm.
- An toàn thực phẩm (food safety) [7, 9]: là khả năng không gây ngộ độc của thực phẩm đối với con người bởi vi sinh vật hay bởi hóa chất, các yếu tố vật lý. Theo nghĩa rộng, khái niệm này còn được hiểu là khả năng cung cấp đầy đủ và kịp thời về số lượng và chất lượng thực phẩm khi một quốc gia gặp thiên tai hay một lý do nào đó. Mục đích của an toàn thực phẩm là việc bảo đảm được thực phẩm không bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh, không chứa độc tố sinh học, độc tố hoá học và các yếu tố khác có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng trong các quá trình sản xuất, vận chuyển, chế biến và bảo quản thực phẩm.
- Ngộ độc thực phẩm [6,17]: dùng để chỉ tất cả các bệnh gây ra bởi các mầm bệnh có trong thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm được chia thành 2 nhóm:
+ Ngộ độc do chất độc của vi sinh vật tạo ra trong nguyên liệu hay hóa chất từ quá trình chăn nuôi, trồng trọt bảo quản, chế biến... Các độc chất này đã có trong thực phẩm trước khi được tiêu thụ.
+ Ngộ độc do nhiễm trùng: là trường hợp vi khuẩn gây bệnh theo thực phẩm vào cơ thể bằng đường tiêu hóa và tác động tới cơ thể do sự hiện diện của bản thân vi khuẩn hay do độc tố của vi khuẩn .
- Độc tố [7, 8]: là các hợp chất hóa học có trong nguyên liệu, sản phẩm thực phẩm ở một hàm lượng có thể gây ngộ độc khi được tiêu thụ bởi người hay động vật. Độc tố có thể tồn
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
tại ở nhiều trạng thái khác nhau và được tạo ra trong thực phẩm bằng nhiều con đường khác nhau. Độc tố có nguồn gốc từ vi sinh vật được tạo ra bằng 2 con đường cơ bản sau:
+ Tế bào vi sinh chứa thành phần có độc tính. Vi sinh vật tăng trưởng thành mật độ cao trong thực phẩm, khi tế bào bị chết đi, độc tố được phóng thích vào thực phẩm. Loại độc tố này được gọi là nội độc tố (endotoxin).
+ Tế bào vi sinh tổng hợp các protein có độc tính được tiết ra ngoài tế bào. Loại độc tố này được gọi là ngoại độc tố (exotoxin).
Nội độc tố và ngoại độc tố khác nhau nhiều về bản chất hóa học, các đặc tính hóa học và cách hoạt động. Bảng 1 so sánh một số đặc trưng của hai loại độc tố này.
Bảng 1. So sánh một số đặc điểm của ngoại độc tố và nội độc tố của vi khuẩn [7, 26]
Ngoại độc tố (exotoxin) Nội độc tố (endotoxin)
1.2. Những vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm thường gặp
- Coliform [10]: Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm các vi sinh vật dùng để chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Nhóm coliform gồm những vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý, Gram âm, không sinh bào tử, hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi trường nuôi cấy lỏng. Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, nhóm này lại được chia thành 2 nhóm nhỏ là coliform và coliform phân có nguồn gốc từ phân của các loài động vật. Coliform phân có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng bao gồm các giống Escherichia, Klebsiella và Enterobacter. Trong các thành viên của
- Do vi khuẩn còn sống tiết ra
- Có ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm
- Bản chất là protein
- Không bền với nhiệt
- Độc lực cao
- Triệu chứng bệnh đặc hiệu, không gây sốt
- Do vi khuẩn chết phóng thích
- Có ở vi khuẩn Gram âm, ít ở vi khuẩn Gram dương
- Bản chất là lipopolysaccharide
- Tương đối bền với nhiệt
- Tương đối ít độc
- Triệu chứng bệnh không đặc hiệu, hay gây sốt, choáng.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
nhóm coliform phân thì E. coli là loài được sự quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm.
- Escherichia coli [1,10]: vi khuẩn hiện diện trong ruột người và động vật, được thải ra ngoài thiên nhiên theo đường phân nên thường gặp trong đất và nước. Năm 1971 E. coli được xếp vào nhóm các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và là một vi sinh vật chỉ thị nhiễm khuẩn thực phẩm. Loài này là trực khuẩn Gram âm mang đầy đủ tính chất cơ bản của vi khuẩn đường ruột. Khả năng gây bệnh của E. coli rất đa dạng và tùy thuộc vào vị trí xâm nhập. Đối với nhiễm khuẩn ngoài đường ruột, E. coli gây nhiều bệnh khác nhau với các triệu chứng không đặc trưng và được xem là những vi khuẩn gây bệnh cơ hội (như viêm đường niệu, viêm nhiễm bàng quang, thận, tuyến tiền liệt, ống dẫn trứng hay nhiễm trùng máu). Ngoài ra E. coli còn có thể gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh. Đối với nhiễm khuẩn đường ruột, E. coli gây các bệnh viêm ruột, tiêu chảy ở trẻ nhỏ, tiêu chảy hội chứng lỵ hay tiêu chảy hội chứng tả.
- Salmonella [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, di động bằng chu mao. Vi khuẩn này chịu nhiệt kém nhưng chịu được một số hóa chất như brilliant green, sodium lauryl sulfate, selenite, tetrathionate. Người ta đã phân lập được 2324 chủng Salmonella khác nhau. Ngoài nội độc tố Salmonella có thể tạo ra hai loại ngoại độc tố là độc tố ruột (enterotoxin) và độc tố tế bào (cytotoxin). Dựa vào cấu trúc kháng nguyên O và H, người ta chia Salmonella gây bệnh ra thành 3 nhóm: nhóm chỉ gây bệnh cho người, nhóm gây bệnh cho động vật và nhóm gây bệnh cho người và động vật. Ở người Salmonella có thể gây sốt thương hàn (do S. typhi hay S. typhi A, B,C), nhiễm trùng máu (S. cholera-suis), rối loạn tiêu hoá (S. typhimurinum, S. enteritidis). Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể bằng đường miệng qua thức ăn. Vào ruột non, vi khuẩn tăng trưởng xâm nhập vào máu và các cơ quan khác gây viêm . Ngộ độc thực phẩm do nội độc tố của Salmonella gây ra các triệu chứng như nôn mữa, đau đầu, ớn lạnh, tiêu chảy. Sốt xuất hiện vào 12 – 24 giờ sau khi ăn thức ăn có chứa 1 – 10 triệu tế bào Salmonella/g thức ăn. Bệnh kéo dài 2 – 3 ngày, phần lớn bệnh nhân tự phục hồi nhưng cũng có trường hợp tử vong, đặc biệt là người già, trẻ sơ sinh và người suy yếu hệ miễn dịch.
- Shigella [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, không di động, không sinh bào tử, kỵ khí tùy ý,
tăng trưởng ở nhiệt độ từ 10 – 40C, pH 6 – 8, có kháng nguyên O, một số có kháng nguyên K,
không có kháng nguyên H. Shigella gồm có 4 loài: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boyalia, S. Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
sonnei. Trong đó S. dysenteriae type 1 tạo độc tố thần kinh có độc lực rất cao, đã từng gây những dịch lớn. Tỉ lệ tử vong của bệnh do Shigella cao hơn bệnh do Salmonella. Nhiễm khuẩn Shigella chỉ giới hạn ở đường tiêu hóa chỉ cần 10 – 100 tế bào cũng đủ gây bệnh. Vi khuẩn này tạo hai dạng độc tố. Nội độc tố lipopolysaccharide có ở thành tế bào vi khuẩn gây kích thích thành ruột. Ngoại độc tố vừa tác động lên ruột vừa tác động lên hệ thần kinh trung ương gây các triệu chứng tiêu chảy, ức chế hấp thu đường, axit amin ở ruột non, nếu tác động lên hệ thần kinh có thể gây tử vong. Vi khuẩn sẽ tấn công niêm mạc ruột già tạo vết loét rồi hoại tử. Khi ruột già bị tổn thương gây đau bụng quặn dữ dội, đi tiêu nhiều lần, phân nhầy nhớt và có máu được gọi là hội chứng lỵ Shigella.
- Vibrio [6,10]: là phẩy khuẩn, Gram âm, di động nhờ tiên mao ở một đầu, hiếu khí hay yếm khí không bắt buộc. Vibrio thường gặp trong thực phẩm, nhất là trong hải sản, gồm khoảng 28 loài, trong đo có 4 loài gây bệnh là V. parahaemolyticus, V. cholerae,V. vulnificus và V. alginolyticus.
+ V. cholerae là loài vi khuẩn phổ biến trong thiên nhiên gây dịch tả ở người sử dụng nước bẩn và thực phẩm bị nhiễm. Bệnh tả xuất hiện khi V. cholerae xâm nhập vào đường tiêu hóa, qua được hàng rào axit của dịch vị, kết dính vào màng nhầy biểu mô của ruột và tiết ra độc tố ruột. Độc tố ruột V. cholerae là một protein không bền nhiệt, cấu tạo bởi đơn vị A và B. Phần B giúp độc tố gắn vào thụ thể trên bề mặt tế bào ruột là GM1. Tiểu đơn vị A vào ruột tăng hoạt động của adenylcylase khiến tế bào sản xuất cAMP quá nhiều làm tăng tiết ồ ạt nước và chất điện giải từ tế bào thượng bì vào lông ruột gây tiêu chảy. Virio còn có thể tạo hemolysin (chủng Eltor), mucinase làm tróc niêm mạc thượng bì ruột, neuramirdase làm tăng thụ thể tiếp nhận độc tố.
+ V. parahaemolyticus đa số gây độc trong thức ăn làm viêm ruột.
+ V. vulnificus hiện diện rộng rãi ở nước biển, hải sản, có khả năng tổng hợp độc tố cytotoxin, hemolysin, cytolysin. Tỉ lệ tử vong bởi độc tố của vibrio thường rất cao.
+ V. alginolyticus ít gặp và được phát hiện gây bệnh lần đầu tiên vào năm 1971. Vi khuẩn này có khả năng tạo độc tố ruột. Khi vào cơ thể, chúng phát triển rất nhanh trong máu và gây bệnh.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
- Yersinia [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, không tạo bào tử, tạo độc tố ruột chịu nhiệt. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua da (vết bọ chét cắn), niêm mạc (kết mạc, niêm mạc hầu trong, đường hô hấp). Khi vào cơ thể Yersinia sinh sản rất nhanh, biểu hiện lâm sàng là các hạch trên cơ thể. Vi khuẩn đi vào máu và xâm nhập vào các phủ tạng gây xuất huyết. Thời gian ủ bệnh là 2 – 7 ngày. Sau đó có thể sốt cao và đột ngột, hạch to dần gây đau đớn. Trường hợp nhiễm độc thần kinh, người bệnh cảm giác bứt rứt, lo âu. Trường hợp nhiễm trùng máu sớm có thể kèm theo nôn mữa, tiêu chảy, nếu nhiễm muộn thì đông máu nội hạch, hạ huyết áp, người trở nên lừ đừ, suy thận, suy tim.
- Proteus [8,10]: là vi khuẩn có trong tự nhiên, trong đường tiêu hóa của người và động vật. Thực phẩm bị nhiễm Proteus chủ yếu từ nguồn nước hay từ công cụ vật liệu chế biến thực phẩm không được xử lý tốt. Proteus chỉ gây độc khi lượng tế bào trong cơ thể đủ lớn. Độc tố chỉ đóng vai trò phụ trợ để làm tăng khả năng thẩm thấu của niêm mạc ruột, giúp vi khuẩn xâm nhập vào máu nhanh và nhiều hơn. Thời gian ủ bệnh tương đối ngắn (khoảng 3 giờ, đôi khi kéo dài 16 giờ). Khi bị nhiễm khuẩn, người bệnh bị nôn mữa, tiêu chảy cấp, viêm dạ dày, ruột. Nhiệt độ cơ thể tăng. Bệnh xuất hiện rất nhanh nhưng cũng khỏi nhanh. Cơ thể sẽ phục hồi sau 1 – 3 ngày và không gây tử vong.
- Staphylococcus [6,10]: là cầu khuẩn Gram dương, tế bào bình thường liên kết với nhau hình thành chùm, thường sống ở da người, đường hô hấp, đường tiêu hoá, quần áo , đồ vật... Staphylococcus tạo 9 loại độc tố chịu nhiệt (A, B, C1, C2, C3, D, E, G, H) và các enzyme có khả năng hỗ trợ cho độc tố gây độc ở người. Nếu bị ngộ độc chỉ sau 1- 8 giờ người bệnh sẽ buồn nôn, ói mữa, tiêu chảy dữ dội, không sốt và phục hồi. Lượng độc tố có thể gây ngộ độc cho người là 2mg.
- Clotridium [6,10]: là những trực khuẩn Gram âm, yếm khí, tạo bào tử, nhiệt độ phát triển tối ưu 43 – 47C. Hai chủng gây ngộ độc thực phẩm là:
+ C. botulium lần đầu tiên được ghi nhận gây ngộ độc vào năm 1973 và có 6 người chết do nhiễm độc. C. botulium có khả năng tạo độc tố thần kinh và rất nhiều độc tố khác nhau (A, B, F, G, G2, D và G). Độc tố thường có độc lực rất cao.
+ C. perfringens phát triển ở nhiệt độ từ 12 - 50C, bị ức chế ở nồng độ muối NaCl 6%.
Phần lớn trường hợp ngộ độc thực phẩm do C. perfringens khi mật độ tế bào trên 106 tế bào/gam Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
thực phẩm. Thời gian ủ bệnh là 8 – 24 giờ. Triệu chứng là đau bụng, tiêu chảy, sốt, buồn nôn. Độc tố của C. perfringens bị bất hoạt ở 60C trong 10 phút.
- Listeria [6,10]: loài gây bệnh chủ yếu là L. monocytogenes, là vi khuẩn ưa lạnh, có thể phát triển ở nhiệt độ 2,5 - 44C, thường hiện diện trong trong sữa, thịt, cá, rau và cả nước bề mặt. Triệu chứng bệnh là tiêu chảy, sốt nhẹ. Trường hợp nặng, chủng gây bệnh có thể sinh sản trong các đại thực bào gây nhiễm trùng máu, tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và có thể xâm nhập vào bào thai trong bụng mẹ gây sẩy thai , đẻ non hay nhiễm trùng thai nhi.
Ngoài các vi khuẩn thường gặp kể trên còn có nhiều vi khuẩn khác có vai trò nhất định trong việc gây bệnh cho người từ thực phẩm như Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Corynebacterium, Aeromonas hydrophila...
- Virus [6,10]: là nhóm vi sinh vật gây bệnh có kích thước nhỏ nhất, thay đổi từ 5- 20nm. Virus gây bệnh ở thực phẩm ít được nghiên cứu do khó nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy thông thường. Có rất nhiều vụ dịch hay ca bệnh từ thực phẩm do virus gây ra nhưng trong nhiều trường hợp người ta không phát hiện được nguồn gốc gây bệnh. Thực phẩm đóng vai trò môi trường lan truyền mầm bệnh. Một số virus trong thực phẩm gây bệnh ở người đã biết là virus Fadeno serotype 40 và 41 gây loét dạ dày (họ Adenoviridae, chứa DNA, kích thước 100 nm), virus Hepatitis E gây bệnh gan (họ Calciviridae, chứa RNA, kích thước 34 nm), virus Pravo gây đau bao tử ( họ Pravoviridae, chứa DNA, kích thước 22nm), virus Popilo type 1 – 3 và Echo type 1 – 65 gây viêm phổi (họ Picornarividae, chứa RNA, kích thước 28nm)...
- Nấm mốc tạo độc tố [7,20]: một số loài có khả năng tạo độc tố gây ngộ độc hay ung thư ở người và động vật. Trong thực phẩm, một số loài có khả năng tạo ra các độc tố, thường gặp và nguy hiểm nhất là aflatoxin do Aspergillus flavus và A. parasiticus tạo ra. Mức độ ngộ độc bởi nấm mốc là khác nhau, biểu hiện như nhiễm độc nhẹ (gây nôn mữa, tiêu chảy), tổn thương ở gan, thận, túi mật và ống mật. Một số độc tố còn gây u tuyến hay u gan, gây thoái hóa tế bào nhu mô gan, xơ hóa. Citrinin của Penicilium citrinum và P. viridicatum có thể gây các bệnh tăng urea huyết, albumin niệu, viêm tiểu cầu thận. Một số độc tố của nấm mốc như tetronic acid, terestic acid, viridicatic acid... tác động vào tim gây độc đối với chức năng của tim. Độc tố của Stachybotrys ata, Fusarium tricinctum, Dendrodocium toxicum, Aspergillus ochraceus... tác động
vào máu và hệ tuần hoàn gây hội chứng chảy máu.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
- Tảo sinh độc tố [7]: các tảo này làm ô nhiễm nguồn nước, thủy sản, gây ngộ độc cho động vật hoang dã, gia súc, gia cầm và con người. Các loài tảo độc có thể chia ra thành 3 nhóm:
+ Tảo Dinoflabellates: có mặt trong hơn 75% trường hợp thủy triều đỏ nhưng chỉ có 9,5% có độc tính nói chung và 1,5% gây độc cho người. Thường gặp là các giống Gymmodinium, Pyrodinium, Dinophysic, Alexandrium, Gonyaulas...
+ Tảo silic: thường sinh ra domoic, là một axit amin gây độc cho hệ thần kinh trong cơ thể.
+ Tảo lam: có nhiều loại, tạo nhiều loại độc tố khác nhau, đặc biệt là các chất có hiệu ứng gây độc cho hệ thần kinh như Aphanizomenonf aquae sinh ra các alkaloid gây độc cho hệ thần kinh gây ảo giác.
2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ BỆNH HỌC CỦA E. COLI
2.1. Đặc điểm sinh học
- Phân loại và đặc điểm hình thái [8]
Escherichia coli còn có tên là Bacterium coli comme, Bacillus coli communis do Escherich phân lập năm 1885 từ phân trẻ em. Ngày nay, E. coli được xếp vào họ Enterobacteria, giống Escherichia, loài E. coli. Trong giống Escherichia, phản ứng sinh hóa để phân loại ít có giá trị, việc phân chia thành các type thường phải căn cứ vào cấu tạo kháng nguyên. E. coli là trực khuẩn hình gậy ngắn kích thước 2 – 3 x 6m, hai đầu tròn (Hình 1), tế bào đứng riêng lẽ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, có tiên mao chung quanh thân nên có thể di động, không tạo bào tử, Gram âm, thỉnh thoảng có hiện tương bắt màu ở hai đầu.
Hình 1. E. coli dưới kính hiển vi điện tử quét SEM [10] Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
- Đặc điểm nuôi cấy [6,8]
E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tuỳ ý, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 15 - 44C (tối ưu ở 37C), pH từ 5,5 – 8,5 (tối ưu ở 7,4). Khi tăng trưởng trên mặt thạch PCA ở 37C trong 24 giờø, E. coli hình thành những khuẩn lạc tròn ướt, trong, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính 2 – 3 mm. Trong môi trường nước peptone E. coli phát triển tốt, làm môi trường rất đục có lắng cặn màu tro nhạt ở đáy công cụ nuôi cấy, đôi khi hình thành màng xám nhạt. Canh trường có mùi phân thối. Trên môi trường Endo, E. coli hình thành những khuẩn lạc màu đỏ ánh kim. Trên môi trường DA (Desoxycholate Agar), E. coli cho khuẩn lạc màu đỏ, dẹt tròn và khô. Trên môi trường EMB( Eosine Methylene Blue), E. coli hình thành những khuẩn lạc màu tím đen, đỏ tía thường có ánh kim, bờ tròn đều. Vi khuẩn này không phát triển ở môi trường Kauffmann và môi trường Wilson Blair.
- Đặc điểm sinh hóa [10]
E. coli lên men sinh hơi với nguồn cacbon là glucose, galactose, lactose, maltose,
arabinose, xylose, ramnose, mannitol, fructose; có thể lên men hay không lên men saccharose, rafinose, esculin, duncid, glycerol; ít khi lên men inulin, pectin, adonite; không lên men dextrin, amidon, glycogen, inositol, cellobiose. Vi khuẩn thường sinh indol, không sinh urea và H2S, có sinh lysin decarboxylase, không sử dụng citrate. Sự tăng trưởng của vi khuẩn bị ức chế bởi chlorine, các dẫn xuất của muối mật, brilliant green, sodium deoxycholate, sodium tetrathionate, selenite... Để phân biệt E. coli với các vi khuẩn đường ruột khác, 4 tính chất sinh hoá thường được dùng là Indol, Methyl Red, Voges Proskauer và Citrate( còn được gọi là thử nghiệm IMViC).
+ Indol (I): trong môi trường có tryptophan, tryptophanase của E. coli thuỷ phân tryptophan thành indol. Để phát hiện indol, dùng vài giọt thuốc thử Kovac,s có chứa chất p- dimethylaminobenzaldehyde. Chất này sẽ kết hợp với indol tạo nên hợp chất muối dimethyl amonium có màu đỏ .
+ Methyl Red (đỏ methyl, MR): khi được nuôi cấy trong môi trường có glucose, E. coli sẽ tạo ra một nồng độ H+ cao ( pH < 4,5). Khi bổ sung vào môi trường đã nuôi cấy 24 giờ ở 37C vài giọt thuốc thử Methyl Red, môi trường sẽ có màu đỏ.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
+ Voges Proskauer (VP): trong quá trình lên men glucose, vi sinh vật có thể cho những sản phẩm cuối khác nhau, một trong số đó là acetoin. Khi bổ sung vào môi trường vài giọt potassium hydroxide (40%) và -naptol (5% trong cồn tuyệt đối), acetonin sẽ tạo ra một phức hợp màu đỏ.
+ Citrate (C): trong môi trường Simons có nguồn C duy nhất là citrate, vi khuẩn nào sử dụng được citrate sẽ làm kiềm hoá môi trường và điều này được nhận diện bởi sự đổi màu của môi trường (xanh lá cây thành xanh dương).
E. coli có kết quả thử nghiệm IMViC là như sau : I (+), MR (+), VP (-) và C (-). - Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên [22]
Từ năm 1930, Kauffmann đã đưa ra biểu đồ phân type huyết thanh của E. coli dựa trên kháng nguyên thân (O), kháng nguyên vỏ (K) và kháng nguyên lông ( H ).
+ Kháng nguyên O được cấu tạo bởi phức hợp lipopolysacharide, có liên kết chéo về đặc tính huyết thanh với vi khuẩn khác như Shigella, Samonlla.
+ Kháng nguyên K có thành phần chính là polysaccharide có tính axit và được chia làm 3 nhóm A, B và L. Tính ngưng kết của nhóm A không bị bất hoạt ở 121C trong khi L bị bất hoạt ở 100C trong 1 giờ.
+ Kháng nguyên H có tính đa dạng phụ thuộc vào sự hiện diện của tiên mao ở từng chủng. Nhiều E. coli ban đầu khi phân lập thì không di động hay chuyển động chậm nhưng khi được chuyển qua môi trường thạch bán rắn thì di động tích cực. Chỉ những chủng di động mới có kháng nguyên H.
- Phân bố
E. coli hiện diện ở phần sau của ruột, nhiều nhất là ở ruột già, ít khi ở dạ dày hay phần
trước ruột động vật (trâu, bò, heo, chó, mèo, gia cầm và người). Các loài động vật ăn thịt và loài hỗn thực bài tiết nhiều E. coli hơn loài ăn cỏ. Vi khuẩn này được thải theo phân người và động vật ra ngoài và nhiễm vào đất và nước. Việc phát hiện E. coli trong nguồn nước là một thử nghiệm chính nhằm xác định nước có bị nhiễm phân hay không. Trước đây, E. coli được xem là một vi khuẩn bình thường trong ruột. Hiện nay có nhiều chủng được xem như một trong những tác nhân gây tiêu chảy, đặc biệt ở trẻ em.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
2.2. Đặc tính gây bệnh [1,7]
E. coli sống cộng sinh trong ruột người. Bình thường vi khuẩn này không gây bệnh và ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác, tổng hợp vitamin C và K rất cần thiết cho con người. Khi tỉ lệ E. coli giảm xuống dưới 20% so với tổng số vi sinh vật đường ruột thì mới xuất hiện các triệu chứng rối loạn tiêu hóa do loạn khuẩn.
Một số chủng E. coli có khả năng gây bệnh. Bệnh gây ra bởi E. coli thay đổi theo vị trí xâm nhập và chủng gây bệnh. Một số biểu hiện lâm sàng thường gặp là:
- Nhiễm khuẩn đường tiểu: E. coli có thể gây bệnh nhiễm khuẩn đường tiểu với các triệu chứng như tiểu nhiều lần, tiểu lắt nhắt, tiểu đau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ. Có trường hợp biến chứng thành nhiễm khuẩn tử cung, đường niệu, ống dẫn trứng, thận và nhiễm khuẩn máu.
- Nhiễm khuẩn máu: khi sức đề kháng của cơ thể người giảm, vi khuẩn có thể vào máu và gây nhiễm khuẩn. Thường gặp ở trẻ sơ sinh và sau khi nhiễm khuẩn đường tiểu.
- Viêm màng não: E. coli và streptococci nhóm B là những nguyên nhân hàng đầu gây viêm màng não ở trẻ em. E. coli chiếm khoảng 40 trường hợp gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh, trong đó 75% E. coli có kháng nguyên K1.
- Tiêu chảy và các bệnh đường ruột: trước đây, vai trò gây tiêu chảy của E. coli ít được đề cặp đến. Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của kĩ thuật xét nghiệm, người ta ngày càng phát hiện được nhiều chủng E. coli gây tiêu chảy và các bệnh đường ruột khác. E. coli được xem là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy, đặc biệt là trẻ em. Bệnh gặp khắp nơi trên thế giới, ở các nước phát triển lẫn các nước đang phát triển. Nhiều nơi phát sinh thành dịch do khả năng lây lan rất nhanh và gây hiệu quả nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng.
Người ta chia các chủng E. coli gây bệnh đường ruột ra thành các nhóm sau:
- EPEC (Enterophathogenic E. coli): là các chủng E. coli đầu tiên được xác định gây bệnh tiêu chảy ở người. Nhóm này gồm một số typ huyết thanh cổ điển gây viêm ruột và tiêu
chảy dạng nước hay lẫn máu ở trẻ em cũng như người lớn.
- EIEC (Enteroinvavise E. coli): gây tiêu chảy với triệu chứng lâm sàng dạng lỵ giống
Shigella. Bệnh thường gặp ở trẻ em lẫn người lớn và được xác định khi thấy có máu và đờm xuất hiện trong phân.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. KẾT LUẬN
Từ kết quả của quá trình thí nghiệm chúng tui rút ra một số kết luận như sau:
- Đã thiết lập được quy trình PCR để phát hiện E. coli bằng cặp mồi EC tự thiết kế. Cặp mồi EC này có tính chuyên biệt cao đối với các chủng E. coli. Độ nhạy phát hiện của phương pháp PCR đối với mẫu thực phẩm gây nhiễm là 1 – 5 CFU/g thực phẩm sau 20 giờ tăng sinh trong môi trường TSB. Kết quả này tương đương với phương pháp nuôi cấy
- Đã tiến hành đánh giá hiệu lực sơ bộ qui trình đề xuất. Các thông số kĩ thuật của phương pháp PCR như độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, dương tính giả, âm tính giả đều đạt tỉ lệ 100% so với phương pháp nuôi cấy. Qui trình PCR có độ lặp lại cao, ổn định, dễ thực hiện và cho kết quả đồng nhất.
- Đã thử nghiệm ứng dụng qui trình PCR để khảo sát tỉ lệ nhiễm E. coli trên 70 mẫu thực phẩm khác nhau, phương pháp PCR đã phát hiện 61% mẫu bị nhiễm E. coli, khá thống nhất với phương pháp truyền thống( 62%).
2. ĐỀ NGHỊ
Để phương pháp PCR được chấp nhận và ứng dụng rộng rãi, chúng tui đề nghị một số điểm sau:
- Thực hiện bước xác nhận hiệu lực thứ cấp để có đủ cơ sở triển khai phương pháp PCR phát hiện E. coli vào thực tế.
- Thực hiện khảo sát sự hiện diện của E. coli trong các loại thực phẩm trên diện tích rộng và có kế hoạch để khẳng định chắc chắn về tỉ lệ nhiễm E. coli trong thực phẩm đang lưu hành trên thị trường.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Thanh Bảo (1993), Escherichia coli, Vi khuẩn học, Bộ môn vi sinh, Đại Học Y
dược TP Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Hữu Chí (2001), Các bệnh đường tiêu hóa thường gặp, Nxb Thành Phố Hồ Chí
Minh.
3. Nguyễn Tiến Dũng (2002), Phát hiện phân biệt Samonella spp và S. entericaI bằng PCR,
Luận văn Thạc sĩ Ngành Sinh học Trường Đại học Khoa học tự nhiên Đại học Quốc gia TP
Hồ Chí Minh.
4. Hồ Huỳnh Thùy Dương ( 2003), Sinh học phân tử, Nxb Giáo Dục.
5. Phạm Thành Hổ ( 2002), Di truyền học, Nxb Giáo Dục.
6. Lê Đình Hùng (1997), Đại cương về phương pháp kiểm tra vi sinh trong thực phẩm,Trung
tâm đo lường chất lượng III.
7. Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm (2000), Vệ sinh an toàn thực phẩm, Trường Đại học
Kĩ Thuật TP Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Vĩnh Phước (1977), Vi sinh vật thú y tập I, II, III, Nxb Đại Học và Trung Học
Chuyên Nghiệp Hà Nội.
9. Bùi Thị Thuận, Nguyễn Phùng Tín, Bùi Minh Đức (1991), Kiểm tra chất lượng và thanh tra
vệ sinh an toàn thực phẩm, Nxb Y học.
10. Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ
phẩm, Nxb Giáo Dục.
11. Trần Linh Thước (2001), Thực tập vi sinh vật học, Nxb Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ
Chí Minh.
12. Trần Thanh Thủy (2000), Hướng dẫn thực tập vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục.
13. Văn phòng công nhận chất lượng Việt Nam (2000). Yêu cầu chung về năng lực của các
phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn, ISO/IEC 17025. TIẾNG ANH
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
14. AOAC International Methods Committee Guidelines for Validation of Qualitative Microbiological Official Methods of Analysis (2000).
15. Bruce A White (1993), PCR protocol, Human Press, New Jersey.
16. Caeiro JP, Estrada - Garicia MT, Jiang ZD, Mathewson JJ, Adachi JA, Steffer R, Dupon HL (1999), Improved detection of enterotoxigenic Escherichia coli among patients with traverlers' diarrhea by use of the polymerase chain reaction technique. J. infection Disease, 180 (6) - 2053 - 2055.
17. DBMD (2001) - Foodborne infections - General information .
18. Hugh G. Griffin, Annette M . Griffin (1994), PCR technology: Current innovation, CRC Press. USA.
19. Jame P. Nataro. James B. Kaper (1998), Diarrheagenic Escherichia coli, Clinical Microbiology Reviews, 11(1): 142 – 201.
20. Sac – Single Jul (2002), Method validation of microbiological methods.
21. World Health Organization (WHO) (1997). Vol.50. No. 1/2. World Health statistics
Quarterly.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
ĐẶT VẤN ĐỀ
Vấn đề vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong những chương trình phát triển của các quốc gia. Trong những năm gần đây, tình hình ngộ độc thực phẩm có xu hướng gia tăng cả về số lượng lẫn qui mô tác hại ở nhiều nước. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), có đến hơn 50% các vụ ngộ độc thực phẩm là do tác nhân vi sinh vật gây ra [20].
Hiện nay, xuất khẩu thực phẩm đang chiếm tỷ trọng quan trọng trong kinh tế xuất khẩu của nước ta. Sự hội nhập kinh tế theo xu hướng toàn cầu hóa có tác động rất lớn đến các tiêu chuẩn về chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm. Việc đẩy mạnh xây dựng qui trình, cải tiến các trang thiết bị được xem là giải pháp đóng vai trò quyết định, giúp nâng cao năng lực kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm. Về mặt này việc kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm như E. coli, Samonella, Shigella, Virio... có vai trò rất quan trọng.
E. coli được xem là vi sinh vật chỉ thị nhiễm khuẩn thực phẩm, là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội có thể gây viêm ruột và tiêu chảy ở trẻ nhỏ, tiêu chảy hội chứng lỵ hay tiêu chảy hội chứng tả. Ngoài ra, E. coli còn gây bệnh viêm đường niệu, viêm khuẩn bàng quang, thận, tuyến tiền liệt, ống dẫn trứng... Qui trình kiểm tra E. coli gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp truyền thống thường chậm, tốn thời gian (kéo dài 3 - 4 ngày) và độ nhạy thấp. Trong khi đó các phương pháp chẩn đoán phân tử dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử như lai phân tử, PCR... có khả năng khắc phục được các nhược điểm này, đang được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới.
Từ bối cảnh nêu trên, thực tiễn sản xuất ở nước ta đã đặt ra yêu cầu cần có phương pháp phát hiện nhanh E. coli gây bệnh trong thực phẩm, thay thế các phương pháp truyền thống, cho phép giám sát tính an toàn và giảm tối đa nguy cơ gây bệnh từ nhóm vi khuẩn này trong thực phẩm.
Do vậy, mục tiêu của đề tài luận văn này là thiết lập qui trình phát hiện E. coli trong thực phẩm bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) để thay thế các phương pháp truyền thống.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
PHẦN I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM VÀ VI SINH VẬT GÂY BỆNH QUA THỰC PHẨM
1.1. Một số khái niệm liên quan
Trong lĩnh vực thực phẩm hiện nay, có hai khái niệm đang được sử dụng rộng rãi là vệ sinh thực phẩm và an toàn thực phẩm và một số khái niệm quan trọng khác cần được phân biệt.
- Vệ sinh thực phẩm (food hygiene) [7,9] : là khái niệm để biểu thị thực phẩm không chứa vi sinh vật gây bệnh và không chứa độc tố. Khái niệm này cũng bao hàm tình trạng vệ sinh trong khi vận chuyển, chế biến và bảo quản thực phẩm.
- An toàn thực phẩm (food safety) [7, 9]: là khả năng không gây ngộ độc của thực phẩm đối với con người bởi vi sinh vật hay bởi hóa chất, các yếu tố vật lý. Theo nghĩa rộng, khái niệm này còn được hiểu là khả năng cung cấp đầy đủ và kịp thời về số lượng và chất lượng thực phẩm khi một quốc gia gặp thiên tai hay một lý do nào đó. Mục đích của an toàn thực phẩm là việc bảo đảm được thực phẩm không bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh, không chứa độc tố sinh học, độc tố hoá học và các yếu tố khác có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng trong các quá trình sản xuất, vận chuyển, chế biến và bảo quản thực phẩm.
- Ngộ độc thực phẩm [6,17]: dùng để chỉ tất cả các bệnh gây ra bởi các mầm bệnh có trong thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm được chia thành 2 nhóm:
+ Ngộ độc do chất độc của vi sinh vật tạo ra trong nguyên liệu hay hóa chất từ quá trình chăn nuôi, trồng trọt bảo quản, chế biến... Các độc chất này đã có trong thực phẩm trước khi được tiêu thụ.
+ Ngộ độc do nhiễm trùng: là trường hợp vi khuẩn gây bệnh theo thực phẩm vào cơ thể bằng đường tiêu hóa và tác động tới cơ thể do sự hiện diện của bản thân vi khuẩn hay do độc tố của vi khuẩn .
- Độc tố [7, 8]: là các hợp chất hóa học có trong nguyên liệu, sản phẩm thực phẩm ở một hàm lượng có thể gây ngộ độc khi được tiêu thụ bởi người hay động vật. Độc tố có thể tồn
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
tại ở nhiều trạng thái khác nhau và được tạo ra trong thực phẩm bằng nhiều con đường khác nhau. Độc tố có nguồn gốc từ vi sinh vật được tạo ra bằng 2 con đường cơ bản sau:
+ Tế bào vi sinh chứa thành phần có độc tính. Vi sinh vật tăng trưởng thành mật độ cao trong thực phẩm, khi tế bào bị chết đi, độc tố được phóng thích vào thực phẩm. Loại độc tố này được gọi là nội độc tố (endotoxin).
+ Tế bào vi sinh tổng hợp các protein có độc tính được tiết ra ngoài tế bào. Loại độc tố này được gọi là ngoại độc tố (exotoxin).
Nội độc tố và ngoại độc tố khác nhau nhiều về bản chất hóa học, các đặc tính hóa học và cách hoạt động. Bảng 1 so sánh một số đặc trưng của hai loại độc tố này.
Bảng 1. So sánh một số đặc điểm của ngoại độc tố và nội độc tố của vi khuẩn [7, 26]
Ngoại độc tố (exotoxin) Nội độc tố (endotoxin)
1.2. Những vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm thường gặp
- Coliform [10]: Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm các vi sinh vật dùng để chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Nhóm coliform gồm những vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý, Gram âm, không sinh bào tử, hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi trường nuôi cấy lỏng. Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, nhóm này lại được chia thành 2 nhóm nhỏ là coliform và coliform phân có nguồn gốc từ phân của các loài động vật. Coliform phân có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng bao gồm các giống Escherichia, Klebsiella và Enterobacter. Trong các thành viên của
- Do vi khuẩn còn sống tiết ra
- Có ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm
- Bản chất là protein
- Không bền với nhiệt
- Độc lực cao
- Triệu chứng bệnh đặc hiệu, không gây sốt
- Do vi khuẩn chết phóng thích
- Có ở vi khuẩn Gram âm, ít ở vi khuẩn Gram dương
- Bản chất là lipopolysaccharide
- Tương đối bền với nhiệt
- Tương đối ít độc
- Triệu chứng bệnh không đặc hiệu, hay gây sốt, choáng.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
nhóm coliform phân thì E. coli là loài được sự quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm.
- Escherichia coli [1,10]: vi khuẩn hiện diện trong ruột người và động vật, được thải ra ngoài thiên nhiên theo đường phân nên thường gặp trong đất và nước. Năm 1971 E. coli được xếp vào nhóm các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và là một vi sinh vật chỉ thị nhiễm khuẩn thực phẩm. Loài này là trực khuẩn Gram âm mang đầy đủ tính chất cơ bản của vi khuẩn đường ruột. Khả năng gây bệnh của E. coli rất đa dạng và tùy thuộc vào vị trí xâm nhập. Đối với nhiễm khuẩn ngoài đường ruột, E. coli gây nhiều bệnh khác nhau với các triệu chứng không đặc trưng và được xem là những vi khuẩn gây bệnh cơ hội (như viêm đường niệu, viêm nhiễm bàng quang, thận, tuyến tiền liệt, ống dẫn trứng hay nhiễm trùng máu). Ngoài ra E. coli còn có thể gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh. Đối với nhiễm khuẩn đường ruột, E. coli gây các bệnh viêm ruột, tiêu chảy ở trẻ nhỏ, tiêu chảy hội chứng lỵ hay tiêu chảy hội chứng tả.
- Salmonella [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, di động bằng chu mao. Vi khuẩn này chịu nhiệt kém nhưng chịu được một số hóa chất như brilliant green, sodium lauryl sulfate, selenite, tetrathionate. Người ta đã phân lập được 2324 chủng Salmonella khác nhau. Ngoài nội độc tố Salmonella có thể tạo ra hai loại ngoại độc tố là độc tố ruột (enterotoxin) và độc tố tế bào (cytotoxin). Dựa vào cấu trúc kháng nguyên O và H, người ta chia Salmonella gây bệnh ra thành 3 nhóm: nhóm chỉ gây bệnh cho người, nhóm gây bệnh cho động vật và nhóm gây bệnh cho người và động vật. Ở người Salmonella có thể gây sốt thương hàn (do S. typhi hay S. typhi A, B,C), nhiễm trùng máu (S. cholera-suis), rối loạn tiêu hoá (S. typhimurinum, S. enteritidis). Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể bằng đường miệng qua thức ăn. Vào ruột non, vi khuẩn tăng trưởng xâm nhập vào máu và các cơ quan khác gây viêm . Ngộ độc thực phẩm do nội độc tố của Salmonella gây ra các triệu chứng như nôn mữa, đau đầu, ớn lạnh, tiêu chảy. Sốt xuất hiện vào 12 – 24 giờ sau khi ăn thức ăn có chứa 1 – 10 triệu tế bào Salmonella/g thức ăn. Bệnh kéo dài 2 – 3 ngày, phần lớn bệnh nhân tự phục hồi nhưng cũng có trường hợp tử vong, đặc biệt là người già, trẻ sơ sinh và người suy yếu hệ miễn dịch.
- Shigella [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, không di động, không sinh bào tử, kỵ khí tùy ý,
tăng trưởng ở nhiệt độ từ 10 – 40C, pH 6 – 8, có kháng nguyên O, một số có kháng nguyên K,
không có kháng nguyên H. Shigella gồm có 4 loài: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boyalia, S. Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
sonnei. Trong đó S. dysenteriae type 1 tạo độc tố thần kinh có độc lực rất cao, đã từng gây những dịch lớn. Tỉ lệ tử vong của bệnh do Shigella cao hơn bệnh do Salmonella. Nhiễm khuẩn Shigella chỉ giới hạn ở đường tiêu hóa chỉ cần 10 – 100 tế bào cũng đủ gây bệnh. Vi khuẩn này tạo hai dạng độc tố. Nội độc tố lipopolysaccharide có ở thành tế bào vi khuẩn gây kích thích thành ruột. Ngoại độc tố vừa tác động lên ruột vừa tác động lên hệ thần kinh trung ương gây các triệu chứng tiêu chảy, ức chế hấp thu đường, axit amin ở ruột non, nếu tác động lên hệ thần kinh có thể gây tử vong. Vi khuẩn sẽ tấn công niêm mạc ruột già tạo vết loét rồi hoại tử. Khi ruột già bị tổn thương gây đau bụng quặn dữ dội, đi tiêu nhiều lần, phân nhầy nhớt và có máu được gọi là hội chứng lỵ Shigella.
- Vibrio [6,10]: là phẩy khuẩn, Gram âm, di động nhờ tiên mao ở một đầu, hiếu khí hay yếm khí không bắt buộc. Vibrio thường gặp trong thực phẩm, nhất là trong hải sản, gồm khoảng 28 loài, trong đo có 4 loài gây bệnh là V. parahaemolyticus, V. cholerae,V. vulnificus và V. alginolyticus.
+ V. cholerae là loài vi khuẩn phổ biến trong thiên nhiên gây dịch tả ở người sử dụng nước bẩn và thực phẩm bị nhiễm. Bệnh tả xuất hiện khi V. cholerae xâm nhập vào đường tiêu hóa, qua được hàng rào axit của dịch vị, kết dính vào màng nhầy biểu mô của ruột và tiết ra độc tố ruột. Độc tố ruột V. cholerae là một protein không bền nhiệt, cấu tạo bởi đơn vị A và B. Phần B giúp độc tố gắn vào thụ thể trên bề mặt tế bào ruột là GM1. Tiểu đơn vị A vào ruột tăng hoạt động của adenylcylase khiến tế bào sản xuất cAMP quá nhiều làm tăng tiết ồ ạt nước và chất điện giải từ tế bào thượng bì vào lông ruột gây tiêu chảy. Virio còn có thể tạo hemolysin (chủng Eltor), mucinase làm tróc niêm mạc thượng bì ruột, neuramirdase làm tăng thụ thể tiếp nhận độc tố.
+ V. parahaemolyticus đa số gây độc trong thức ăn làm viêm ruột.
+ V. vulnificus hiện diện rộng rãi ở nước biển, hải sản, có khả năng tổng hợp độc tố cytotoxin, hemolysin, cytolysin. Tỉ lệ tử vong bởi độc tố của vibrio thường rất cao.
+ V. alginolyticus ít gặp và được phát hiện gây bệnh lần đầu tiên vào năm 1971. Vi khuẩn này có khả năng tạo độc tố ruột. Khi vào cơ thể, chúng phát triển rất nhanh trong máu và gây bệnh.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
- Yersinia [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, không tạo bào tử, tạo độc tố ruột chịu nhiệt. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua da (vết bọ chét cắn), niêm mạc (kết mạc, niêm mạc hầu trong, đường hô hấp). Khi vào cơ thể Yersinia sinh sản rất nhanh, biểu hiện lâm sàng là các hạch trên cơ thể. Vi khuẩn đi vào máu và xâm nhập vào các phủ tạng gây xuất huyết. Thời gian ủ bệnh là 2 – 7 ngày. Sau đó có thể sốt cao và đột ngột, hạch to dần gây đau đớn. Trường hợp nhiễm độc thần kinh, người bệnh cảm giác bứt rứt, lo âu. Trường hợp nhiễm trùng máu sớm có thể kèm theo nôn mữa, tiêu chảy, nếu nhiễm muộn thì đông máu nội hạch, hạ huyết áp, người trở nên lừ đừ, suy thận, suy tim.
- Proteus [8,10]: là vi khuẩn có trong tự nhiên, trong đường tiêu hóa của người và động vật. Thực phẩm bị nhiễm Proteus chủ yếu từ nguồn nước hay từ công cụ vật liệu chế biến thực phẩm không được xử lý tốt. Proteus chỉ gây độc khi lượng tế bào trong cơ thể đủ lớn. Độc tố chỉ đóng vai trò phụ trợ để làm tăng khả năng thẩm thấu của niêm mạc ruột, giúp vi khuẩn xâm nhập vào máu nhanh và nhiều hơn. Thời gian ủ bệnh tương đối ngắn (khoảng 3 giờ, đôi khi kéo dài 16 giờ). Khi bị nhiễm khuẩn, người bệnh bị nôn mữa, tiêu chảy cấp, viêm dạ dày, ruột. Nhiệt độ cơ thể tăng. Bệnh xuất hiện rất nhanh nhưng cũng khỏi nhanh. Cơ thể sẽ phục hồi sau 1 – 3 ngày và không gây tử vong.
- Staphylococcus [6,10]: là cầu khuẩn Gram dương, tế bào bình thường liên kết với nhau hình thành chùm, thường sống ở da người, đường hô hấp, đường tiêu hoá, quần áo , đồ vật... Staphylococcus tạo 9 loại độc tố chịu nhiệt (A, B, C1, C2, C3, D, E, G, H) và các enzyme có khả năng hỗ trợ cho độc tố gây độc ở người. Nếu bị ngộ độc chỉ sau 1- 8 giờ người bệnh sẽ buồn nôn, ói mữa, tiêu chảy dữ dội, không sốt và phục hồi. Lượng độc tố có thể gây ngộ độc cho người là 2mg.
- Clotridium [6,10]: là những trực khuẩn Gram âm, yếm khí, tạo bào tử, nhiệt độ phát triển tối ưu 43 – 47C. Hai chủng gây ngộ độc thực phẩm là:
+ C. botulium lần đầu tiên được ghi nhận gây ngộ độc vào năm 1973 và có 6 người chết do nhiễm độc. C. botulium có khả năng tạo độc tố thần kinh và rất nhiều độc tố khác nhau (A, B, F, G, G2, D và G). Độc tố thường có độc lực rất cao.
+ C. perfringens phát triển ở nhiệt độ từ 12 - 50C, bị ức chế ở nồng độ muối NaCl 6%.
Phần lớn trường hợp ngộ độc thực phẩm do C. perfringens khi mật độ tế bào trên 106 tế bào/gam Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
thực phẩm. Thời gian ủ bệnh là 8 – 24 giờ. Triệu chứng là đau bụng, tiêu chảy, sốt, buồn nôn. Độc tố của C. perfringens bị bất hoạt ở 60C trong 10 phút.
- Listeria [6,10]: loài gây bệnh chủ yếu là L. monocytogenes, là vi khuẩn ưa lạnh, có thể phát triển ở nhiệt độ 2,5 - 44C, thường hiện diện trong trong sữa, thịt, cá, rau và cả nước bề mặt. Triệu chứng bệnh là tiêu chảy, sốt nhẹ. Trường hợp nặng, chủng gây bệnh có thể sinh sản trong các đại thực bào gây nhiễm trùng máu, tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và có thể xâm nhập vào bào thai trong bụng mẹ gây sẩy thai , đẻ non hay nhiễm trùng thai nhi.
Ngoài các vi khuẩn thường gặp kể trên còn có nhiều vi khuẩn khác có vai trò nhất định trong việc gây bệnh cho người từ thực phẩm như Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Corynebacterium, Aeromonas hydrophila...
- Virus [6,10]: là nhóm vi sinh vật gây bệnh có kích thước nhỏ nhất, thay đổi từ 5- 20nm. Virus gây bệnh ở thực phẩm ít được nghiên cứu do khó nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy thông thường. Có rất nhiều vụ dịch hay ca bệnh từ thực phẩm do virus gây ra nhưng trong nhiều trường hợp người ta không phát hiện được nguồn gốc gây bệnh. Thực phẩm đóng vai trò môi trường lan truyền mầm bệnh. Một số virus trong thực phẩm gây bệnh ở người đã biết là virus Fadeno serotype 40 và 41 gây loét dạ dày (họ Adenoviridae, chứa DNA, kích thước 100 nm), virus Hepatitis E gây bệnh gan (họ Calciviridae, chứa RNA, kích thước 34 nm), virus Pravo gây đau bao tử ( họ Pravoviridae, chứa DNA, kích thước 22nm), virus Popilo type 1 – 3 và Echo type 1 – 65 gây viêm phổi (họ Picornarividae, chứa RNA, kích thước 28nm)...
- Nấm mốc tạo độc tố [7,20]: một số loài có khả năng tạo độc tố gây ngộ độc hay ung thư ở người và động vật. Trong thực phẩm, một số loài có khả năng tạo ra các độc tố, thường gặp và nguy hiểm nhất là aflatoxin do Aspergillus flavus và A. parasiticus tạo ra. Mức độ ngộ độc bởi nấm mốc là khác nhau, biểu hiện như nhiễm độc nhẹ (gây nôn mữa, tiêu chảy), tổn thương ở gan, thận, túi mật và ống mật. Một số độc tố còn gây u tuyến hay u gan, gây thoái hóa tế bào nhu mô gan, xơ hóa. Citrinin của Penicilium citrinum và P. viridicatum có thể gây các bệnh tăng urea huyết, albumin niệu, viêm tiểu cầu thận. Một số độc tố của nấm mốc như tetronic acid, terestic acid, viridicatic acid... tác động vào tim gây độc đối với chức năng của tim. Độc tố của Stachybotrys ata, Fusarium tricinctum, Dendrodocium toxicum, Aspergillus ochraceus... tác động
vào máu và hệ tuần hoàn gây hội chứng chảy máu.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
- Tảo sinh độc tố [7]: các tảo này làm ô nhiễm nguồn nước, thủy sản, gây ngộ độc cho động vật hoang dã, gia súc, gia cầm và con người. Các loài tảo độc có thể chia ra thành 3 nhóm:
+ Tảo Dinoflabellates: có mặt trong hơn 75% trường hợp thủy triều đỏ nhưng chỉ có 9,5% có độc tính nói chung và 1,5% gây độc cho người. Thường gặp là các giống Gymmodinium, Pyrodinium, Dinophysic, Alexandrium, Gonyaulas...
+ Tảo silic: thường sinh ra domoic, là một axit amin gây độc cho hệ thần kinh trong cơ thể.
+ Tảo lam: có nhiều loại, tạo nhiều loại độc tố khác nhau, đặc biệt là các chất có hiệu ứng gây độc cho hệ thần kinh như Aphanizomenonf aquae sinh ra các alkaloid gây độc cho hệ thần kinh gây ảo giác.
2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ BỆNH HỌC CỦA E. COLI
2.1. Đặc điểm sinh học
- Phân loại và đặc điểm hình thái [8]
Escherichia coli còn có tên là Bacterium coli comme, Bacillus coli communis do Escherich phân lập năm 1885 từ phân trẻ em. Ngày nay, E. coli được xếp vào họ Enterobacteria, giống Escherichia, loài E. coli. Trong giống Escherichia, phản ứng sinh hóa để phân loại ít có giá trị, việc phân chia thành các type thường phải căn cứ vào cấu tạo kháng nguyên. E. coli là trực khuẩn hình gậy ngắn kích thước 2 – 3 x 6m, hai đầu tròn (Hình 1), tế bào đứng riêng lẽ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, có tiên mao chung quanh thân nên có thể di động, không tạo bào tử, Gram âm, thỉnh thoảng có hiện tương bắt màu ở hai đầu.
Hình 1. E. coli dưới kính hiển vi điện tử quét SEM [10] Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
- Đặc điểm nuôi cấy [6,8]
E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tuỳ ý, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 15 - 44C (tối ưu ở 37C), pH từ 5,5 – 8,5 (tối ưu ở 7,4). Khi tăng trưởng trên mặt thạch PCA ở 37C trong 24 giờø, E. coli hình thành những khuẩn lạc tròn ướt, trong, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính 2 – 3 mm. Trong môi trường nước peptone E. coli phát triển tốt, làm môi trường rất đục có lắng cặn màu tro nhạt ở đáy công cụ nuôi cấy, đôi khi hình thành màng xám nhạt. Canh trường có mùi phân thối. Trên môi trường Endo, E. coli hình thành những khuẩn lạc màu đỏ ánh kim. Trên môi trường DA (Desoxycholate Agar), E. coli cho khuẩn lạc màu đỏ, dẹt tròn và khô. Trên môi trường EMB( Eosine Methylene Blue), E. coli hình thành những khuẩn lạc màu tím đen, đỏ tía thường có ánh kim, bờ tròn đều. Vi khuẩn này không phát triển ở môi trường Kauffmann và môi trường Wilson Blair.
- Đặc điểm sinh hóa [10]
E. coli lên men sinh hơi với nguồn cacbon là glucose, galactose, lactose, maltose,
arabinose, xylose, ramnose, mannitol, fructose; có thể lên men hay không lên men saccharose, rafinose, esculin, duncid, glycerol; ít khi lên men inulin, pectin, adonite; không lên men dextrin, amidon, glycogen, inositol, cellobiose. Vi khuẩn thường sinh indol, không sinh urea và H2S, có sinh lysin decarboxylase, không sử dụng citrate. Sự tăng trưởng của vi khuẩn bị ức chế bởi chlorine, các dẫn xuất của muối mật, brilliant green, sodium deoxycholate, sodium tetrathionate, selenite... Để phân biệt E. coli với các vi khuẩn đường ruột khác, 4 tính chất sinh hoá thường được dùng là Indol, Methyl Red, Voges Proskauer và Citrate( còn được gọi là thử nghiệm IMViC).
+ Indol (I): trong môi trường có tryptophan, tryptophanase của E. coli thuỷ phân tryptophan thành indol. Để phát hiện indol, dùng vài giọt thuốc thử Kovac,s có chứa chất p- dimethylaminobenzaldehyde. Chất này sẽ kết hợp với indol tạo nên hợp chất muối dimethyl amonium có màu đỏ .
+ Methyl Red (đỏ methyl, MR): khi được nuôi cấy trong môi trường có glucose, E. coli sẽ tạo ra một nồng độ H+ cao ( pH < 4,5). Khi bổ sung vào môi trường đã nuôi cấy 24 giờ ở 37C vài giọt thuốc thử Methyl Red, môi trường sẽ có màu đỏ.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
+ Voges Proskauer (VP): trong quá trình lên men glucose, vi sinh vật có thể cho những sản phẩm cuối khác nhau, một trong số đó là acetoin. Khi bổ sung vào môi trường vài giọt potassium hydroxide (40%) và -naptol (5% trong cồn tuyệt đối), acetonin sẽ tạo ra một phức hợp màu đỏ.
+ Citrate (C): trong môi trường Simons có nguồn C duy nhất là citrate, vi khuẩn nào sử dụng được citrate sẽ làm kiềm hoá môi trường và điều này được nhận diện bởi sự đổi màu của môi trường (xanh lá cây thành xanh dương).
E. coli có kết quả thử nghiệm IMViC là như sau : I (+), MR (+), VP (-) và C (-). - Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên [22]
Từ năm 1930, Kauffmann đã đưa ra biểu đồ phân type huyết thanh của E. coli dựa trên kháng nguyên thân (O), kháng nguyên vỏ (K) và kháng nguyên lông ( H ).
+ Kháng nguyên O được cấu tạo bởi phức hợp lipopolysacharide, có liên kết chéo về đặc tính huyết thanh với vi khuẩn khác như Shigella, Samonlla.
+ Kháng nguyên K có thành phần chính là polysaccharide có tính axit và được chia làm 3 nhóm A, B và L. Tính ngưng kết của nhóm A không bị bất hoạt ở 121C trong khi L bị bất hoạt ở 100C trong 1 giờ.
+ Kháng nguyên H có tính đa dạng phụ thuộc vào sự hiện diện của tiên mao ở từng chủng. Nhiều E. coli ban đầu khi phân lập thì không di động hay chuyển động chậm nhưng khi được chuyển qua môi trường thạch bán rắn thì di động tích cực. Chỉ những chủng di động mới có kháng nguyên H.
- Phân bố
E. coli hiện diện ở phần sau của ruột, nhiều nhất là ở ruột già, ít khi ở dạ dày hay phần
trước ruột động vật (trâu, bò, heo, chó, mèo, gia cầm và người). Các loài động vật ăn thịt và loài hỗn thực bài tiết nhiều E. coli hơn loài ăn cỏ. Vi khuẩn này được thải theo phân người và động vật ra ngoài và nhiễm vào đất và nước. Việc phát hiện E. coli trong nguồn nước là một thử nghiệm chính nhằm xác định nước có bị nhiễm phân hay không. Trước đây, E. coli được xem là một vi khuẩn bình thường trong ruột. Hiện nay có nhiều chủng được xem như một trong những tác nhân gây tiêu chảy, đặc biệt ở trẻ em.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
2.2. Đặc tính gây bệnh [1,7]
E. coli sống cộng sinh trong ruột người. Bình thường vi khuẩn này không gây bệnh và ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác, tổng hợp vitamin C và K rất cần thiết cho con người. Khi tỉ lệ E. coli giảm xuống dưới 20% so với tổng số vi sinh vật đường ruột thì mới xuất hiện các triệu chứng rối loạn tiêu hóa do loạn khuẩn.
Một số chủng E. coli có khả năng gây bệnh. Bệnh gây ra bởi E. coli thay đổi theo vị trí xâm nhập và chủng gây bệnh. Một số biểu hiện lâm sàng thường gặp là:
- Nhiễm khuẩn đường tiểu: E. coli có thể gây bệnh nhiễm khuẩn đường tiểu với các triệu chứng như tiểu nhiều lần, tiểu lắt nhắt, tiểu đau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ. Có trường hợp biến chứng thành nhiễm khuẩn tử cung, đường niệu, ống dẫn trứng, thận và nhiễm khuẩn máu.
- Nhiễm khuẩn máu: khi sức đề kháng của cơ thể người giảm, vi khuẩn có thể vào máu và gây nhiễm khuẩn. Thường gặp ở trẻ sơ sinh và sau khi nhiễm khuẩn đường tiểu.
- Viêm màng não: E. coli và streptococci nhóm B là những nguyên nhân hàng đầu gây viêm màng não ở trẻ em. E. coli chiếm khoảng 40 trường hợp gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh, trong đó 75% E. coli có kháng nguyên K1.
- Tiêu chảy và các bệnh đường ruột: trước đây, vai trò gây tiêu chảy của E. coli ít được đề cặp đến. Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của kĩ thuật xét nghiệm, người ta ngày càng phát hiện được nhiều chủng E. coli gây tiêu chảy và các bệnh đường ruột khác. E. coli được xem là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy, đặc biệt là trẻ em. Bệnh gặp khắp nơi trên thế giới, ở các nước phát triển lẫn các nước đang phát triển. Nhiều nơi phát sinh thành dịch do khả năng lây lan rất nhanh và gây hiệu quả nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng.
Người ta chia các chủng E. coli gây bệnh đường ruột ra thành các nhóm sau:
- EPEC (Enterophathogenic E. coli): là các chủng E. coli đầu tiên được xác định gây bệnh tiêu chảy ở người. Nhóm này gồm một số typ huyết thanh cổ điển gây viêm ruột và tiêu
chảy dạng nước hay lẫn máu ở trẻ em cũng như người lớn.
- EIEC (Enteroinvavise E. coli): gây tiêu chảy với triệu chứng lâm sàng dạng lỵ giống
Shigella. Bệnh thường gặp ở trẻ em lẫn người lớn và được xác định khi thấy có máu và đờm xuất hiện trong phân.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. KẾT LUẬN
Từ kết quả của quá trình thí nghiệm chúng tui rút ra một số kết luận như sau:
- Đã thiết lập được quy trình PCR để phát hiện E. coli bằng cặp mồi EC tự thiết kế. Cặp mồi EC này có tính chuyên biệt cao đối với các chủng E. coli. Độ nhạy phát hiện của phương pháp PCR đối với mẫu thực phẩm gây nhiễm là 1 – 5 CFU/g thực phẩm sau 20 giờ tăng sinh trong môi trường TSB. Kết quả này tương đương với phương pháp nuôi cấy
- Đã tiến hành đánh giá hiệu lực sơ bộ qui trình đề xuất. Các thông số kĩ thuật của phương pháp PCR như độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, dương tính giả, âm tính giả đều đạt tỉ lệ 100% so với phương pháp nuôi cấy. Qui trình PCR có độ lặp lại cao, ổn định, dễ thực hiện và cho kết quả đồng nhất.
- Đã thử nghiệm ứng dụng qui trình PCR để khảo sát tỉ lệ nhiễm E. coli trên 70 mẫu thực phẩm khác nhau, phương pháp PCR đã phát hiện 61% mẫu bị nhiễm E. coli, khá thống nhất với phương pháp truyền thống( 62%).
2. ĐỀ NGHỊ
Để phương pháp PCR được chấp nhận và ứng dụng rộng rãi, chúng tui đề nghị một số điểm sau:
- Thực hiện bước xác nhận hiệu lực thứ cấp để có đủ cơ sở triển khai phương pháp PCR phát hiện E. coli vào thực tế.
- Thực hiện khảo sát sự hiện diện của E. coli trong các loại thực phẩm trên diện tích rộng và có kế hoạch để khẳng định chắc chắn về tỉ lệ nhiễm E. coli trong thực phẩm đang lưu hành trên thị trường.
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Thanh Bảo (1993), Escherichia coli, Vi khuẩn học, Bộ môn vi sinh, Đại Học Y
dược TP Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Hữu Chí (2001), Các bệnh đường tiêu hóa thường gặp, Nxb Thành Phố Hồ Chí
Minh.
3. Nguyễn Tiến Dũng (2002), Phát hiện phân biệt Samonella spp và S. entericaI bằng PCR,
Luận văn Thạc sĩ Ngành Sinh học Trường Đại học Khoa học tự nhiên Đại học Quốc gia TP
Hồ Chí Minh.
4. Hồ Huỳnh Thùy Dương ( 2003), Sinh học phân tử, Nxb Giáo Dục.
5. Phạm Thành Hổ ( 2002), Di truyền học, Nxb Giáo Dục.
6. Lê Đình Hùng (1997), Đại cương về phương pháp kiểm tra vi sinh trong thực phẩm,Trung
tâm đo lường chất lượng III.
7. Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm (2000), Vệ sinh an toàn thực phẩm, Trường Đại học
Kĩ Thuật TP Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Vĩnh Phước (1977), Vi sinh vật thú y tập I, II, III, Nxb Đại Học và Trung Học
Chuyên Nghiệp Hà Nội.
9. Bùi Thị Thuận, Nguyễn Phùng Tín, Bùi Minh Đức (1991), Kiểm tra chất lượng và thanh tra
vệ sinh an toàn thực phẩm, Nxb Y học.
10. Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ
phẩm, Nxb Giáo Dục.
11. Trần Linh Thước (2001), Thực tập vi sinh vật học, Nxb Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ
Chí Minh.
12. Trần Thanh Thủy (2000), Hướng dẫn thực tập vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục.
13. Văn phòng công nhận chất lượng Việt Nam (2000). Yêu cầu chung về năng lực của các
phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn, ISO/IEC 17025. TIẾNG ANH
Đoàn Thị Ngọc Tuyền
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
14. AOAC International Methods Committee Guidelines for Validation of Qualitative Microbiological Official Methods of Analysis (2000).
15. Bruce A White (1993), PCR protocol, Human Press, New Jersey.
16. Caeiro JP, Estrada - Garicia MT, Jiang ZD, Mathewson JJ, Adachi JA, Steffer R, Dupon HL (1999), Improved detection of enterotoxigenic Escherichia coli among patients with traverlers' diarrhea by use of the polymerase chain reaction technique. J. infection Disease, 180 (6) - 2053 - 2055.
17. DBMD (2001) - Foodborne infections - General information .
18. Hugh G. Griffin, Annette M . Griffin (1994), PCR technology: Current innovation, CRC Press. USA.
19. Jame P. Nataro. James B. Kaper (1998), Diarrheagenic Escherichia coli, Clinical Microbiology Reviews, 11(1): 142 – 201.
20. Sac – Single Jul (2002), Method validation of microbiological methods.
21. World Health Organization (WHO) (1997). Vol.50. No. 1/2. World Health statistics
Quarterly.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator: