Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết Nối
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.......................................................... vii
DANH MỤC HÌNH..................................................................................... ix
DANH MỤC BẢNG.................................................................................... xii
MỞ ĐẦU....................................................................................... ............. 1
1. Đặt vấn đề....................................................................................... ........ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu................................................................................ 2
4. Những đóng góp mới của luận án............................................................ 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án.................................... 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................. ......... 4
1.1. Nấm Lecanicillium lecanii .................................................................. 4
1.2. Chitinase .............................................................................................. 5
1.2.1. Nguồn gốc của chitinase..................................................................... 6
1.2.2. Phân loại chitinase.............................................................................. 7
1.2.3. Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase................................... 9
1.2.4. Cơ chế phản ứng của chitinase........................................................... 12
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase............................... 14
1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase.............. 16iv
1.3. Ứng dụng của nấm L. lecanii và chitinase......................................... 18
1.3.1. Trong lĩnh vực nông nghiệp và bảo vệ môi trường............................ 18
1.3.2. Trong lĩnh vực y học.......................................................................... 22
1.3.3. Trong lĩnh vực công nghệ sinh học.................................................... 23
1.4. Một số nghiên cứu về gen và biểu hiện gen mã hóa chitinase......... 24
1.4.1. Trên thế giới....................................................................................... 24
1.4.2. Ở Việt Nam......................................................................................... 28
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.......................................... 31
2.1. Vật liệu và hóa chất............................................................................. 31
2.1.1. Chủng giống....................................................................................... 31
2.1.2. Thiết bị............................................................................................... 31
2.1.3. Hóa chất............................................................................................. 31
2.1.4. Dung dịch và đệm.............................................................................. 32
2.1.5. Môi trường nuôi cấy........................................................................... 32
2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................... 33
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy........................................................................ 33
2.2.2. Phương pháp hóa sinh........................................................................ 35
2.2.3. Tinh sạch chitinase............................................................................. 37
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính và độ
bền của chitinase tự nhiên và tái tổ hợp....................................................... 39
2.2.5. Các phương pháp sinh học phân tử.................................................... 42
2.2.6. Phương pháp thử nghiệm................................................................... 46
2.2.7. Xử lý số liệu....................................................................................... 48
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiv
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..................... 49
3.1. Sàng lọc, kiểm tra và khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase
từ nấm L. lecanii......................................................................................... 49
3.1.1. Sàng lọc chủng nấm L. lecanii sinh tổng hợp chitinase cao............... 49
3.1.2. Kiểm tra chủng nấm L. lecanii 43H dựa vào đoạn gen 28S rRNA... 49
3.1.3. Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase........................................ 52
3.2. Tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của chitinase từ chủng
nấm L. Lecanii 43H..................................................................................... 57
3.2.1. Tinh sạch chitinase............................................................................. 57
3.2.2. Đánh giá tính chất lý hóa của chitinase từ chủng nấm L. lecanii
43H............................................................................................................... 59
3.3. Nhân dòng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H...... 66
3.4. Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của rChit trong
nấm men P. pastoris X33............................................................................ 70
3.4.1. Thiết kế plasmid pPChit biểu hiện gen Chit trong nấm men............. 70
3.4.2. Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men P. pastoris................. 71
3.4.3. Tinh sạch rChit................................................................................... 76
3.4.4. Đánh giá tính chất lý hóa của rChit từ nấm men P. pastoris X33...... 78
3.5. Thử nghiệm khả năng ức chế rệp và nấm bệnh của chitinase và
bào tử từ nấm L. lecanii............................................................................. 84
3.5.1. Ảnh hưởng của chitinase tới sự phát triển của nấm bệnh hại cây
trồng............................................................................................................. 84
3.5.2. Ảnh hưởng của rChit tới khả năng phát triển của rệp........................ 86vi
3.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của sợi nấm........... 87
3.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm...... 88
3.5.5. Khả năng diệt rệp của chủng nấm L. lecanii 43H.............................. 89
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................... 92
1. KẾT LUẬN.............................................................................................. 92
2. KIẾN NGHỊ............................................................................................. 92
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN... 93
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................... 94
DANH MỤC PHỤ LỤC............................................................................. 113
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phivii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tiếng Anh Tiếng Việt
BLAST Basic local alignment search tool Phần mềm so sánh trình tự
bp Base pair Cặp bazơ
cDNA Complement DNA DNA tạo ra từ mRNA
Chit Gene encoding chitinase Gen mã hóa chitinase
CMC Cacboxyl methyl cellulose Cacboxyl methyl cellulose
DEPC Diethylpyrocarbonate Diethylpyrocarbonate
DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic
DNase Deoxyribonuclease Enzyme thủy phân DNA
dNTPs 2-Deoxynucleoside 5-
triphosphate
Các nucleotide
ĐC Control Đối chứng
IPTG Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside
Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid Axit ethylenediamine tetraacetic
EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide
kb Kilo base Kilo base
kDa Kilo Dalton Kilo Dalton
M Marker Thang chuẩn
OD Optical density Mật độ quang
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen
RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleicviii
RNase Ribonuclease Enzyme thủy phân RNA
RT-PCR Reverse transcription polymerase
chain reaction
Phản ứng khuếch đại gen
rChit Recombinante chitinase Chitinase tái tổ hợp
SDSPAGE
Sodium dodecyl sulfate
Polyacrylamide gel
electrophoresis
Điện di protein
Taq Thermus aquaticus Thermus aquaticus
TBE Tris boric acid EDTA Tris boric acid EDTA
TE Tris EDTA Tris EDTA
TEMED N,N,N,N-
Tetramethylethylenediamine
N,N,N,N-
Tetramethylethylenediamine
v/v Volume/volume Thể tích/thể tích
w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiix
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc bậc 2 của chitinase từ nấm C. immitis........................... 10
Hình 1.2. Cấu trúc của chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp. A-471 ............. 11
Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của chitinase B từ vi khuẩn S. mecescens........... 12
Hình 1.4. Cơ chế thủy phân β-chitin bởi chitinase A từ vi khuẩn
B. circulans................................................................................................... 13
Hình 2.1. Đường chuẩn nồng độ N-acetyl glucosamine theo phương pháp
Miller............................................................................................................ 36
Hình 2.2. Các bước tinh sạch chitinase........................................................ 38
Hình 2.3. Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết thanh bò theo
Bradford........................................................................................................ 39
Hình 2.4. Đồ thị Lineawever-Burk.............................................................. 40
Hình 2.5. Sơ đồ mô tả vị trí gắn của gen Chit vào genome của nấm men
P. pastoris X33............................................................................................. 46
Hình 3.1. Hoạt tính chitinase của 8 chủng nấm L. lecanii........................... 49
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng nấm
L. lecanii 43H; Sản phẩm Plasmid và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng
XhoI và XbaI...................... .......................................................................... 50
Hình 3.3. Trình tự đoạn gen 28S rRNA từ chủng nấm L. lecanii 43H;
Cây phân loại trình tự gen 28S rRNA từ chủng nấm L. lecanii 43H với
các loài khác................................................................................................. 51
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ nuôi cấy đến khả
năng sinh tổng hợp chitinase ....................................................................... 52
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ chitin huyền phù và nguồn nitơ đếnx
khả năng sinh tổng hợp chitinase ................................................................ 54
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và pH nuôi cấy lên khả năng
sinh tổng hợp chitinase ................................................................................ 55
Hình 3.7. Hình ảnh điện di SDS-PAGE của chitinase tinh sạch từ chủng
nấm L. lecanii 43H và hoạt tính chitinase của các phân đoạn qua cột
DEAE-Sephadex A-50 trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất chitin huyền phù
0,5%.............................................................................................................. 58
Hình 3.8. Nhiệt độ và pH thích hợp của chitinase ...................................... 60
Hình 3.9. Độ bền nhiệt và độ bền pH của chitinase .................................... 61
Hình 3.10. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính
chitinase ....................................................................................................... 64
Hình 3.11. Phân tích TLC các sản phẩm thủy phân chitin bởi chitinase....... 66
Hình 3.12. Kết quả nhân dòng gen Chit từ DNA hệ gen............................. 66
Hình 3.13. Trình tự gen Chit và amino acid suy diễn từ L. lecanii 43H..... 67
Hình 3.14. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự gen Chit của chủng
L. Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank...................................... 68
Hình 3.15. Kết quả nhân dòng gen Chit từ mRNA...................................... 69
Hình 3.16. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự amino acid của rChit
từ L. Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank.................................. 70
Hình 3.17. Kết quả thiết kế cấu trúc vector biểu hiện pPChit..................... 70
Hình 3.18. Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu hiện rChit trong P. pastoris
X33............................................................................................................... 71
Hình 3.19. Khả năng sinh tổng hợp rChit của chủng tái tổ hợp khi được
cảm ứng ở các nồng độ methanol khác nhau................................................ 73
Hình 3.20. Khả năng sinh tổng hợp rChit ở các khoảng thời gian khác
nhau.............................................................................................................. 74
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phixi
Hình 3.21. Điện di SDS-PAGE của rChit tinh sạch từ P. pastoris X33...... 77
Hình 3.22. Nhiệt độ và pH thích hợp của rChit........................................... 79
Hình 3.23. Độ bền nhiệt và độ bền pH của rChit......................................... 80
Hình 3.24. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính
rChit ............................................................................................................. 83
Hình 3.25. Ức chế sự phát triển của nấm bệnh F. oxysporum và R. solani
bởi chitinase ................................................................................................. 86
Hình 3.26. Sợi nấm của R. solani và F. oxysporum được xử lý với nước
và với chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H.............................................. 86
Hình 3.27. Hỗn hợp chitin của rệp được xử lý với nước và rChit từ nấm
men P. pastoris X33 ................................................................................... 87
Hình 3.28. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ nẩy mầm của
bào tử nấm L. lecanii 43H ........................................................................... 89
Hình 3.29. Mô hình lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm và
biểu đồ thể hiện khả năng diệt rệp bằng bào tử của chủng nấm L. lecanii
43H .............................................................................................................. 91xii
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Các môi trường thí nghiệm.......................................................... 32
Bảng 2.2. Các điều kiện nuôi cấy chủng nấm L. lecanii 43H sinh tổng
hợp chitinase................................................................................................. 34
Bảng 2.3. Thành phần gel cô và gel tách.................................................... 38
Bảng 2.4. Quan hệ giữa 1/ và 1/V........................................................... 40
Bảng 2.5. Các cặp mồi sử dụng................................................................... 44
Bảng 2.6. Thành phần PCR.......................................................................... 44
Bảng 3.1. Kết quả tinh sạch chitinase từ chủng nấm L .lecanii 43H........... 58
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA đến hoạt tính chitinase... 62
Bảng 3.3. Hoạt tính chitinase của các dòng nấm men
P. pastoris X33/pPChit tái tổ hợp............................................................... 72
Bảng 3.4. Hoạt tính rChit ở các môi trường biểu hiện khác nhau................ 73
Bảng 3.5. Kết quả tinh sạch rChit từ nấm men P. pastoris X33.................. 76
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính rChit... 81
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, các biện pháp sinh học như sử dụng nấm kí sinh
hay các loài thiên địch trong việc phòng chống sâu hại cây trồng đang được quan
tâm nghiên cứu. Các chế phẩm sinh học từ nấm ra đời đã được sử dụng để diệt
trừ các loại sâu, nhện, bọ trĩ và bọ cánh phấn. Tuy nhiên, việc sử dụng biện pháp
vi nấm kí sinh đối với rệp là vấn đề đang còn mới mẻ trong nông nghiệp. Cùng
với sự phát triển kinh tế - xã hội, con người ngày càng có nhu cầu sử dụng các
sản phẩm rau quả sạch, hạn chế mức thấp nhất việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa
học dùng trong sản xuất rau, củ quả. Các loài thiên địch như nấm kí sinh côn
trùng gây hại cây trồng đã được sử dụng, do chúng có khả năng phát tán rất
nhanh và chỉ diệt các loài côn trùng có hại mà không ảnh hưởng tới nguồn nước,
môi trường sinh thái và sức khỏe con người, vật nuôi.
Nấm kí sinh côn trùng thường tác động đến những loại mô nhất định như
tuyến mỡ và các mô khác bị hòa tan là do các enzyme (chitinase, protease) của
nấm. Trong quá trình tác động lên côn trùng, nấm tiết ra các enzyme càng mạnh
thì tốc độ hủy hoại và tiêu diệt côn trùng gây bệnh càng nhanh, tiết kiệm được
thời gian. Dựa vào đặc tính này của nấm, việc tạo ra một lượng lớn enzyme đặc
biệt là chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học là rất cần thiết.
Chitinase là enzyme thuỷ phân chitin thành các đơn phân N-acetyl
glucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết
β-1,4-glucoside giữa C1 và C4 của 2 phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau
trong chitin. Chitinase có ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nông nghiệp, y học.
Từ thực tế trên, việc nghiên cứu đặc tính chitinase và qui trình tạo ra chitinase
cao góp phần làm tăng hiệu quả của chế phẩm bào tử nấm là rất cần thiết.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tui tiến hành lựa chọn đề tài luận án:
“Nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase tái tổ hợp
từ chủng nấm Lecanicillium lecanii”.2
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu chung
Tinh sạch và đánh giá được tính chất hóa lý của chitinase chiết rút từ nấm
L. lecanii và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong nấm men Pichia pastoris
X33 phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm diệt rệp và nấm hại cây trồng.
2.2. Mục tiêu cụ thể
(i) Tuyển chọn được chủng nấm L. lecanii có khả năng sinh tổng hợp chitinase
cao. Tinh sạch và đánh giá được tính chất hóa lý của chitinase chiết rút từ chủng
nấm đã tuyển chọn;
(ii) Xác định được trình tự nucleotide của gen mã hóa chitinase từ chủng nấm
L. lecanii đã tuyển chọn;
(iii) Biểu hiện được chitinase tái tổ hợp của gen mã hóa phân lập được từ chủng
nấm L. lecanii tuyển chọn trong nấm men Pichia pastoris X33;
(iv) Tinh sạch, khảo sát tính chất hóa lý của chitinase tái tổ hợp và đánh giá vai
trò diệt rệp, nấm bệnh hại cây trồng của chitinase.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm L. lecanii sinh chitinase cao và khảo sát
điều kiện sinh tổng hợp chitinase.
(2) Nghiên cứu tinh sạch và phân tích tính chất lý hóa của chitinase tự nhiên.
(3) Nghiên cứu tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa chitinase phân lập từ
chủng nấm đã tuyển chọn
(4) Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chitinase, tinh sạch và nghiên cứu một số
tính chất lí hóa của chitinase tái tổ hợp.
(5) Nghiên cứu khả năng ức chế của chitinase đối với sự phát triển một số loài
nấm bệnh và rệp hại cây trồng.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi3
4. Những đóng góp mới của luận án
4.1. Luận án đã tinh sạch, đánh giá một số tính chất lý hóa và chứng minh được
khả năng ức chế sự phát triển sợi nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia
solani của exochitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H. Bước đầu đánh giá được
khả năng diệt được rệp của bào tử nấm L. lecanii.
4.2. Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống từ phân lập, tách dòng, biểu
hiện gen chitinase và đánh giá khả năng diệt rệp hại cây trồng. Cụ thể là: (i) Gen
Chit từ chủng nấm L. lecanii 43H được phân lập, tách dòng thành công và xác
định được trình tự; đoạn gen Chit được đăng kí trong GenBank với mã số
JX665045. (ii) Biểu hiện thành công gen Chit mã hóa endochitinase thuộc họ
18 glycosyl hydrolase trong nấm men P. pastoris X33 cho hoạt tính cao. Tinh
sạch được chitinase tái tổ hợp và đánh giá được một số tính chất lý hóa cơ bản.
(iii) Chứng minh được rChit có khả năng làm suy giảm lớp vỏ chitin của rệp.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
5.1. Về khoa học
i) Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về phương pháp
tinh sạch chitinase, các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase và khả năng
diệt nấm bệnh của chitinase từ chủng nấm L. lecanii.
ii) Cung cấp những thông tin về gen mã hóa chitinase ở chủng nấm L. lecanii
43H, chitinase tái tổ hợp và các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính rChit và khả năng
thủy phân lớp vỏ rệp của rChit.
iii) Cung cấp thông tin về khả năng diệt rệp của bào tử và đặc điểm sinh học của
nấm L. lecanii.
5.2. Về thực tiễn
Những kết quả đánh giá toàn diện từ khâu lựa chọn điều kiện sinh tổng hợp
chitinase, tinh sạch và xác định tính chất lý hóa, khả năng diệt nấm bệnh và rệp
của chitinase, cũng như quá trình nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase
làm căn cứ để đánh giá và ứng dụng của chitinase với bào tử nấm trong quá trình
tạo chế phẩm sinh học diệt rệp của chủng nấm L. lecanii.4
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nấm Lecanicillium lecanii
Lecanicillium là chi nấm kí sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi
Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae. Chi nấm
Lecanicillium gồm nhiều loài như: Lecanicillium lecanii, L. attenuatum,
L. longisporum, L. muscarium hay L. nodulosum. Nấm L. lecanii trước đây
được gọi là Verticillium lecanii. Ngày nay, L. lecanii được biết là một hình thức
sinh sản vô tính trong nhóm trùng thảo Cordyceps confragosa [124].
Nấm Lecanicillium có khả năng kí sinh tự nhiên và giết chết nhiều loại côn
trùng như rệp, ruồi trắng, bộ cánh đều, bộ cánh cứng, bộ cánh thẳng, bướm [22],
[47], [49], [60], [93]. Cơ chế diệt côn trùng của Lecanicillium dựa trên sự tiếp
xúc trực tiếp của bào tử với côn trùng. Sau khi bám vào cơ thể côn trùng, các bào
tử nảy mầm và tạo thành sợi nấm đâm sâu vào các khoang trong cơ thể, tại đây
chúng sinh trưởng và phá hủy mô. Sau đó, sợi nấm sẽ phát triển xuyên qua các
lớp biểu bì của côn trùng. Trong điều kiện độ ẩm cao, bào tử được tạo thành bên
ngoài cơ thể côn trùng và có thể lây truyền bệnh cho côn trùng khác [95].
Dựa vào đặc tính diệt côn trùng của nấm L. lecanii, các nghiên cứu hiện
nay đi theo hai hướng chính là: đi sâu khai thác đặc điểm sinh học của chế phẩm
bào tử nấm L. lecanii sử dụng trong kiểm soát côn trùng; và tìm hiểu vai trò của
hệ enzyme (chitinase, protease, lipase) hay độc tố do nấm L. lecanii sinh ra
trong quá trình diệt côn trùng.
Các nghiên cứu về chitinase từ nấm Lecanicillium đã được các tác giả
nghiên cứu theo các hướng chính là (i) tối ưu quá trình sinh tổng hợp chitinase;
(ii) tinh sạch và xác định khả năng thủy phân lớp vỏ trứng của côn trùng và (iii)
nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu
chỉ dừng lại ở từng khâu nghiên cứu riêng lẻ và hoạt tính chitinase sinh ra còn rất
thấp. Mặt khác, chủng nấm L. lecanii nói riêng và các vi sinh vật nói chung
thường hay xuất hiện các biến dị và quá trình sinh chitinase luôn thay đổi ở các
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi5
điều kiện môi trường, dẫn tới tính chất của chitinase sinh ra từ các chủng nấm là
khác nhau. Do vậy, quá trình nghiên cứu đầy đủ về chitinase từ bước lựa chọn
điều kiện môi trường thích hợp cho việc nâng cao khả năng tổng hợp chitinase
đến tinh sạch và xác định các điều kiện ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme; cũng
như việc nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii
trong nấm men để nâng cao khả năng biểu hiện, sau đó thử nghiệm hoạt tính của
chitinase và chế phẩm bào tử trong quá trình diệt rệp và nấm bệnh hại cây trồng
là hướng nghiên cứu cần thiết để nâng cao hiệu quả của chế phẩm sinh học.
1.2. Chitinase
Chitinase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng phân cắt liên kết
β-1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp
nhau trong phân tử chitin, chitobiose và chitotriose. Chitinase được chia thành 2
loại chính là endochitinase (EC 3.2.1.14) và exochitinase. Exochitinase gồm
chitobiosidase (EC 3.2.1.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC 3.2.1.30). Mỗi
loại enzyme tham gia vào thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ sự
phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn
toàn tạo các đơn phân N-acetyl glucosamine.
Cơ chất thủy phân của chitinase thường là chitin. Chitin là một
polysacharide mạch thẳng không cuộn xoắn, có màu trắng, cứng và không đàn
hồi được tạo nên từ các đơn phân N-acetyl glucosamine thông qua liên kết
1,4-β glycoside. Chitin là chất hữu cơ đứng thứ 2 trong tự nhiên sau cellulose.
Trong tự nhiên, chitin gồm 3 dạng cấu trúc là α, β và γ-chitin. Trong đó,
dạng α-chitin có cấu trúc đối song song gồm các chuỗi polysaccharide xếp xen
kẽ nhau và là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên. α-chitin là thành phần cấu tạo
nên bộ xương ngoài của côn trùng, giáp xác, nhuyễn thể và vách tế bào của nấm.
Dạng β-chitin thường hiếm hơn, có cấu trúc song song gồm các chuỗi
polysaccharide xếp xen kẽ nhau và tồn tại ở dạng liên kết với protein. Dạng
γ-chitin được tạo nên từ 2 chuỗi song song xen kẽ với 1 chuỗi đối song song.
Dạng γ-chitin thường tồn tại ở các loài nấm [57].6
Chitin nguyên bản thường có màu trắng đục, mềm dẻo, đàn hồi và khá dai
nên khó bị thủy phân. Trong động vật chân đốt, chitin được sửa đổi và liên kết
với protein giống như một ma trận và tạo thành bộ xương ngoài. Ở dạng tinh
khiết chitin thường dai, nhưng khi tham gia vào thành phần cấu tạo ở hầu hết các
động vật không xương chitin lại là nguyên liệu tổng hợp. Trong vỏ giáp xác và
động vật thân mềm, chitin kết hợp với canxi cacbonat tạo thành hỗn hợp bền
vững hơn. Sự kết hợp này giúp cho chitin cứng và đặc hơn so với dạng tinh
khiết, đồng thời bền vững và ít giòn hơn so với canxi cacbonat [27].
1.2.1. Nguồn gốc của chitinase
Chitinase được tổng hợp từ rất nhiều nguồn sinh vật khác nhau trong tự
nhiên như thực vật, động vật và vi sinh vật. Trong đó, vi sinh vật được xem là
nguồn cung cấp chitinase nhiều hơn so với động vật và thực vật.
Chitinase được sinh ra từ vi sinh vật gồm 2 loại là endochitinase và
exochitinase. Nấm mốc là một trong những nhóm vi sinh vật có khả năng sinh
tổng hợp chitinase mạnh nhất. Các loài nấm mốc thuộc các chi như Trichoderma
[32], [37]; Glicocladium; Metharhizium [61], [128]; Beauveria, Lecanicillium
[23], [42], [91]; Aspergillus [145]; Penicillium [80] đã được nghiên cứu là có
khả năng sinh tổng hợp chitinase mạnh. Bên cạnh đó, vi khuẩn cũng được xem là
đối tượng có khả năng sinh chitinase khá phong phú. Chitinase được sinh ra từ vi
khuẩn thuộc các chi như Serratia [148], Aeromonas [139], Arthrobacter [100],
Micrococcus [19], Clostridium, Bacillus [24], [137] và đặc biệt là nhóm
Streptomycetes [72], [144].
Chitinase được tạo ra từ vi sinh vật có vai trò phân giải chitin trong tự
nhiên. Thành tế bào của nấm sợi và nấm men được tạo nên từ các phân tử chitin
và các hợp chất khác (manan, glucan, cellulose). Tuy nhiên, cấu trúc chitin này
so với chitin trong tự nhiên có sự khác nhau về tính không tan, kích thước, độ
nhớt, độ phức tạp phân tử và tính không đồng nhất nên không bị thủy phân bởi
chitinase của cơ thể.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi7
Ở thực vật, chitinase có mặt chủ yếu trong thân, củ, hạt và hoa của các loài
như khoai tây, thuốc lá, đậu, cà chua, ngô, khoai lang và đậu Hà Lan. Chitinase
được sinh ra trong giai đoạn phát triển sớm của cơ thể có vai trò tham gia vào
quá trình hình thành và phát triển phôi. Chitinase trong cây được sinh ra khi có
sự kích thích của mầm bệnh giúp cây chống lại sự tấn công của các nấm kí sinh
gây bệnh. Ở thực vật, chitinase chủ yếu thuộc loại endochitinase và có kích
thước nhỏ hơn so với các nhóm khác.
Bên cạnh đó, hệ chitinase có thể được thu nhận từ một số động vật nguyên
sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật
không xương như ruột khoang, giun tròn, chân đốt, thân mềm (ví dụ trong dịch
ruột của ốc sên Helix aspersa). Đối với động vật có xương sống, chitinase được
tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ,
trong dịch dạ dày của các loài chim, thú ăn sâu bọ [89], [90].
Ngoài ra, hệ chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong
suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm
thay vỏ, lột da. Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng cuticun của chúng trong
quá trình biến thái hay lột xác.
1.2.2. Phân loại chitinase
Theo danh pháp quốc tế, Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh
học phân tử quốc tế xếp chitinase vào phân lớp 3 (hydrolase, các enzyme xúc tác
phản ứng thủy phân), tổ 2 (glycosidase, thủy phân các liên kết glycoside), nhóm
1 (thủy phân liên kết O- và S-glycoside) (International Union of Biochemistry
and Molecular Biology, 1992;
Chitinase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo quan
điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ chitinase được xếp thành
các nhóm khác nhau. Dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất, chitinase được chia
thành 2 dạng: dạng 1 là endochitinase (EC.3.2.1.14), dạng 2 là exochitinase gồm
2 loại là chitobiosidase (EC.3.2.1.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC.3.2.1.30).8
Endochitinase thủy phân điểm cắt bên trong của phân tử chitin và chitodextrin
tạo ra các phân tử có khối lượng thấp như chitotriose, chitotetraose và diacetyl
chitobiose. Chitobiosidase xúc tác quá trình phân cắt các vi sợi chitin ở đầu
không khử giải phóng ra các diacetyl chitobiose. N-acetylglucosaminidase phân
cắt các oligomer (sản phẩm của sự thủy phân bởi endochitinase và
chitobiosidase) để tạo ra các đơn phân N-acetyl glucosamine [106].
Dựa vào cấu trúc phân tử, chitinase được sắp xếp vào 3 họ là glycosyl
hydrolase 18, 19 và 20 [52]. Họ glycosyl hydrolase 18 là họ chitinase lớn nhất
với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm
thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus. Họ này bao gồm
chủ yếu là chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase,
chitobiase và N-acetyl glucosaminidase. Các chitinase này hoạt động thông qua
các cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản
phẩm β-anomer. Các chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 18 rất nhạy cảm với
chất ức chế mạnh allosamidin [73]. Các chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 18
được tổng hợp từ Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma
harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens. Họ glycosyl hydrolase
19 có hơn 130 chi, chủ yếu ở thực vật (như cà chua, cải, đậu Hà lan); xạ khuẩn
Streptomyces griceus và một số vi khuẩn (Haemophillus influenzae). Họ
glycosyl hydrolase 19 có cấu trúc giống với lysozyme và chitosanase, chúng có
cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế dịch chuyển.
Chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 19 từ vật bậc cao thì không bị ức chế bởi
allosamidin [73]. Họ glycosyl hydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine
acetyl hexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người.
Dựa vào trình tự amino acid đầu N, sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện,
peptide nhận biết và vùng cảm ứng, chitinase được phân chia thành 5 nhóm: là
nhóm I, II, III, IV và V. Nhóm I là những đồng phân enzyme trong phân tử có
đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc
prolin ở đầu cacboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi9
trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt
động xúc tác. Nhóm II là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc
tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptide nhận biết ở đầu C, có trình tự
amino acid tương tự chitinase nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, vi
khuẩn, chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài. Nhóm III là trình tự
amino acid hoàn toàn khác với nhóm I và II. Nhóm IV là những đồng phân
enzyme chủ yếu có ở lá của cây 2 lá mầm, 41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc
tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein
nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I. Nhóm V
được nhận biết dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn
chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở
thực vật bậc cao [106].
1.2.3. Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase
1.2.3.1. Cấu trúc bậc một và bậc hai của chitinase
Các chitinase được sinh ra từ các cơ thể khác nhau có thành phần cấu tạo và
cấu trúc khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối
lượng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi
polypeptide. Ở vi khuẩn, chitinase từ B. cereus có khối lượng 37 kDa được mã
hóa bởi 360 amino acid [53], từ Streptomyces sp. M-20 có khối lượng 20 kDa
[72], từ Streptomyces griserus HUT 6039 có khối lượng 49 kDa [132].
Ở nấm, chitinase từ Trichoderma atroviride có khối lượng phân tử 33 kDa
mã hóa bởi 321 amino acid [88]. Chitinase từ Coccidioides immitis gồm 427
amino acid [135]. Chitinase từ Clonostachys rosea (Crch1) có khối lượng
45 kDa được mã hóa bởi 426 amino acid, chứa 1 tín hiệu peptide với 22 amino
acid [43]. Chitinase từ L. psalliotae có khối lượng phân tử là 45 kDa, được mã
hóa từ 423 amino acid gồm 1 tín hiệu peptide dài 20 amino acid [42]. Zhu và
đồng tác giả (2008) đã nghiên cứu về cấu trúc của endochitinase từ L. lecanii
thuộc họ glycosyl hydrolase 18 là một chuỗi polypeptide cấu tạo bởi các dải α, β
và các vùng nối. Chitinase này là một protein có tính acid, giá trị pI là 5,5510
[151]. Chitinase từ L. lecanii có khối lượng phân tử là 40,93 kDa (CHI1) được
mã hóa bởi 370 amino acid và 45,95 kDa (CHI2) được mã hóa bởi 423 amino
acid [150].
Thomas và đồng tác giả (2000) đã nghiên cứu chi tiết về cấu trúc bậc 2 của
chitinase từ nấm C. immitis thuộc họ glycosyl hydrolase 18. Chitinase này là một
chuỗi polypeptide gồm 8 dải β (kí hiệu từ S1-S8) tạo thành lõi của enzyme và
8 dải α (kí hiệu từ H2-H9). Các dải β (S3-S6) và α (H3-H8) được nối đan xem
với nhau. Trong đó, không có xoắn α nằm giữa sợi β1 và β2 nên không có kí
hiệu α1. Có 2 xoắn α theo sau chuỗi 2 kí hiệu là H2a và H2b, hai xoắn này xếp
liền nhau giống như 1 xoắn liên tục và phình to ra. Một đoạn xoắn ngắn (H9) nối
tiếp với xoắn H8 nằm gần vị trí kết thúc của đầu C (Hình 1.1) [135].
Hình 1.1. Cấu trúc bậc 2 của chitinase từ nấm C. immitis [135]
1.2.3.2. Cấu trúc không gian
Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong
không gian của các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng liên kết
cơ chất. Sự khác nhau về cấu trúc không gian của các enzyme dẫn tới sự khác
nhau về các tính chất hóa lý của chúng.
Cấu trúc của phân tử chitinase A từ vi khuẩn Bacillus circulans gồm
3 vùng: vùng N-terminal với một nếp gấp giống như kháng thể tham gia vào quá
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi11
trình liên kết với chitin; vùng thủy phân gồm 8 chuỗi α/β và một vùng gấp nếp
nhỏ chứa một chuỗi α+β để chèn vào vùng thủy phân [140].
Trong khi, chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp. A-471 thuộc họ glycosyl
hydrolase 19 được cấu tạo nên từ 6 chuỗi xoắn α là α1 (từ vị trí 111-123), α2 (từ
vị trí 129-141), α3 (từ vị trí 163-177), α4 (từ vị trí 186-204), α5 (từ vị trí 207-
216) và α6 (từ vị trí 234-247); và 1 xoắn 310 (từ vị trí 154-156). Vị trí thủy phân
(Glu141) được xác định ở điểm cuối của xoắn α2 và được che phủ với vòng lặp
dài nhất L-7 (từ vị trí 217-233), nơi nối giữa xoắn α5 và α6. L-7 được gắn bởi
mạng lưới liên kết hydro và tạo nên một khoang hình ống (Hình 1.2) [131].
Hình 1.2. Cấu trúc của chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp. A-471 [131]
1.2.3.3. Trung tâm hoạt động và vùng liên kết cơ chất
Trung tâm hoạt động của chitinase từ nấm L. lecanii chứa 9 gốc amino acid
(Phe-Asp-Gly-Ile-Asp-Trp-Glu). Vai trò liên kết cơ chất khi tham gia xúc tác
thủy phân chitin của chitinase được thực hiện nhờ các vùng liên kết đặc hiệu.
Các vùng liên kết đó có thể nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme hoặc
không. Tùy thuộc vào từng loại enzyme mà vùng liên kết này có cấu tạo hóa học
và cấu trúc không gian khác nhau. Vùng liên kết với cơ chất của chitinase từ12
nấm L. lecanii gồm 7 amino acid (Val-Met-Leu-Ser-Ile-Gly-Gly) và vùng liên
kết này nằm ở phía ngoài trung tâm hoạt động [151].
1.2.4. Cơ chế phản ứng của chitinase
Cơ chế xúc tác của chitinase thực hiện theo 2 hướng: hướng thứ nhất là cơ
chế chuyển dịch với sự tham gia của nhóm lân cận; nhóm cacboxyl bề mặt hoạt
động như một tác nhân có ái lực với điện tích dương, dưới sự hỗ trợ từ Asp hoạt
động để loại bỏ proton H+ ra khỏi nhóm N-acetamido trong sự cố định của ion
oxazolinium. Hướng thứ hai là cơ chế hoạt động xúc tác các phần còn lại để hỗ
trợ cho sự thủy phân các đơn phân.
Mô hình thủy phân chitin được giải thích bằng chitinase B từ vi khuẩn
S. marcescens là một loại exochitinase, với sự tham gia của các nhóm ái lực
trong trung tâm hoạt động của enzyme. Vị trí liên kết của chitinase thuộc họ
glycosyl hydrolase 18 với cơ chất có chứa 3 amino acid là Asp-140, Asp-142 và
Glu-144. Sự luân chuyển Asp-142 trên cơ chất có vai trò giúp ổn định điện tích
dương của các ion trung gian oxazolinium và là chất cho proton, dẫn tới làm
giảm giá trị pKa của Glu-144. Glu-144 đóng vai trò là chất nhận proton, tham
gia hình thành liên kết với cơ chất và giải phóng phân tử nước. Khi ở trạng thái
nghỉ Asp-142 nằm quá xa so với Glu-144 (Hình 1.3A) [99].
Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của chitinase B từ vi khuẩn S. mecescens [99]
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi13
Khi có sự liên kết của trung tâm hoạt động với cơ chất N-acetyl
glucosamine gây ra sự biến dạng của vòng pyranose làm luân chuyển Asp-142
về phía Glu-144, liên kết hydro hình giữa các nhóm amin của Asp-142 và
Glu-144 được hình thành (Hình 1.3B). Sự thủy phân các ion trung gian
oxazolinium để giải phóng các proton đến Glu-144 và luân chuyển proton của
Asp-142 nơi chia sẻ với Asp-140 (Hình 1.3C). Sau khi sự liên kết giữa cơ chất
và trung tâm hoạt động diễn ra, phân tử nước được giải phóng có vai trò thủy
phân các liên kết glycoside bởi axit amin Tyr-214.
Cơ chế thủy phân theo hướng 2 được giải thích bởi chitinase A từ vi khuẩn
B. circulans. Sự liên kết của chitinase A trên bề mặt phân tử chitin thông qua
tương tác của nhóm ái lực gồm 3 amino acid là Trp-69, Trp-33, Trp-245 và
1 phân tử N-acetyl glucosamine trên bề mặt chuỗi đơn của chitin tại miền
N-terminal. Chuỗi chitin tương tác với nhóm ái lực của 3 amino acid được đưa
vào bên trong của khe xúc tác từ các điểm cuối của chuỗi thông qua sự tương tác
với Phe-232. Sự tương tác với các điểm ái lực càng nhiều dẫn đến sự liên kết
càng chặt của chuỗi chitin với miền xúc tác thủy phân của enzyme. Kết quả, các
sản phẩm được giải phóng trong quá trình thủy phân các chuỗi đơn trong tinh thể
chitin là các nối đôi của N-acetyl glucosamine (Hình 1.4) [106]
đường kính phát triển sợi nấm đạt 12,8 mm/ngày cao hơn so với ở nhiệt độ 30°C
(đường kính đạt 7,22 mm/ngày). Như vậy, tốc độ phát triển sợi nấm của chủng
nấm L. lecanii 43H phụ thuộc đáng kể vào nhiệt độ và thích hợp ở dải nhiệt độ
dưới 30°C.
Kết quả này cho thấy, sợi nấm L. lecanii 43H có tốc độ phát triển cao hơn
so với một số nghiên đã công bố trên thế giới như chủng nấm L. lecanii CS625,
L. lecanii 4078 và L. lecanii Btab01 có tốc độ phát triển sợi nấm ở 25°C lần lượt
là 3,67; 2,28 và 2,24 mm/ngày [69], [102]. Ở 28C, tốc độ phát triển sợi nấm của
các chủng B. bassiana là 1,66 mm/ngày [96].
3.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm
Tốc độ phát triển và tỉ lệ nảy mầm của bào tử cao thể hiện tính hiệu quả của
việc sử dụng chế phẩm bào tử nấm trong quá trình diệt côn trùng và là cơ sở cho
việc xác định tính khả thi của chủng nấm nghiên cứu. Do đó, khả năng nảy mầm
của bào tử nấm L. lecanii 43H đã được chúng tui nghiên cứu. Kết quả cho thấy,
chủng nấm L. lecanii 43H cho tỉ lệ bào tử nảy mầm cao nhất ở nhiệt độ 25°C
(đạt khoảng 92%) sau 12 giờ ủ. Sau 24 giờ ủ ở cả 3 nhiệt độ khảo sát, hầu hết
bào tử của chủng nấm L. lecanii 43H đều nảy mầm, tỉ lệ đạt 98% (Hình 3.28).
Theo một số nghiên cứu trước đây cho thấy, tỉ lệ bào tử nẩy mầm của chủng
nấm L. lecanii CS625 lần lượt là 95,5 và 98,4% ở 25C sau khi ủ ở 12 và 24 giờ.
Nhiệt độ tối ưu cho bào tử nẩy mầm và đường kính phát triển sợi nấm của chủng
L. lecanii CS625 dao động từ 20-25°C [48]. Tốc độ nẩy mầm của bào tử và khả
năng đâm xuyên của sợi nấm là nhân tố quan trọng trong quá trình tiêu diệt vật
chủ của nấm [17], [18]. Vu và đồng tác giả (2007) nghiên cứu tỉ lệ nẩy mầm của
nấm L. lecanii ở các nhiệt độ 10, 15, 20, 25, 30 và 35C cho thấy, tỉ lệ nẩy mầm
của những chủng nấm này đạt 100% ở 20-30C sau 24 giờ ủ. Tuy nhiên, nhiệt độ
tối ưu cho bào tử nẩy mầm dao động từ 25-30C. Ở nhiệt độ 10 và 35C, bào tử
của các chủng nấm này không nẩy mầm. Như vậy, khả năng nẩy mầm của chủng
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.......................................................... vii
DANH MỤC HÌNH..................................................................................... ix
DANH MỤC BẢNG.................................................................................... xii
MỞ ĐẦU....................................................................................... ............. 1
1. Đặt vấn đề....................................................................................... ........ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu................................................................................ 2
4. Những đóng góp mới của luận án............................................................ 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án.................................... 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................. ......... 4
1.1. Nấm Lecanicillium lecanii .................................................................. 4
1.2. Chitinase .............................................................................................. 5
1.2.1. Nguồn gốc của chitinase..................................................................... 6
1.2.2. Phân loại chitinase.............................................................................. 7
1.2.3. Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase................................... 9
1.2.4. Cơ chế phản ứng của chitinase........................................................... 12
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase............................... 14
1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase.............. 16iv
1.3. Ứng dụng của nấm L. lecanii và chitinase......................................... 18
1.3.1. Trong lĩnh vực nông nghiệp và bảo vệ môi trường............................ 18
1.3.2. Trong lĩnh vực y học.......................................................................... 22
1.3.3. Trong lĩnh vực công nghệ sinh học.................................................... 23
1.4. Một số nghiên cứu về gen và biểu hiện gen mã hóa chitinase......... 24
1.4.1. Trên thế giới....................................................................................... 24
1.4.2. Ở Việt Nam......................................................................................... 28
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.......................................... 31
2.1. Vật liệu và hóa chất............................................................................. 31
2.1.1. Chủng giống....................................................................................... 31
2.1.2. Thiết bị............................................................................................... 31
2.1.3. Hóa chất............................................................................................. 31
2.1.4. Dung dịch và đệm.............................................................................. 32
2.1.5. Môi trường nuôi cấy........................................................................... 32
2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................... 33
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy........................................................................ 33
2.2.2. Phương pháp hóa sinh........................................................................ 35
2.2.3. Tinh sạch chitinase............................................................................. 37
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính và độ
bền của chitinase tự nhiên và tái tổ hợp....................................................... 39
2.2.5. Các phương pháp sinh học phân tử.................................................... 42
2.2.6. Phương pháp thử nghiệm................................................................... 46
2.2.7. Xử lý số liệu....................................................................................... 48
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiv
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..................... 49
3.1. Sàng lọc, kiểm tra và khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase
từ nấm L. lecanii......................................................................................... 49
3.1.1. Sàng lọc chủng nấm L. lecanii sinh tổng hợp chitinase cao............... 49
3.1.2. Kiểm tra chủng nấm L. lecanii 43H dựa vào đoạn gen 28S rRNA... 49
3.1.3. Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase........................................ 52
3.2. Tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của chitinase từ chủng
nấm L. Lecanii 43H..................................................................................... 57
3.2.1. Tinh sạch chitinase............................................................................. 57
3.2.2. Đánh giá tính chất lý hóa của chitinase từ chủng nấm L. lecanii
43H............................................................................................................... 59
3.3. Nhân dòng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H...... 66
3.4. Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của rChit trong
nấm men P. pastoris X33............................................................................ 70
3.4.1. Thiết kế plasmid pPChit biểu hiện gen Chit trong nấm men............. 70
3.4.2. Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men P. pastoris................. 71
3.4.3. Tinh sạch rChit................................................................................... 76
3.4.4. Đánh giá tính chất lý hóa của rChit từ nấm men P. pastoris X33...... 78
3.5. Thử nghiệm khả năng ức chế rệp và nấm bệnh của chitinase và
bào tử từ nấm L. lecanii............................................................................. 84
3.5.1. Ảnh hưởng của chitinase tới sự phát triển của nấm bệnh hại cây
trồng............................................................................................................. 84
3.5.2. Ảnh hưởng của rChit tới khả năng phát triển của rệp........................ 86vi
3.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của sợi nấm........... 87
3.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm...... 88
3.5.5. Khả năng diệt rệp của chủng nấm L. lecanii 43H.............................. 89
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................... 92
1. KẾT LUẬN.............................................................................................. 92
2. KIẾN NGHỊ............................................................................................. 92
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN... 93
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................... 94
DANH MỤC PHỤ LỤC............................................................................. 113
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phivii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tiếng Anh Tiếng Việt
BLAST Basic local alignment search tool Phần mềm so sánh trình tự
bp Base pair Cặp bazơ
cDNA Complement DNA DNA tạo ra từ mRNA
Chit Gene encoding chitinase Gen mã hóa chitinase
CMC Cacboxyl methyl cellulose Cacboxyl methyl cellulose
DEPC Diethylpyrocarbonate Diethylpyrocarbonate
DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic
DNase Deoxyribonuclease Enzyme thủy phân DNA
dNTPs 2-Deoxynucleoside 5-
triphosphate
Các nucleotide
ĐC Control Đối chứng
IPTG Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside
Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid Axit ethylenediamine tetraacetic
EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide
kb Kilo base Kilo base
kDa Kilo Dalton Kilo Dalton
M Marker Thang chuẩn
OD Optical density Mật độ quang
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen
RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleicviii
RNase Ribonuclease Enzyme thủy phân RNA
RT-PCR Reverse transcription polymerase
chain reaction
Phản ứng khuếch đại gen
rChit Recombinante chitinase Chitinase tái tổ hợp
SDSPAGE
Sodium dodecyl sulfate
Polyacrylamide gel
electrophoresis
Điện di protein
Taq Thermus aquaticus Thermus aquaticus
TBE Tris boric acid EDTA Tris boric acid EDTA
TE Tris EDTA Tris EDTA
TEMED N,N,N,N-
Tetramethylethylenediamine
N,N,N,N-
Tetramethylethylenediamine
v/v Volume/volume Thể tích/thể tích
w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiix
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc bậc 2 của chitinase từ nấm C. immitis........................... 10
Hình 1.2. Cấu trúc của chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp. A-471 ............. 11
Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của chitinase B từ vi khuẩn S. mecescens........... 12
Hình 1.4. Cơ chế thủy phân β-chitin bởi chitinase A từ vi khuẩn
B. circulans................................................................................................... 13
Hình 2.1. Đường chuẩn nồng độ N-acetyl glucosamine theo phương pháp
Miller............................................................................................................ 36
Hình 2.2. Các bước tinh sạch chitinase........................................................ 38
Hình 2.3. Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết thanh bò theo
Bradford........................................................................................................ 39
Hình 2.4. Đồ thị Lineawever-Burk.............................................................. 40
Hình 2.5. Sơ đồ mô tả vị trí gắn của gen Chit vào genome của nấm men
P. pastoris X33............................................................................................. 46
Hình 3.1. Hoạt tính chitinase của 8 chủng nấm L. lecanii........................... 49
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng nấm
L. lecanii 43H; Sản phẩm Plasmid và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng
XhoI và XbaI...................... .......................................................................... 50
Hình 3.3. Trình tự đoạn gen 28S rRNA từ chủng nấm L. lecanii 43H;
Cây phân loại trình tự gen 28S rRNA từ chủng nấm L. lecanii 43H với
các loài khác................................................................................................. 51
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ nuôi cấy đến khả
năng sinh tổng hợp chitinase ....................................................................... 52
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ chitin huyền phù và nguồn nitơ đếnx
khả năng sinh tổng hợp chitinase ................................................................ 54
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và pH nuôi cấy lên khả năng
sinh tổng hợp chitinase ................................................................................ 55
Hình 3.7. Hình ảnh điện di SDS-PAGE của chitinase tinh sạch từ chủng
nấm L. lecanii 43H và hoạt tính chitinase của các phân đoạn qua cột
DEAE-Sephadex A-50 trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất chitin huyền phù
0,5%.............................................................................................................. 58
Hình 3.8. Nhiệt độ và pH thích hợp của chitinase ...................................... 60
Hình 3.9. Độ bền nhiệt và độ bền pH của chitinase .................................... 61
Hình 3.10. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính
chitinase ....................................................................................................... 64
Hình 3.11. Phân tích TLC các sản phẩm thủy phân chitin bởi chitinase....... 66
Hình 3.12. Kết quả nhân dòng gen Chit từ DNA hệ gen............................. 66
Hình 3.13. Trình tự gen Chit và amino acid suy diễn từ L. lecanii 43H..... 67
Hình 3.14. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự gen Chit của chủng
L. Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank...................................... 68
Hình 3.15. Kết quả nhân dòng gen Chit từ mRNA...................................... 69
Hình 3.16. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự amino acid của rChit
từ L. Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank.................................. 70
Hình 3.17. Kết quả thiết kế cấu trúc vector biểu hiện pPChit..................... 70
Hình 3.18. Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu hiện rChit trong P. pastoris
X33............................................................................................................... 71
Hình 3.19. Khả năng sinh tổng hợp rChit của chủng tái tổ hợp khi được
cảm ứng ở các nồng độ methanol khác nhau................................................ 73
Hình 3.20. Khả năng sinh tổng hợp rChit ở các khoảng thời gian khác
nhau.............................................................................................................. 74
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phixi
Hình 3.21. Điện di SDS-PAGE của rChit tinh sạch từ P. pastoris X33...... 77
Hình 3.22. Nhiệt độ và pH thích hợp của rChit........................................... 79
Hình 3.23. Độ bền nhiệt và độ bền pH của rChit......................................... 80
Hình 3.24. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính
rChit ............................................................................................................. 83
Hình 3.25. Ức chế sự phát triển của nấm bệnh F. oxysporum và R. solani
bởi chitinase ................................................................................................. 86
Hình 3.26. Sợi nấm của R. solani và F. oxysporum được xử lý với nước
và với chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H.............................................. 86
Hình 3.27. Hỗn hợp chitin của rệp được xử lý với nước và rChit từ nấm
men P. pastoris X33 ................................................................................... 87
Hình 3.28. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ nẩy mầm của
bào tử nấm L. lecanii 43H ........................................................................... 89
Hình 3.29. Mô hình lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm và
biểu đồ thể hiện khả năng diệt rệp bằng bào tử của chủng nấm L. lecanii
43H .............................................................................................................. 91xii
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Các môi trường thí nghiệm.......................................................... 32
Bảng 2.2. Các điều kiện nuôi cấy chủng nấm L. lecanii 43H sinh tổng
hợp chitinase................................................................................................. 34
Bảng 2.3. Thành phần gel cô và gel tách.................................................... 38
Bảng 2.4. Quan hệ giữa 1/
Bảng 2.5. Các cặp mồi sử dụng................................................................... 44
Bảng 2.6. Thành phần PCR.......................................................................... 44
Bảng 3.1. Kết quả tinh sạch chitinase từ chủng nấm L .lecanii 43H........... 58
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA đến hoạt tính chitinase... 62
Bảng 3.3. Hoạt tính chitinase của các dòng nấm men
P. pastoris X33/pPChit tái tổ hợp............................................................... 72
Bảng 3.4. Hoạt tính rChit ở các môi trường biểu hiện khác nhau................ 73
Bảng 3.5. Kết quả tinh sạch rChit từ nấm men P. pastoris X33.................. 76
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính rChit... 81
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, các biện pháp sinh học như sử dụng nấm kí sinh
hay các loài thiên địch trong việc phòng chống sâu hại cây trồng đang được quan
tâm nghiên cứu. Các chế phẩm sinh học từ nấm ra đời đã được sử dụng để diệt
trừ các loại sâu, nhện, bọ trĩ và bọ cánh phấn. Tuy nhiên, việc sử dụng biện pháp
vi nấm kí sinh đối với rệp là vấn đề đang còn mới mẻ trong nông nghiệp. Cùng
với sự phát triển kinh tế - xã hội, con người ngày càng có nhu cầu sử dụng các
sản phẩm rau quả sạch, hạn chế mức thấp nhất việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa
học dùng trong sản xuất rau, củ quả. Các loài thiên địch như nấm kí sinh côn
trùng gây hại cây trồng đã được sử dụng, do chúng có khả năng phát tán rất
nhanh và chỉ diệt các loài côn trùng có hại mà không ảnh hưởng tới nguồn nước,
môi trường sinh thái và sức khỏe con người, vật nuôi.
Nấm kí sinh côn trùng thường tác động đến những loại mô nhất định như
tuyến mỡ và các mô khác bị hòa tan là do các enzyme (chitinase, protease) của
nấm. Trong quá trình tác động lên côn trùng, nấm tiết ra các enzyme càng mạnh
thì tốc độ hủy hoại và tiêu diệt côn trùng gây bệnh càng nhanh, tiết kiệm được
thời gian. Dựa vào đặc tính này của nấm, việc tạo ra một lượng lớn enzyme đặc
biệt là chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học là rất cần thiết.
Chitinase là enzyme thuỷ phân chitin thành các đơn phân N-acetyl
glucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết
β-1,4-glucoside giữa C1 và C4 của 2 phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau
trong chitin. Chitinase có ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nông nghiệp, y học.
Từ thực tế trên, việc nghiên cứu đặc tính chitinase và qui trình tạo ra chitinase
cao góp phần làm tăng hiệu quả của chế phẩm bào tử nấm là rất cần thiết.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tui tiến hành lựa chọn đề tài luận án:
“Nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase tái tổ hợp
từ chủng nấm Lecanicillium lecanii”.2
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu chung
Tinh sạch và đánh giá được tính chất hóa lý của chitinase chiết rút từ nấm
L. lecanii và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong nấm men Pichia pastoris
X33 phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm diệt rệp và nấm hại cây trồng.
2.2. Mục tiêu cụ thể
(i) Tuyển chọn được chủng nấm L. lecanii có khả năng sinh tổng hợp chitinase
cao. Tinh sạch và đánh giá được tính chất hóa lý của chitinase chiết rút từ chủng
nấm đã tuyển chọn;
(ii) Xác định được trình tự nucleotide của gen mã hóa chitinase từ chủng nấm
L. lecanii đã tuyển chọn;
(iii) Biểu hiện được chitinase tái tổ hợp của gen mã hóa phân lập được từ chủng
nấm L. lecanii tuyển chọn trong nấm men Pichia pastoris X33;
(iv) Tinh sạch, khảo sát tính chất hóa lý của chitinase tái tổ hợp và đánh giá vai
trò diệt rệp, nấm bệnh hại cây trồng của chitinase.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm L. lecanii sinh chitinase cao và khảo sát
điều kiện sinh tổng hợp chitinase.
(2) Nghiên cứu tinh sạch và phân tích tính chất lý hóa của chitinase tự nhiên.
(3) Nghiên cứu tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa chitinase phân lập từ
chủng nấm đã tuyển chọn
(4) Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chitinase, tinh sạch và nghiên cứu một số
tính chất lí hóa của chitinase tái tổ hợp.
(5) Nghiên cứu khả năng ức chế của chitinase đối với sự phát triển một số loài
nấm bệnh và rệp hại cây trồng.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi3
4. Những đóng góp mới của luận án
4.1. Luận án đã tinh sạch, đánh giá một số tính chất lý hóa và chứng minh được
khả năng ức chế sự phát triển sợi nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia
solani của exochitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H. Bước đầu đánh giá được
khả năng diệt được rệp của bào tử nấm L. lecanii.
4.2. Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống từ phân lập, tách dòng, biểu
hiện gen chitinase và đánh giá khả năng diệt rệp hại cây trồng. Cụ thể là: (i) Gen
Chit từ chủng nấm L. lecanii 43H được phân lập, tách dòng thành công và xác
định được trình tự; đoạn gen Chit được đăng kí trong GenBank với mã số
JX665045. (ii) Biểu hiện thành công gen Chit mã hóa endochitinase thuộc họ
18 glycosyl hydrolase trong nấm men P. pastoris X33 cho hoạt tính cao. Tinh
sạch được chitinase tái tổ hợp và đánh giá được một số tính chất lý hóa cơ bản.
(iii) Chứng minh được rChit có khả năng làm suy giảm lớp vỏ chitin của rệp.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
5.1. Về khoa học
i) Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về phương pháp
tinh sạch chitinase, các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase và khả năng
diệt nấm bệnh của chitinase từ chủng nấm L. lecanii.
ii) Cung cấp những thông tin về gen mã hóa chitinase ở chủng nấm L. lecanii
43H, chitinase tái tổ hợp và các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính rChit và khả năng
thủy phân lớp vỏ rệp của rChit.
iii) Cung cấp thông tin về khả năng diệt rệp của bào tử và đặc điểm sinh học của
nấm L. lecanii.
5.2. Về thực tiễn
Những kết quả đánh giá toàn diện từ khâu lựa chọn điều kiện sinh tổng hợp
chitinase, tinh sạch và xác định tính chất lý hóa, khả năng diệt nấm bệnh và rệp
của chitinase, cũng như quá trình nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase
làm căn cứ để đánh giá và ứng dụng của chitinase với bào tử nấm trong quá trình
tạo chế phẩm sinh học diệt rệp của chủng nấm L. lecanii.4
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nấm Lecanicillium lecanii
Lecanicillium là chi nấm kí sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi
Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae. Chi nấm
Lecanicillium gồm nhiều loài như: Lecanicillium lecanii, L. attenuatum,
L. longisporum, L. muscarium hay L. nodulosum. Nấm L. lecanii trước đây
được gọi là Verticillium lecanii. Ngày nay, L. lecanii được biết là một hình thức
sinh sản vô tính trong nhóm trùng thảo Cordyceps confragosa [124].
Nấm Lecanicillium có khả năng kí sinh tự nhiên và giết chết nhiều loại côn
trùng như rệp, ruồi trắng, bộ cánh đều, bộ cánh cứng, bộ cánh thẳng, bướm [22],
[47], [49], [60], [93]. Cơ chế diệt côn trùng của Lecanicillium dựa trên sự tiếp
xúc trực tiếp của bào tử với côn trùng. Sau khi bám vào cơ thể côn trùng, các bào
tử nảy mầm và tạo thành sợi nấm đâm sâu vào các khoang trong cơ thể, tại đây
chúng sinh trưởng và phá hủy mô. Sau đó, sợi nấm sẽ phát triển xuyên qua các
lớp biểu bì của côn trùng. Trong điều kiện độ ẩm cao, bào tử được tạo thành bên
ngoài cơ thể côn trùng và có thể lây truyền bệnh cho côn trùng khác [95].
Dựa vào đặc tính diệt côn trùng của nấm L. lecanii, các nghiên cứu hiện
nay đi theo hai hướng chính là: đi sâu khai thác đặc điểm sinh học của chế phẩm
bào tử nấm L. lecanii sử dụng trong kiểm soát côn trùng; và tìm hiểu vai trò của
hệ enzyme (chitinase, protease, lipase) hay độc tố do nấm L. lecanii sinh ra
trong quá trình diệt côn trùng.
Các nghiên cứu về chitinase từ nấm Lecanicillium đã được các tác giả
nghiên cứu theo các hướng chính là (i) tối ưu quá trình sinh tổng hợp chitinase;
(ii) tinh sạch và xác định khả năng thủy phân lớp vỏ trứng của côn trùng và (iii)
nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu
chỉ dừng lại ở từng khâu nghiên cứu riêng lẻ và hoạt tính chitinase sinh ra còn rất
thấp. Mặt khác, chủng nấm L. lecanii nói riêng và các vi sinh vật nói chung
thường hay xuất hiện các biến dị và quá trình sinh chitinase luôn thay đổi ở các
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi5
điều kiện môi trường, dẫn tới tính chất của chitinase sinh ra từ các chủng nấm là
khác nhau. Do vậy, quá trình nghiên cứu đầy đủ về chitinase từ bước lựa chọn
điều kiện môi trường thích hợp cho việc nâng cao khả năng tổng hợp chitinase
đến tinh sạch và xác định các điều kiện ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme; cũng
như việc nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii
trong nấm men để nâng cao khả năng biểu hiện, sau đó thử nghiệm hoạt tính của
chitinase và chế phẩm bào tử trong quá trình diệt rệp và nấm bệnh hại cây trồng
là hướng nghiên cứu cần thiết để nâng cao hiệu quả của chế phẩm sinh học.
1.2. Chitinase
Chitinase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng phân cắt liên kết
β-1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp
nhau trong phân tử chitin, chitobiose và chitotriose. Chitinase được chia thành 2
loại chính là endochitinase (EC 3.2.1.14) và exochitinase. Exochitinase gồm
chitobiosidase (EC 3.2.1.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC 3.2.1.30). Mỗi
loại enzyme tham gia vào thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ sự
phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn
toàn tạo các đơn phân N-acetyl glucosamine.
Cơ chất thủy phân của chitinase thường là chitin. Chitin là một
polysacharide mạch thẳng không cuộn xoắn, có màu trắng, cứng và không đàn
hồi được tạo nên từ các đơn phân N-acetyl glucosamine thông qua liên kết
1,4-β glycoside. Chitin là chất hữu cơ đứng thứ 2 trong tự nhiên sau cellulose.
Trong tự nhiên, chitin gồm 3 dạng cấu trúc là α, β và γ-chitin. Trong đó,
dạng α-chitin có cấu trúc đối song song gồm các chuỗi polysaccharide xếp xen
kẽ nhau và là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên. α-chitin là thành phần cấu tạo
nên bộ xương ngoài của côn trùng, giáp xác, nhuyễn thể và vách tế bào của nấm.
Dạng β-chitin thường hiếm hơn, có cấu trúc song song gồm các chuỗi
polysaccharide xếp xen kẽ nhau và tồn tại ở dạng liên kết với protein. Dạng
γ-chitin được tạo nên từ 2 chuỗi song song xen kẽ với 1 chuỗi đối song song.
Dạng γ-chitin thường tồn tại ở các loài nấm [57].6
Chitin nguyên bản thường có màu trắng đục, mềm dẻo, đàn hồi và khá dai
nên khó bị thủy phân. Trong động vật chân đốt, chitin được sửa đổi và liên kết
với protein giống như một ma trận và tạo thành bộ xương ngoài. Ở dạng tinh
khiết chitin thường dai, nhưng khi tham gia vào thành phần cấu tạo ở hầu hết các
động vật không xương chitin lại là nguyên liệu tổng hợp. Trong vỏ giáp xác và
động vật thân mềm, chitin kết hợp với canxi cacbonat tạo thành hỗn hợp bền
vững hơn. Sự kết hợp này giúp cho chitin cứng và đặc hơn so với dạng tinh
khiết, đồng thời bền vững và ít giòn hơn so với canxi cacbonat [27].
1.2.1. Nguồn gốc của chitinase
Chitinase được tổng hợp từ rất nhiều nguồn sinh vật khác nhau trong tự
nhiên như thực vật, động vật và vi sinh vật. Trong đó, vi sinh vật được xem là
nguồn cung cấp chitinase nhiều hơn so với động vật và thực vật.
Chitinase được sinh ra từ vi sinh vật gồm 2 loại là endochitinase và
exochitinase. Nấm mốc là một trong những nhóm vi sinh vật có khả năng sinh
tổng hợp chitinase mạnh nhất. Các loài nấm mốc thuộc các chi như Trichoderma
[32], [37]; Glicocladium; Metharhizium [61], [128]; Beauveria, Lecanicillium
[23], [42], [91]; Aspergillus [145]; Penicillium [80] đã được nghiên cứu là có
khả năng sinh tổng hợp chitinase mạnh. Bên cạnh đó, vi khuẩn cũng được xem là
đối tượng có khả năng sinh chitinase khá phong phú. Chitinase được sinh ra từ vi
khuẩn thuộc các chi như Serratia [148], Aeromonas [139], Arthrobacter [100],
Micrococcus [19], Clostridium, Bacillus [24], [137] và đặc biệt là nhóm
Streptomycetes [72], [144].
Chitinase được tạo ra từ vi sinh vật có vai trò phân giải chitin trong tự
nhiên. Thành tế bào của nấm sợi và nấm men được tạo nên từ các phân tử chitin
và các hợp chất khác (manan, glucan, cellulose). Tuy nhiên, cấu trúc chitin này
so với chitin trong tự nhiên có sự khác nhau về tính không tan, kích thước, độ
nhớt, độ phức tạp phân tử và tính không đồng nhất nên không bị thủy phân bởi
chitinase của cơ thể.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi7
Ở thực vật, chitinase có mặt chủ yếu trong thân, củ, hạt và hoa của các loài
như khoai tây, thuốc lá, đậu, cà chua, ngô, khoai lang và đậu Hà Lan. Chitinase
được sinh ra trong giai đoạn phát triển sớm của cơ thể có vai trò tham gia vào
quá trình hình thành và phát triển phôi. Chitinase trong cây được sinh ra khi có
sự kích thích của mầm bệnh giúp cây chống lại sự tấn công của các nấm kí sinh
gây bệnh. Ở thực vật, chitinase chủ yếu thuộc loại endochitinase và có kích
thước nhỏ hơn so với các nhóm khác.
Bên cạnh đó, hệ chitinase có thể được thu nhận từ một số động vật nguyên
sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật
không xương như ruột khoang, giun tròn, chân đốt, thân mềm (ví dụ trong dịch
ruột của ốc sên Helix aspersa). Đối với động vật có xương sống, chitinase được
tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ,
trong dịch dạ dày của các loài chim, thú ăn sâu bọ [89], [90].
Ngoài ra, hệ chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong
suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm
thay vỏ, lột da. Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng cuticun của chúng trong
quá trình biến thái hay lột xác.
1.2.2. Phân loại chitinase
Theo danh pháp quốc tế, Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh
học phân tử quốc tế xếp chitinase vào phân lớp 3 (hydrolase, các enzyme xúc tác
phản ứng thủy phân), tổ 2 (glycosidase, thủy phân các liên kết glycoside), nhóm
1 (thủy phân liên kết O- và S-glycoside) (International Union of Biochemistry
and Molecular Biology, 1992;
You must be registered for see links
).Chitinase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo quan
điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ chitinase được xếp thành
các nhóm khác nhau. Dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất, chitinase được chia
thành 2 dạng: dạng 1 là endochitinase (EC.3.2.1.14), dạng 2 là exochitinase gồm
2 loại là chitobiosidase (EC.3.2.1.29) và N-acetyl glucosaminidase (EC.3.2.1.30).8
Endochitinase thủy phân điểm cắt bên trong của phân tử chitin và chitodextrin
tạo ra các phân tử có khối lượng thấp như chitotriose, chitotetraose và diacetyl
chitobiose. Chitobiosidase xúc tác quá trình phân cắt các vi sợi chitin ở đầu
không khử giải phóng ra các diacetyl chitobiose. N-acetylglucosaminidase phân
cắt các oligomer (sản phẩm của sự thủy phân bởi endochitinase và
chitobiosidase) để tạo ra các đơn phân N-acetyl glucosamine [106].
Dựa vào cấu trúc phân tử, chitinase được sắp xếp vào 3 họ là glycosyl
hydrolase 18, 19 và 20 [52]. Họ glycosyl hydrolase 18 là họ chitinase lớn nhất
với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm
thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus. Họ này bao gồm
chủ yếu là chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase,
chitobiase và N-acetyl glucosaminidase. Các chitinase này hoạt động thông qua
các cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản
phẩm β-anomer. Các chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 18 rất nhạy cảm với
chất ức chế mạnh allosamidin [73]. Các chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 18
được tổng hợp từ Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma
harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens. Họ glycosyl hydrolase
19 có hơn 130 chi, chủ yếu ở thực vật (như cà chua, cải, đậu Hà lan); xạ khuẩn
Streptomyces griceus và một số vi khuẩn (Haemophillus influenzae). Họ
glycosyl hydrolase 19 có cấu trúc giống với lysozyme và chitosanase, chúng có
cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế dịch chuyển.
Chitinase thuộc họ glycosyl hydrolase 19 từ vật bậc cao thì không bị ức chế bởi
allosamidin [73]. Họ glycosyl hydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine
acetyl hexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người.
Dựa vào trình tự amino acid đầu N, sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện,
peptide nhận biết và vùng cảm ứng, chitinase được phân chia thành 5 nhóm: là
nhóm I, II, III, IV và V. Nhóm I là những đồng phân enzyme trong phân tử có
đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc
prolin ở đầu cacboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi9
trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt
động xúc tác. Nhóm II là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc
tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptide nhận biết ở đầu C, có trình tự
amino acid tương tự chitinase nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, vi
khuẩn, chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài. Nhóm III là trình tự
amino acid hoàn toàn khác với nhóm I và II. Nhóm IV là những đồng phân
enzyme chủ yếu có ở lá của cây 2 lá mầm, 41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc
tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein
nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I. Nhóm V
được nhận biết dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn
chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở
thực vật bậc cao [106].
1.2.3. Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase
1.2.3.1. Cấu trúc bậc một và bậc hai của chitinase
Các chitinase được sinh ra từ các cơ thể khác nhau có thành phần cấu tạo và
cấu trúc khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối
lượng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi
polypeptide. Ở vi khuẩn, chitinase từ B. cereus có khối lượng 37 kDa được mã
hóa bởi 360 amino acid [53], từ Streptomyces sp. M-20 có khối lượng 20 kDa
[72], từ Streptomyces griserus HUT 6039 có khối lượng 49 kDa [132].
Ở nấm, chitinase từ Trichoderma atroviride có khối lượng phân tử 33 kDa
mã hóa bởi 321 amino acid [88]. Chitinase từ Coccidioides immitis gồm 427
amino acid [135]. Chitinase từ Clonostachys rosea (Crch1) có khối lượng
45 kDa được mã hóa bởi 426 amino acid, chứa 1 tín hiệu peptide với 22 amino
acid [43]. Chitinase từ L. psalliotae có khối lượng phân tử là 45 kDa, được mã
hóa từ 423 amino acid gồm 1 tín hiệu peptide dài 20 amino acid [42]. Zhu và
đồng tác giả (2008) đã nghiên cứu về cấu trúc của endochitinase từ L. lecanii
thuộc họ glycosyl hydrolase 18 là một chuỗi polypeptide cấu tạo bởi các dải α, β
và các vùng nối. Chitinase này là một protein có tính acid, giá trị pI là 5,5510
[151]. Chitinase từ L. lecanii có khối lượng phân tử là 40,93 kDa (CHI1) được
mã hóa bởi 370 amino acid và 45,95 kDa (CHI2) được mã hóa bởi 423 amino
acid [150].
Thomas và đồng tác giả (2000) đã nghiên cứu chi tiết về cấu trúc bậc 2 của
chitinase từ nấm C. immitis thuộc họ glycosyl hydrolase 18. Chitinase này là một
chuỗi polypeptide gồm 8 dải β (kí hiệu từ S1-S8) tạo thành lõi của enzyme và
8 dải α (kí hiệu từ H2-H9). Các dải β (S3-S6) và α (H3-H8) được nối đan xem
với nhau. Trong đó, không có xoắn α nằm giữa sợi β1 và β2 nên không có kí
hiệu α1. Có 2 xoắn α theo sau chuỗi 2 kí hiệu là H2a và H2b, hai xoắn này xếp
liền nhau giống như 1 xoắn liên tục và phình to ra. Một đoạn xoắn ngắn (H9) nối
tiếp với xoắn H8 nằm gần vị trí kết thúc của đầu C (Hình 1.1) [135].
Hình 1.1. Cấu trúc bậc 2 của chitinase từ nấm C. immitis [135]
1.2.3.2. Cấu trúc không gian
Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong
không gian của các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng liên kết
cơ chất. Sự khác nhau về cấu trúc không gian của các enzyme dẫn tới sự khác
nhau về các tính chất hóa lý của chúng.
Cấu trúc của phân tử chitinase A từ vi khuẩn Bacillus circulans gồm
3 vùng: vùng N-terminal với một nếp gấp giống như kháng thể tham gia vào quá
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi11
trình liên kết với chitin; vùng thủy phân gồm 8 chuỗi α/β và một vùng gấp nếp
nhỏ chứa một chuỗi α+β để chèn vào vùng thủy phân [140].
Trong khi, chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp. A-471 thuộc họ glycosyl
hydrolase 19 được cấu tạo nên từ 6 chuỗi xoắn α là α1 (từ vị trí 111-123), α2 (từ
vị trí 129-141), α3 (từ vị trí 163-177), α4 (từ vị trí 186-204), α5 (từ vị trí 207-
216) và α6 (từ vị trí 234-247); và 1 xoắn 310 (từ vị trí 154-156). Vị trí thủy phân
(Glu141) được xác định ở điểm cuối của xoắn α2 và được che phủ với vòng lặp
dài nhất L-7 (từ vị trí 217-233), nơi nối giữa xoắn α5 và α6. L-7 được gắn bởi
mạng lưới liên kết hydro và tạo nên một khoang hình ống (Hình 1.2) [131].
Hình 1.2. Cấu trúc của chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp. A-471 [131]
1.2.3.3. Trung tâm hoạt động và vùng liên kết cơ chất
Trung tâm hoạt động của chitinase từ nấm L. lecanii chứa 9 gốc amino acid
(Phe-Asp-Gly-Ile-Asp-Trp-Glu). Vai trò liên kết cơ chất khi tham gia xúc tác
thủy phân chitin của chitinase được thực hiện nhờ các vùng liên kết đặc hiệu.
Các vùng liên kết đó có thể nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme hoặc
không. Tùy thuộc vào từng loại enzyme mà vùng liên kết này có cấu tạo hóa học
và cấu trúc không gian khác nhau. Vùng liên kết với cơ chất của chitinase từ12
nấm L. lecanii gồm 7 amino acid (Val-Met-Leu-Ser-Ile-Gly-Gly) và vùng liên
kết này nằm ở phía ngoài trung tâm hoạt động [151].
1.2.4. Cơ chế phản ứng của chitinase
Cơ chế xúc tác của chitinase thực hiện theo 2 hướng: hướng thứ nhất là cơ
chế chuyển dịch với sự tham gia của nhóm lân cận; nhóm cacboxyl bề mặt hoạt
động như một tác nhân có ái lực với điện tích dương, dưới sự hỗ trợ từ Asp hoạt
động để loại bỏ proton H+ ra khỏi nhóm N-acetamido trong sự cố định của ion
oxazolinium. Hướng thứ hai là cơ chế hoạt động xúc tác các phần còn lại để hỗ
trợ cho sự thủy phân các đơn phân.
Mô hình thủy phân chitin được giải thích bằng chitinase B từ vi khuẩn
S. marcescens là một loại exochitinase, với sự tham gia của các nhóm ái lực
trong trung tâm hoạt động của enzyme. Vị trí liên kết của chitinase thuộc họ
glycosyl hydrolase 18 với cơ chất có chứa 3 amino acid là Asp-140, Asp-142 và
Glu-144. Sự luân chuyển Asp-142 trên cơ chất có vai trò giúp ổn định điện tích
dương của các ion trung gian oxazolinium và là chất cho proton, dẫn tới làm
giảm giá trị pKa của Glu-144. Glu-144 đóng vai trò là chất nhận proton, tham
gia hình thành liên kết với cơ chất và giải phóng phân tử nước. Khi ở trạng thái
nghỉ Asp-142 nằm quá xa so với Glu-144 (Hình 1.3A) [99].
Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của chitinase B từ vi khuẩn S. mecescens [99]
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi13
Khi có sự liên kết của trung tâm hoạt động với cơ chất N-acetyl
glucosamine gây ra sự biến dạng của vòng pyranose làm luân chuyển Asp-142
về phía Glu-144, liên kết hydro hình giữa các nhóm amin của Asp-142 và
Glu-144 được hình thành (Hình 1.3B). Sự thủy phân các ion trung gian
oxazolinium để giải phóng các proton đến Glu-144 và luân chuyển proton của
Asp-142 nơi chia sẻ với Asp-140 (Hình 1.3C). Sau khi sự liên kết giữa cơ chất
và trung tâm hoạt động diễn ra, phân tử nước được giải phóng có vai trò thủy
phân các liên kết glycoside bởi axit amin Tyr-214.
Cơ chế thủy phân theo hướng 2 được giải thích bởi chitinase A từ vi khuẩn
B. circulans. Sự liên kết của chitinase A trên bề mặt phân tử chitin thông qua
tương tác của nhóm ái lực gồm 3 amino acid là Trp-69, Trp-33, Trp-245 và
1 phân tử N-acetyl glucosamine trên bề mặt chuỗi đơn của chitin tại miền
N-terminal. Chuỗi chitin tương tác với nhóm ái lực của 3 amino acid được đưa
vào bên trong của khe xúc tác từ các điểm cuối của chuỗi thông qua sự tương tác
với Phe-232. Sự tương tác với các điểm ái lực càng nhiều dẫn đến sự liên kết
càng chặt của chuỗi chitin với miền xúc tác thủy phân của enzyme. Kết quả, các
sản phẩm được giải phóng trong quá trình thủy phân các chuỗi đơn trong tinh thể
chitin là các nối đôi của N-acetyl glucosamine (Hình 1.4) [106]
đường kính phát triển sợi nấm đạt 12,8 mm/ngày cao hơn so với ở nhiệt độ 30°C
(đường kính đạt 7,22 mm/ngày). Như vậy, tốc độ phát triển sợi nấm của chủng
nấm L. lecanii 43H phụ thuộc đáng kể vào nhiệt độ và thích hợp ở dải nhiệt độ
dưới 30°C.
Kết quả này cho thấy, sợi nấm L. lecanii 43H có tốc độ phát triển cao hơn
so với một số nghiên đã công bố trên thế giới như chủng nấm L. lecanii CS625,
L. lecanii 4078 và L. lecanii Btab01 có tốc độ phát triển sợi nấm ở 25°C lần lượt
là 3,67; 2,28 và 2,24 mm/ngày [69], [102]. Ở 28C, tốc độ phát triển sợi nấm của
các chủng B. bassiana là 1,66 mm/ngày [96].
3.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm
Tốc độ phát triển và tỉ lệ nảy mầm của bào tử cao thể hiện tính hiệu quả của
việc sử dụng chế phẩm bào tử nấm trong quá trình diệt côn trùng và là cơ sở cho
việc xác định tính khả thi của chủng nấm nghiên cứu. Do đó, khả năng nảy mầm
của bào tử nấm L. lecanii 43H đã được chúng tui nghiên cứu. Kết quả cho thấy,
chủng nấm L. lecanii 43H cho tỉ lệ bào tử nảy mầm cao nhất ở nhiệt độ 25°C
(đạt khoảng 92%) sau 12 giờ ủ. Sau 24 giờ ủ ở cả 3 nhiệt độ khảo sát, hầu hết
bào tử của chủng nấm L. lecanii 43H đều nảy mầm, tỉ lệ đạt 98% (Hình 3.28).
Theo một số nghiên cứu trước đây cho thấy, tỉ lệ bào tử nẩy mầm của chủng
nấm L. lecanii CS625 lần lượt là 95,5 và 98,4% ở 25C sau khi ủ ở 12 và 24 giờ.
Nhiệt độ tối ưu cho bào tử nẩy mầm và đường kính phát triển sợi nấm của chủng
L. lecanii CS625 dao động từ 20-25°C [48]. Tốc độ nẩy mầm của bào tử và khả
năng đâm xuyên của sợi nấm là nhân tố quan trọng trong quá trình tiêu diệt vật
chủ của nấm [17], [18]. Vu và đồng tác giả (2007) nghiên cứu tỉ lệ nẩy mầm của
nấm L. lecanii ở các nhiệt độ 10, 15, 20, 25, 30 và 35C cho thấy, tỉ lệ nẩy mầm
của những chủng nấm này đạt 100% ở 20-30C sau 24 giờ ủ. Tuy nhiên, nhiệt độ
tối ưu cho bào tử nẩy mầm dao động từ 25-30C. Ở nhiệt độ 10 và 35C, bào tử
của các chủng nấm này không nẩy mầm. Như vậy, khả năng nẩy mầm của chủng
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links