daigai

Well-Known Member
Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết Nối

đặt vấn đề
Ch−ơng I: tổng quan tài liệu
1.1. Lịch sử sàng lọc các tác nhân lây bệnh qua đ−ờng truyền
máu
1.1.1. Trên thế giới
1.1.2. Tại Việt Nam
1.2. Đặc điểm sinh học của HIV, HCV, HBV
1.2.1. Virus gây suy giảm miễn dịch ở ng−ời (HIV)
1.2.2. Virus viêm gan C
1.2.3. Virus viêm gan B
1.3. Các biện pháp bảo đảm an toàn truyền máu, phòng lây
nhiễm HIV, HBV, HCV qua đ−ờng truyền máu
1.3.1. Lựa chọn NCM an toàn
1.3.2. Các kỹ thuật sàng lọc huyết thanh HIV, HBV, HCV cho NCM
1.4. Kỹ thuật sàng lọc NAT
1.4.1. Cơ sở sinh học phân tử
1.4.2. Nguyên lý kỹ thuật
1.4.3. Các giai đoạn kỹ thuật
1.5. Tình hình áp dụng quy trình kỹ thuật sàng lọc NAT để phát
hiện sớm NCM nhiễm HIV, HBV, HCV trên thế giới và tại Việt
Nam
1.5.1. Trên thế giới
1.5.2. Tại Việt Nam
Ch−ơng 2: đối t−ợng và ph−ơng pháp
nghiên cứu
2.1 Đối t−ợng nghiên cứu
2.2 Vật liệu nghiên cứu
2.3 Ph−ơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
2.3.2. Kỹ thuật NAT
2.4. Xử lý số liệu
Ch−ơng III: Kết quả nghiên cứu
3.1. Kết quả nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong
việc nâng cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu
3.1.1. Kết quả xét nghiệm NAT của mẫu trộn 8 để phát hiện đồng
thời cả 3 loại virus HIV, HBV, HCV
3.1.2. Kết quả tỉ lệ không có giá trị trong quá trình xét ngiệm
3.1.3. Số lần chạy có không có giá trị trong quá trình xét nghiệm
3.1.4. Kết quả xác định loại virus bằng Probe đặc hiệu
3.1.5. Kết quả xác định ng−ời cho máu bị nhiễm virus viêm gan C
trong mẫu trộn d−ơng tính
3.1.6. Tỉ lệ nhiễm các virus đ−ợc sàng lọc bằng kỹ thuật NAT trong
nghiên cứu
3.1.7. Kết quả RT-PCR của mẫu bị nhiễm virus HCV
3.2. Xây dựng labo sinh học phân tử (SHPT) thực hiện đ−ợc các
kỹ thuật SHPT trong đó có NAT phục vụ cho nội dung sàng lọc
máu và đào tạo
Ch−ơng IV: Bàn luận
4.1 . Kết quả nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong
việc nâng cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu 4.1.1. Kỹ thuật NAT
4.1.2. Sử dụng trộn 8
4.1.3. Tỉ lệ d−ơng tính khi phát hiện đồng thời cả 3 loại virus HIV,
HBV, HCV (Procleix Ultrio Assay)
4.1.4. Tỉ lệ không có giá trị trong quá trình xét nghiệm
4.1.5. Kết quả xác định loại virus bằng Probe đặc hiệu
4.1.6. Kết quả xác định ng−ời cho máu bị nhiễm virus viêm gan C
trong mẫu trộn d−ơng tính
4.1.7. Tỉ lệ nhiễm các virus đ−ợc sàng lọc bằng kỹ thuật NAT trong
nghiên cứu
4.1.8. Kết quả RT-PCR và ELISA của mẫu bị nhiễm virus HCV
4.2. Xây dựng labo sinh học phân tử (SHPT) thực hiện đ−ợc các
kỹ thuật SHPT trong đó có NAT phục vụ cho nội dung sàng lọc
máu và đào tạo
Kết luận
Kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Danh sách mẫu huyết t−ơng đặt vấn đề
Máu rất quan trọng và cần thiết cho sự sống, nhờ có máu mà nhiều
ng−ời bệnh đã đ−ợc cứu sống. Máu và chế phẩm máu có tầm quan trọng đặc
biệt trong điều trị các bệnh máu cũng nh− cần để cấp cứu các tr−ờng hợp chảy
máu sau đẻ, chảy máu do chấn th−ơng, tai nạn và thảm họa. Máu quan trọng
nh− vậy nh−ng truyền máu có thể gây tai biến cho ng−ời bệnh [18].
An toàn truyền máu là nội dung xuyên suốt trong chiến l−ợc truyền
máu của Quốc gia, trong đó sàng lọc các tác nhân lây nhiễm qua đ−ờng truyền
máu đ−ợc xem là một trong những nội dung then chốt [18].
Các tác nhân gây bệnh có thể đ−ợc truyền từ máu và chế phẩm máu của
ng−ời cho máu (NCM) đã nhiễm bệnh sang ng−ời thân. Căn nguyên gây các
bệnh nhiễm trùng qua đ−ờng máu có rất nhiều [54], [55], tuy nhiên theo
khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới thì 3 virus bắt buộc phải đ−ợc sàng lọc
NCM là HIV, HBV, HCV [58], [102].
Trong sàng lọc NCM hiện nay, ng−ời ta dùng ph−ơng pháp ELISA để
phát hiện các kháng thể (KT) và các kháng nguyên (KN) của virus. Ph−ơng
pháp này có độ tin cậy khá cao, tuy nhiên nh−ợc điểm của ph−ơng pháp là phụ
thuộc rất nhiều vào đáp ứng miễn dịch của mỗi cá thể, giai đoạn cửa sổ còn
khá dài, nguồn NCM ch−a thực sự an toàn. Do vậy, ng−ời ta vẫn gặp những
tr−ờng hợp bệnh nhân (BN) bị lây nhiễm virus do truyền máu nhiễm virus
trong giai đoạn cửa sổ.
Từ năm 1999, kỹ thuật NAT đã phát triển cho phép xác định trực tiếp
HIV-RNA, HBV-DNA, HCV-RNA. Nhờ sử dụng ph−ơng pháp này, ng−ời ta
có thể loại trừ những mẫu máu có virus mà kỹ thuật huyết thanh học không
phát hiện đ−ợc, do đó làm giảm nguy cơ BN bị lây nhiễm virus do truyền máu
trong giai đoạn cửa sổ. Cụ thể rút ngắn giai đoạn cửa sổ từ 80-90 ngày còn 23 ngày cho HCV; 22-30 ngày còn 11 ngày cho HIV; 50-60 ngày xuống còn 34
ngày cho HBV [51].
Hiện nay, một số n−ớc tiên tiến đã áp dụng th−ờng quy kỹ thuật NAT
để sàng lọc HIV, HBV, HCV cho NCM nh− Mỹ, Nhật, Hà Lan, Thụy Điển,
Đức…
Tại Việt Nam, sàng lọc HIV, HBV, HCV cho NCM đã đ−ợc thực hiện
trên phạm vi toàn quốc từ cuối năm 1994. Tuy nhiên do điều kiện kinh phí còn
hạn hẹp nên các biện pháp kỹ thuật sàng lọc NCM còn nhiều hạn chế, vì vậy
giai đoạn cửa sổ huyết thanh còn khá dài nên việc lây nhiễm các bệnh qua
đ−ờng truyền máu là khó tránh khỏi do không phát hiện đ−ợc [19], [20], [30].
Xuất phát từ thực trạng trên chúng tui tiến hành nghiên cứu đề tài này
nhằm mục tiêu:
1. Nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong việc nâng
cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu.
2. Xây dựng labo sinh học phân tử (SHPT) thực hiện đ−ợc các kỹ
thuật SHPT trong đó có NAT phục vụ cho nội dung sàng lọc máu và đào tạo. Ch−ơng I
Tổng quan
1.1. Lịch sử các tác nhân lây bệnh qua đ−ờng truyền máu
1.1.1. Trên thế giới
Năm 1885, Lurman đã thông báo 191 tr−ờng hợp viêm gan sau khi tiêm
chủng vaccine phòng đậu mùa [82]. Năm 1963 Blumberg bắt đầu nghiên cứu
tìm yếu tố huyết thanh để chẩn đoán bệnh này [18].
Năm 1965 Blumberg và cộng sự lần đầu tiên miêu tả KN Australia và
cho rằng KN này có thể đ−ợc phát hiện trong huyết thanh của nhiều BN
Hemophilia đ−ợc truyền máu nhiều lần [42].
Năm 1967 ông đã thành công trong việc dùng KT miễn dịch khuếch tán
trên gel thạch phát hiện KN viêm gan B, ký hiệu Au [18].
Năm 1970, nhà bác học Dane và cộng sự đã phân lập đ−ợc virus viêm
gan B hoàn chỉnh gọi là Dane [17], [18], [37]. Những năm tiếp theo các dấu
ấn miễn dịch khác của virus viêm gan B nh− kháng thể HBs, HBeAg, kháng
thể HBc, kháng thể HBe, HBcAg lần l−ợt đ−ợc phát hiện [18], [69].
Sàng lọc HBsAg cho NCM đ−ợc bắt đầu từ năm 1971, kỹ thuật ban đầu
đ−ợc sử dụng là kỹ thuật khuếch tán trên gel thạch và kỹ thuật điện di. Năm
1975 sử dụng kỹ thuật phóng xạ miễn dịch (RIA) và kỹ thuật miễn dịch
enzym (EIA) để phát hiện HBsAg [71]. Năm 1980 bắt đầu sử dụng ELISA để
sàng lọc HBsAg ở NCM.
Virus viêm gan C đ−ợc Houghton xác định và phân lập năm 1988, đồng
thời ông cũng là ng−ời nghiên cứu thành công trong việc sản xuất kít ELISA
thế hệ thứ nhất để chẩn đoán tình trạng nhiễm HCV [18].
Năm 1989, tác nhân gây viêm gan non A- non B đã đ−ợc sáng tỏ [18].
Các nhà khoa học đã phân lập đ−ợc virus viêm gan C và họ đã lai tạo thành
công dòng vô tính của virus từ E.coli chủng C-300-3 và từ kết quả này họ đã sử dụng KN C-300-3 để phát hiện KT chống HCV trong huyết thanh của BN
viêm gan [65].
Năm 1990 tại Mỹ đã sử dụng kỹ thuật EIA thế hệ 1 (HCV 1.0 EIA) để
phát hiện KT đặc hiệu với KN Protein c100-3 của HCV [73].
Năm 1992 kỹ thuật EIA thế hệ 2 phát triển (HCV 2.0 EIA) có độ nhạy
hơn thế hệ 1 trong việc phát hiện nhiễm trùng HCV cấp và mạn. KN đ−ợc sử
dụng trong kỹ thuật này bao gồm 2 thành phần protein: 1 cấu trúc (c22-3) và 1
không cấu trúc (c33c). Những KT chống lại protein này xuất hiện sớm hơn
c100-3 do đó giai đoạn cửa sổ huyết thanh học đ−ợc rút ngắn so với thế hệ 1 là
10-20 ngày [73].
Năm 1996 kỹ thuật EIA thế hệ 3 (HCV 3.0 EIA) đã phát triển, kỹ thuật
này khác với những thế hệ tr−ớc là bỏ đi phức hợp Protein c100 và thêm phức
hợp Protein NS-5. Do đó giai đoạn cửa sổ huyết thanh học đ−ợc rút ngắn 10
ngày so với thế hệ 2 [41], [50].
Năm 1981, tại Los Angeles (Mỹ) nhà khoa học P. Carini đã phát hiện
một số tr−ờng hợp đồng tính luyến ái nam bị viêm phổi rất nặng [27], [55].
Tháng 6/1981 bác sỹ Michael Goleb đã mô tả bệnh nhân đầu tiên bị hội chứng
suy giảm miễn dịch mắc phải ở ng−ời [36]. Năm 1983 nhà bác học Luc
Montagnier (Pháp) và Gallo (Mỹ) đã phát hiện và chứng minh HIV chính là
căn nguyên gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở ng−ời [55], [80].
Ngày 02/03/1985, Cục quản lý thực và d−ợc phẩm Hoa Kỳ, viết tắt là
FDA (Food and Drug Administration) cho phép sử dụng kỹ thuật EIA đầu tiên
để phát hiện kháng thể HIV-1 [39], [44]. Năm 1987 tại Mỹ bắt đầu sử dụng kỹ
thuật thấm miễn dịch (Western Blot - WB) để phát hiện kháng thể HIV. Năm
1996 FDA bắt đầu sử dụng kỹ thuật phát hiện KN p24 của virus HIV-1 để
sàng lọc NCM.
Từ năm 1999 FDA đã cho phép sử dụng kỹ thuật NAT để phát hiện trực
tiếp RNA của virus HCV và HIV-1 tại Mỹ [45], [68]. Ph−ơng pháp này làm tăng c−ờng độ an toàn của máu, có thể phát hiện đ−ợc nhiễm trùng virus cấp
tính trong giai đoạn cửa sổ mà tại thời điểm đó ph−ơng pháp huyết thanh học
không phát hiện đ−ợc. Hiện nay, nhiều n−ớc trên thế giới đã áp dụng kỹ thuật
NAT để sàng lọc các virus ở NCM làm giảm tối đa sự lan truyền virus qua
đ−ờng truyền máu, nhờ đó tỉ lệ lây nhiễm virus đã giảm đi rất nhiều.
1.1.2. Tại Việt Nam
Năm 1970 KN Australia gọi là KN viêm gan B xuất hiện trên 1 BN nữ
thiếu máu tan máu tự miễn đ−ợc truyền máu nhiều lần. Từ năm 1970 Khoa
Huyết học-Truyền máu BV Bạch Mai và một số nơi trên Việt Nam bắt đầu
tiến hành kiểm tra kháng nguyên Au trên NCM nh−ng cũng mới chỉ sử dụng
kỹ thuật khuếch tán trên gel thạch.
Năm 1984 chúng ta bắt đầu sử dụng kỹ thuật ELISA để sàng lọc NCM
ở một số trung tâm truyền máu lớn.
Ph−ơng pháp và kỹ thuật phát hiện KN Au có rất nhiều [18], KN đ−ợc
phát hiện có thể chính là virus hay là những thành phần liên quan chặt chẽ
với virus viêm gan, đơn giản nhất là kỹ thuật miễn dịch khuếch tán trên gel
thạch. Huyết thanh cần xác định và kháng thể Australia đ−ợc đặt đối diện
trong 2 ô. Nếu huyết thanh BN có chứa KN thì sẽ hình thành 1 cung tủa nơi
gặp nhau của 2 huyết thanh.
Ngoài ra còn có kỹ thuật kết hợp bổ thể, ng−ng kết bị động ng−ợc, miễn
dịch phóng xạ, th−ờng dùng là điện di miễn dịch khuếch tán.
Kỹ thuật chủ yếu dùng ở Việt Nam thời đó là kỹ thuật khuếch tán miễn
dịch Ouchterlony và miễn dịch khuếch tán điện di của Repars cải tiến. Kỹ
thuật sử dụng sàng lọc NCM là kỹ thuật điện di khuếch tán vì có −u điểm là
thời gian nhanh và sàng lọc đ−ợc nhiều, tuy nhiên độ nhạy ch−a cao vì thế bỏ
sót những KN yếu.
Giáo s− Bạch Quốc Tuyên và cộng sự [31] đã chỉnh lý kỹ thuật kết hợp
bổ thể, kỹ thuật ng−ng kết bị động ng−ợc để tăng độ nhạy của sàng lọc nh−ng các kỹ thuật đó chỉ dùng vào một số tr−ờng hợp nghiên cứu vì tốn kém kháng
thể nhiều và không thuận lợi khi xét nghiệm hàng loạt.
Tại Việt Nam, việc sàng lọc cả ba loại virus này mới đ−ợc thực hiện từ
đầu những năm 90 của thế kỷ tr−ớc và cho đến nay vẫn tỏ ra hữu hiệu trong
việc ngăn chặn sự lan truyền bệnh dịch. Từ năm 1996 trở về đây đã có thống
kê b−ớc đầu về tình hình lây nhiễm các virus qua đ−ờng truyền máu [18].
Hiện nay phần lớn các trung tâm truyền máu n−ớc ta đã sử dụng kỹ
thuật ELISA với thế hệ kít thứ 3 (phát hiện đ−ợc cả hai loại kháng thể HIV
loại IgG và IgM ) và thế hệ thứ 4 (phát hiện cả KN HIV p24, hai loại kháng
thể HIV IgG, IgM). Do vậy có thể phát hiện đ−ợc NCM bị nhiễm HIV trong
vòng từ 14 đến 38 ngày.
Năm 1997 các tác giả n−ớc ngoài đã nghiên cứu áp dụng kỹ thuật PCR
phát hiện HIV-RNA, HCV-RNA, HBV-DNA để sàng lọc NCM [18]. Tuy
nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi phải có trình độ chuyên môn cao, giá trang thiết bị
đắt tiền, điều kiện XN ngặt cùng kiệt và giá thành cho một XN còn khá cao, thời
gian XN đòi hỏi lâu, do vậy việc tiến hành kỹ thuật PCR sàng lọc NCM ở Việt
Nam vẫn ch−a đ−ợc ứng dụng để sàng lọc HIV, HCV, HBV.
1.2. Đặc điểm sinh học của HIV, HCV, HBV
1.2.1. Virus gây suy giảm miễn dịch ở ng−ời (HIV)
1.2.1.1 Cấu trúc HIV
HIV thuộc nhóm Retroviridae, thuộc họ Lentivirus, có kích th−ớc từ
100-200 nm. D−ới kính hiển vi điện tử cấu trúc HIV gồm 3 phần: [18], [55],
[101]
- Lớp vỏ (envelop): Đ−ợc cấu tạo bởi lớp lipid kép và các glycoprotein
màng gồm gp 110, gp 120, gp 40, gp 41.
- Phần nhân: Bao gồm các Protein là p24, p17, p18, p51, p56. Các
protein này tạo nên khung cấu trúc của virus.
- Các enzym: Qua sàng lọc 9.392 mẫu huyết t−ơng bằng kỹ thuật NAT, chúng tui có thể
rút ra một số kết luận sau:
1. Nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong việc nâng cao tính
an toàn sinh học của các chế phẩm máu.
Kỹ thuật NAT là kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy tốt hơn so với kỹ thuật
ELISA:
- Trong 9.392 mẫu huyết t−ơng đ−ợc sàng lọc âm tính với kỹ thuật ELISA đã
phát hiện ra một tr−ờng hợp nhiễm virus HCV.
- Kỹ thuật NAT có thể phát hiện đ−ợc tr−ờng hợp HCV (+) thậm chí < 500
copies/ml.
2. Xây dựng labo sinh học phân tử (SHPT) thực hiện đ−ợc các kỹ thuật
SHPT trong đó có NAT phục vụ cho nội dung sàng lọc máu và đào tạo.
- Đã triển khai đ−ợc kỹ thuật NAT và nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác để
phục vụ cho chẩn đoán và điều trị.
- Đã đào tạo đ−ợc các cán bộ có trình độ chuyên môn thực hiện đ−ợc các kỹ
thuật sinh học phân tử bao gồm bác sỹ, cử nhân, kỹ thuật viên .
Link Download bản DOC
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:

 

vũ trung

New Member
Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết Nối

đặt vấn đề
Ch−ơng I: tổng quan tài liệu
1.1. Lịch sử sàng lọc các tác nhân lây bệnh qua đ−ờng truyền
máu
1.1.1. Trên thế giới
1.1.2. Tại Việt Nam
1.2. Đặc điểm sinh học của HIV, HCV, HBV
1.2.1. Virus gây suy giảm miễn dịch ở ng−ời (HIV)
1.2.2. Virus viêm gan C
1.2.3. Virus viêm gan B
1.3. Các biện pháp bảo đảm an toàn truyền máu, phòng lây
nhiễm HIV, HBV, HCV qua đ−ờng truyền máu
1.3.1. Lựa chọn NCM an toàn
1.3.2. Các kỹ thuật sàng lọc huyết thanh HIV, HBV, HCV cho NCM
1.4. Kỹ thuật sàng lọc NAT
1.4.1. Cơ sở sinh học phân tử
1.4.2. Nguyên lý kỹ thuật
1.4.3. Các giai đoạn kỹ thuật
1.5. Tình hình áp dụng quy trình kỹ thuật sàng lọc NAT để phát
hiện sớm NCM nhiễm HIV, HBV, HCV trên thế giới và tại Việt
Nam
1.5.1. Trên thế giới
1.5.2. Tại Việt Nam
Ch−ơng 2: đối t−ợng và ph−ơng pháp
nghiên cứu
2.1 Đối t−ợng nghiên cứu
2.2 Vật liệu nghiên cứu
2.3 Ph−ơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
2.3.2. Kỹ thuật NAT
2.4. Xử lý số liệu
Ch−ơng III: Kết quả nghiên cứu
3.1. Kết quả nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong
việc nâng cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu
3.1.1. Kết quả xét nghiệm NAT của mẫu trộn 8 để phát hiện đồng
thời cả 3 loại virus HIV, HBV, HCV
3.1.2. Kết quả tỉ lệ không có giá trị trong quá trình xét ngiệm
3.1.3. Số lần chạy có không có giá trị trong quá trình xét nghiệm
3.1.4. Kết quả xác định loại virus bằng Probe đặc hiệu
3.1.5. Kết quả xác định ng−ời cho máu bị nhiễm virus viêm gan C
trong mẫu trộn d−ơng tính
3.1.6. Tỉ lệ nhiễm các virus đ−ợc sàng lọc bằng kỹ thuật NAT trong
nghiên cứu
3.1.7. Kết quả RT-PCR của mẫu bị nhiễm virus HCV
3.2. Xây dựng labo sinh học phân tử (SHPT) thực hiện đ−ợc các
kỹ thuật SHPT trong đó có NAT phục vụ cho nội dung sàng lọc
máu và đào tạo
Ch−ơng IV: Bàn luận
4.1 . Kết quả nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong
việc nâng cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu 4.1.1. Kỹ thuật NAT
4.1.2. Sử dụng trộn 8
4.1.3. Tỉ lệ d−ơng tính khi phát hiện đồng thời cả 3 loại virus HIV,
HBV, HCV (Procleix Ultrio Assay)
4.1.4. Tỉ lệ không có giá trị trong quá trình xét nghiệm
4.1.5. Kết quả xác định loại virus bằng Probe đặc hiệu
4.1.6. Kết quả xác định ng−ời cho máu bị nhiễm virus viêm gan C
trong mẫu trộn d−ơng tính
4.1.7. Tỉ lệ nhiễm các virus đ−ợc sàng lọc bằng kỹ thuật NAT trong
nghiên cứu
4.1.8. Kết quả RT-PCR và ELISA của mẫu bị nhiễm virus HCV
4.2. Xây dựng labo sinh học phân tử (SHPT) thực hiện đ−ợc các
kỹ thuật SHPT trong đó có NAT phục vụ cho nội dung sàng lọc
máu và đào tạo
Kết luận
Kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Danh sách mẫu huyết t−ơng đặt vấn đề
Máu rất quan trọng và cần thiết cho sự sống, nhờ có máu mà nhiều
ng−ời bệnh đã đ−ợc cứu sống. Máu và chế phẩm máu có tầm quan trọng đặc
biệt trong điều trị các bệnh máu cũng nh− cần để cấp cứu các tr−ờng hợp chảy
máu sau đẻ, chảy máu do chấn th−ơng, tai nạn và thảm họa. Máu quan trọng
nh− vậy nh−ng truyền máu có thể gây tai biến cho ng−ời bệnh [18].
An toàn truyền máu là nội dung xuyên suốt trong chiến l−ợc truyền
máu của Quốc gia, trong đó sàng lọc các tác nhân lây nhiễm qua đ−ờng truyền
máu đ−ợc xem là một trong những nội dung then chốt [18].
Các tác nhân gây bệnh có thể đ−ợc truyền từ máu và chế phẩm máu của
ng−ời cho máu (NCM) đã nhiễm bệnh sang ng−ời thân. Căn nguyên gây các
bệnh nhiễm trùng qua đ−ờng máu có rất nhiều [54], [55], tuy nhiên theo
khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới thì 3 virus bắt buộc phải đ−ợc sàng lọc
NCM là HIV, HBV, HCV [58], [102].
Trong sàng lọc NCM hiện nay, ng−ời ta dùng ph−ơng pháp ELISA để
phát hiện các kháng thể (KT) và các kháng nguyên (KN) của virus. Ph−ơng
pháp này có độ tin cậy khá cao, tuy nhiên nh−ợc điểm của ph−ơng pháp là phụ
thuộc rất nhiều vào đáp ứng miễn dịch của mỗi cá thể, giai đoạn cửa sổ còn
khá dài, nguồn NCM ch−a thực sự an toàn. Do vậy, ng−ời ta vẫn gặp những
tr−ờng hợp bệnh nhân (BN) bị lây nhiễm virus do truyền máu nhiễm virus
trong giai đoạn cửa sổ.
Từ năm 1999, kỹ thuật NAT đã phát triển cho phép xác định trực tiếp
HIV-RNA, HBV-DNA, HCV-RNA. Nhờ sử dụng ph−ơng pháp này, ng−ời ta
có thể loại trừ những mẫu máu có virus mà kỹ thuật huyết thanh học không
phát hiện đ−ợc, do đó làm giảm nguy cơ BN bị lây nhiễm virus do truyền máu
trong giai đoạn cửa sổ. Cụ thể rút ngắn giai đoạn cửa sổ từ 80-90 ngày còn 23 ngày cho HCV; 22-30 ngày còn 11 ngày cho HIV; 50-60 ngày xuống còn 34
ngày cho HBV [51].
Hiện nay, một số n−ớc tiên tiến đã áp dụng th−ờng quy kỹ thuật NAT
để sàng lọc HIV, HBV, HCV cho NCM nh− Mỹ, Nhật, Hà Lan, Thụy Điển,
Đức…
Tại Việt Nam, sàng lọc HIV, HBV, HCV cho NCM đã đ−ợc thực hiện
trên phạm vi toàn quốc từ cuối năm 1994. Tuy nhiên do điều kiện kinh phí còn
hạn hẹp nên các biện pháp kỹ thuật sàng lọc NCM còn nhiều hạn chế, vì vậy
giai đoạn cửa sổ huyết thanh còn khá dài nên việc lây nhiễm các bệnh qua
đ−ờng truyền máu là khó tránh khỏi do không phát hiện đ−ợc [19], [20], [30].
Xuất phát từ thực trạng trên chúng tui tiến hành nghiên cứu đề tài này
nhằm mục tiêu:
1. Nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong việc nâng
cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu.
2. Xây dựng labo sinh học phân tử (SHPT) thực hiện đ−ợc các kỹ
thuật SHPT trong đó có NAT phục vụ cho nội dung sàng lọc máu và đào tạo. Ch−ơng I
Tổng quan
1.1. Lịch sử các tác nhân lây bệnh qua đ−ờng truyền máu
1.1.1. Trên thế giới
Năm 1885, Lurman đã thông báo 191 tr−ờng hợp viêm gan sau khi tiêm
chủng vaccine phòng đậu mùa [82]. Năm 1963 Blumberg bắt đầu nghiên cứu
tìm yếu tố huyết thanh để chẩn đoán bệnh này [18].
Năm 1965 Blumberg và cộng sự lần đầu tiên miêu tả KN Australia và
cho rằng KN này có thể đ−ợc phát hiện trong huyết thanh của nhiều BN
Hemophilia đ−ợc truyền máu nhiều lần [42].
Năm 1967 ông đã thành công trong việc dùng KT miễn dịch khuếch tán
trên gel thạch phát hiện KN viêm gan B, ký hiệu Au [18].
Năm 1970, nhà bác học Dane và cộng sự đã phân lập đ−ợc virus viêm
gan B hoàn chỉnh gọi là Dane [17], [18], [37]. Những năm tiếp theo các dấu
ấn miễn dịch khác của virus viêm gan B nh− kháng thể HBs, HBeAg, kháng
thể HBc, kháng thể HBe, HBcAg lần l−ợt đ−ợc phát hiện [18], [69].
Sàng lọc HBsAg cho NCM đ−ợc bắt đầu từ năm 1971, kỹ thuật ban đầu
đ−ợc sử dụng là kỹ thuật khuếch tán trên gel thạch và kỹ thuật điện di. Năm
1975 sử dụng kỹ thuật phóng xạ miễn dịch (RIA) và kỹ thuật miễn dịch
enzym (EIA) để phát hiện HBsAg [71]. Năm 1980 bắt đầu sử dụng ELISA để
sàng lọc HBsAg ở NCM.
Virus viêm gan C đ−ợc Houghton xác định và phân lập năm 1988, đồng
thời ông cũng là ng−ời nghiên cứu thành công trong việc sản xuất kít ELISA
thế hệ thứ nhất để chẩn đoán tình trạng nhiễm HCV [18].
Năm 1989, tác nhân gây viêm gan non A- non B đã đ−ợc sáng tỏ [18].
Các nhà khoa học đã phân lập đ−ợc virus viêm gan C và họ đã lai tạo thành
công dòng vô tính của virus từ E.coli chủng C-300-3 và từ kết quả này họ đã sử dụng KN C-300-3 để phát hiện KT chống HCV trong huyết thanh của BN
viêm gan [65].
Năm 1990 tại Mỹ đã sử dụng kỹ thuật EIA thế hệ 1 (HCV 1.0 EIA) để
phát hiện KT đặc hiệu với KN Protein c100-3 của HCV [73].
Năm 1992 kỹ thuật EIA thế hệ 2 phát triển (HCV 2.0 EIA) có độ nhạy
hơn thế hệ 1 trong việc phát hiện nhiễm trùng HCV cấp và mạn. KN đ−ợc sử
dụng trong kỹ thuật này bao gồm 2 thành phần protein: 1 cấu trúc (c22-3) và 1
không cấu trúc (c33c). Những KT chống lại protein này xuất hiện sớm hơn
c100-3 do đó giai đoạn cửa sổ huyết thanh học đ−ợc rút ngắn so với thế hệ 1 là
10-20 ngày [73].
Năm 1996 kỹ thuật EIA thế hệ 3 (HCV 3.0 EIA) đã phát triển, kỹ thuật
này khác với những thế hệ tr−ớc là bỏ đi phức hợp Protein c100 và thêm phức
hợp Protein NS-5. Do đó giai đoạn cửa sổ huyết thanh học đ−ợc rút ngắn 10
ngày so với thế hệ 2 [41], [50].
Năm 1981, tại Los Angeles (Mỹ) nhà khoa học P. Carini đã phát hiện
một số tr−ờng hợp đồng tính luyến ái nam bị viêm phổi rất nặng [27], [55].
Tháng 6/1981 bác sỹ Michael Goleb đã mô tả bệnh nhân đầu tiên bị hội chứng
suy giảm miễn dịch mắc phải ở ng−ời [36]. Năm 1983 nhà bác học Luc
Montagnier (Pháp) và Gallo (Mỹ) đã phát hiện và chứng minh HIV chính là
căn nguyên gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở ng−ời [55], [80].
Ngày 02/03/1985, Cục quản lý thực và d−ợc phẩm Hoa Kỳ, viết tắt là
FDA (Food and Drug Administration) cho phép sử dụng kỹ thuật EIA đầu tiên
để phát hiện kháng thể HIV-1 [39], [44]. Năm 1987 tại Mỹ bắt đầu sử dụng kỹ
thuật thấm miễn dịch (Western Blot - WB) để phát hiện kháng thể HIV. Năm
1996 FDA bắt đầu sử dụng kỹ thuật phát hiện KN p24 của virus HIV-1 để
sàng lọc NCM.
Từ năm 1999 FDA đã cho phép sử dụng kỹ thuật NAT để phát hiện trực
tiếp RNA của virus HCV và HIV-1 tại Mỹ [45], [68]. Ph−ơng pháp này làm tăng c−ờng độ an toàn của máu, có thể phát hiện đ−ợc nhiễm trùng virus cấp
tính trong giai đoạn cửa sổ mà tại thời điểm đó ph−ơng pháp huyết thanh học
không phát hiện đ−ợc. Hiện nay, nhiều n−ớc trên thế giới đã áp dụng kỹ thuật
NAT để sàng lọc các virus ở NCM làm giảm tối đa sự lan truyền virus qua
đ−ờng truyền máu, nhờ đó tỉ lệ lây nhiễm virus đã giảm đi rất nhiều.
1.1.2. Tại Việt Nam
Năm 1970 KN Australia gọi là KN viêm gan B xuất hiện trên 1 BN nữ
thiếu máu tan máu tự miễn đ−ợc truyền máu nhiều lần. Từ năm 1970 Khoa
Huyết học-Truyền máu BV Bạch Mai và một số nơi trên Việt Nam bắt đầu
tiến hành kiểm tra kháng nguyên Au trên NCM nh−ng cũng mới chỉ sử dụng
kỹ thuật khuếch tán trên gel thạch.
Năm 1984 chúng ta bắt đầu sử dụng kỹ thuật ELISA để sàng lọc NCM
ở một số trung tâm truyền máu lớn.
Ph−ơng pháp và kỹ thuật phát hiện KN Au có rất nhiều [18], KN đ−ợc
phát hiện có thể chính là virus hay là những thành phần liên quan chặt chẽ
với virus viêm gan, đơn giản nhất là kỹ thuật miễn dịch khuếch tán trên gel
thạch. Huyết thanh cần xác định và kháng thể Australia đ−ợc đặt đối diện
trong 2 ô. Nếu huyết thanh BN có chứa KN thì sẽ hình thành 1 cung tủa nơi
gặp nhau của 2 huyết thanh.
Ngoài ra còn có kỹ thuật kết hợp bổ thể, ng−ng kết bị động ng−ợc, miễn
dịch phóng xạ, th−ờng dùng là điện di miễn dịch khuếch tán.
Kỹ thuật chủ yếu dùng ở Việt Nam thời đó là kỹ thuật khuếch tán miễn
dịch Ouchterlony và miễn dịch khuếch tán điện di của Repars cải tiến. Kỹ
thuật sử dụng sàng lọc NCM là kỹ thuật điện di khuếch tán vì có −u điểm là
thời gian nhanh và sàng lọc đ−ợc nhiều, tuy nhiên độ nhạy ch−a cao vì thế bỏ
sót những KN yếu.
Giáo s− Bạch Quốc Tuyên và cộng sự [31] đã chỉnh lý kỹ thuật kết hợp
bổ thể, kỹ thuật ng−ng kết bị động ng−ợc để tăng độ nhạy của sàng lọc nh−ng các kỹ thuật đó chỉ dùng vào một số tr−ờng hợp nghiên cứu vì tốn kém kháng
thể nhiều và không thuận lợi khi xét nghiệm hàng loạt.
Tại Việt Nam, việc sàng lọc cả ba loại virus này mới đ−ợc thực hiện từ
đầu những năm 90 của thế kỷ tr−ớc và cho đến nay vẫn tỏ ra hữu hiệu trong
việc ngăn chặn sự lan truyền bệnh dịch. Từ năm 1996 trở về đây đã có thống
kê b−ớc đầu về tình hình lây nhiễm các virus qua đ−ờng truyền máu [18].
Hiện nay phần lớn các trung tâm truyền máu n−ớc ta đã sử dụng kỹ
thuật ELISA với thế hệ kít thứ 3 (phát hiện đ−ợc cả hai loại kháng thể HIV
loại IgG và IgM ) và thế hệ thứ 4 (phát hiện cả KN HIV p24, hai loại kháng
thể HIV IgG, IgM). Do vậy có thể phát hiện đ−ợc NCM bị nhiễm HIV trong
vòng từ 14 đến 38 ngày.
Năm 1997 các tác giả n−ớc ngoài đã nghiên cứu áp dụng kỹ thuật PCR
phát hiện HIV-RNA, HCV-RNA, HBV-DNA để sàng lọc NCM [18]. Tuy
nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi phải có trình độ chuyên môn cao, giá trang thiết bị
đắt tiền, điều kiện XN ngặt cùng kiệt và giá thành cho một XN còn khá cao, thời
gian XN đòi hỏi lâu, do vậy việc tiến hành kỹ thuật PCR sàng lọc NCM ở Việt
Nam vẫn ch−a đ−ợc ứng dụng để sàng lọc HIV, HCV, HBV.
1.2. Đặc điểm sinh học của HIV, HCV, HBV
1.2.1. Virus gây suy giảm miễn dịch ở ng−ời (HIV)
1.2.1.1 Cấu trúc HIV
HIV thuộc nhóm Retroviridae, thuộc họ Lentivirus, có kích th−ớc từ
100-200 nm. D−ới kính hiển vi điện tử cấu trúc HIV gồm 3 phần: [18], [55],
[101]
- Lớp vỏ (envelop): Đ−ợc cấu tạo bởi lớp lipid kép và các glycoprotein
màng gồm gp 110, gp 120, gp 40, gp 41.
- Phần nhân: Bao gồm các Protein là p24, p17, p18, p51, p56. Các
protein này tạo nên khung cấu trúc của virus.
- Các enzym: Qua sàng lọc 9.392 mẫu huyết t−ơng bằng kỹ thuật NAT, chúng tui có thể
rút ra một số kết luận sau:
1. Nghiên cứu hiệu quả sử dụng kỹ thuật NAT trong việc nâng cao tính
an toàn sinh học của các chế phẩm máu.
Kỹ thuật NAT là kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy tốt hơn so với kỹ thuật
ELISA:
- Trong 9.392 mẫu huyết t−ơng đ−ợc sàng lọc âm tính với kỹ thuật ELISA đã
phát hiện ra một tr−ờng hợp nhiễm virus HCV.
- Kỹ thuật NAT có thể phát hiện đ−ợc tr−ờng hợp HCV (+) thậm chí < 500
copies/ml.
2. Xây dựng labo sinh học phân tử (SHPT) thực hiện đ−ợc các kỹ thuật
SHPT trong đó có NAT phục vụ cho nội dung sàng lọc máu và đào tạo.
- Đã triển khai đ−ợc kỹ thuật NAT và nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác để
phục vụ cho chẩn đoán và điều trị.
- Đã đào tạo đ−ợc các cán bộ có trình độ chuyên môn thực hiện đ−ợc các kỹ
thuật sinh học phân tử bao gồm bác sỹ, cử nhân, kỹ thuật viên .
Link Download bản DOC
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:

Em Thank anh nhiều ạ
 

Các chủ đề có liên quan khác

Top