Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết Nối
Chế tạo và nghiên cứu tính chất quang của hạt nano silica chứa tâm màu và thử nghiệm ứng dụng trong đánh dấu
tui xin trân trọng Thank Phòng thí nghiệm trọng điểm Photonics – Viện Vật lý, Bộ Giáo dục và Đào tạo, Viện Vật lý và Phòng Sau đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tui trong quá trình làm luận án. Đặc biệt, tui xin chân thành Thank GS.TS. Viện trưởng Nguyễn Đại Hưng và TS. Nguyễn Thanh Bình đã tạo điều kiện để tui có thể hoàn thành được luận án của mình. tui xin Thank NCS. Nguyễn Đình Hoàng, ThS. Nguyễn Thị Thanh Bảo đã giúp đỡ tui thực hiện các phép đo quang học, phép đo thời gian sống và các phép đo tương quan huỳnh quang.
tui xin chân thành Thank PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳ, PGS.TS. Lê Quang Huấn, ThS. Trần Thanh Thủy, ThS. Lê Thị Thanh Xuân và cộng sự đã giúp đỡ tui trong các thí nghiệm đánh dấu sinh học.
NỘI DUNG:
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ LIÊN QUAN .................................. 10
1.1. Chất màu hữu cơ .............................................................................................. 10
1.1.1. Cấu trúc hóa học ........................................................................................... 10
1.1.2. Cấu trúc mức năng lượng và các dịch chuyển quang học ............................ 11
1.1.3. Quang phổ của chất màu .............................................................................. 13
1.1.4. Độ ổn định quang học của các tâm màu hữu cơ ........................................... 15
1.1.5. Hiện tượng dập tắt vì nồng độ ...................................................................... 16
1.1.6. Ảnh hưởng của môi trường .......................................................................... 17
1.1.6.1. Ảnh hưởng của dung môi........................................................................... 17
1.1.6.2. Sự kết tụ các phân tử màu ......................................................................... 18
1.2. Các hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ ....................................................... 18
1.2.1. Các hạt nano silica và latex .......................................................................... 18
1.2.2. Các hạt nano silica/ormosil .......................................................................... 19
1.2.3. Phương pháp chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ ........................ 20
1.2.3.1. Phương pháp Stober ............................................................................
1.2.3.2. Các phương pháp micelle ....................................................................
1.2.4. Các đặc trưng hóa lý ...............................................................................
1.2.4.1. Vật liệu nền ..........................................................................................
1.2.4.2. Độ chói và độ bền quang .....................................................................
1.2.4.3. Thế Zeta................................................................................................
1.2.5. Các hạt nano silica hợp sinh ......................................................................... 26
1.2.5.1. Yêu cầu của các hạt nano silica hợp sinh ............................................
1.2.5.2. Sự gắn kết của hạt nano silica với phân tử sinh học ..........................
1.2.6. Ứng dụng các hạt nano silica trong y – sinh học.......................................... 31
1.2.6.1. Phép thử miễn dịch (silica nanoparticles – based immunoassays) ........... 31
1.2.6.2. Tăng độ nhạy trong phân tích và hiện ảnh sinh học ................................. 31
1.1.6.3. Đầu dò DNA siêu nhạy .............................................................................. 32
1.1.6.4. Phân tích đa kênh ...................................................................................... 32
1.1.6.5. Hiện ảnh tế bào ung thư và chẩn đoán ung thư sớm................................. 33
1.1.6.6. Máy đếm dòng tế bào (flow cytometer) ..................................................... 34
1.2.6.7. Vận chuyển thuốc ...................................................................................... 35
1.3. Các đối tượng sinh học .................................................................................... 36
1.3.1. Protein ........................................................................................................... 36
1.3.2. Albumin - protein bovine serum albumin (BSA) ........................................ 36
1.3.3. Strepavidin (SA) ........................................................................................... 37
1.3.4. Kháng thể ...................................................................................................... 37
1.3.5. Kháng nguyên ............................................................................................... 38
1.3.6. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) .............................................................. 39
1.3.7. Phản ứng miễn dịch (phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể) ............ 39
1.3.7.1. Khái niệm................................................................................................... 39
1.3.7.2. Cơ chế kết hợp kháng nguyên và kháng thể .............................................. 39
1.4. Kết luận chương 1 ........................................................................................... 40
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM.............................................................................. 41
2.1. Các thí nghiệm chế tạo .................................................................................... 41
2.1.1. Chế tạo các hạt nano silica/ormosil (silica) chứa tâm màu RB bằng
41
phương pháp micelle thuận ....................................................................................
2.1.1.1. Chế tạo và chức năng hóa hạt nano silica chứa tâm màu RB .................. 41
2.1.1.2. Bọc hạt nano silica bằng protein............................................................... 46
2.1.1.3. Chế tạo mẫu cho nghiên cứu tính chất quang lý ....................................... 49
2.1.2. Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp
50
micelle đảo ..............................................................................................................
2.1.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ FITC đến khả năng phản ứng với
APTES .....................................................................................................................
2.1.2.2. Chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu FITC ............................................ 51
2.1.3. Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp
Stober ......................................................................................................................
2.1.3.1. Chế tạo hạt nano silica chứa FITC. Khảo sát ảnh hưởng của lượng
xúc tác lên kích thước hạt .......................................................................................
2.1.3.2. Chức năng hóa bề mặt hạt nano silica chứa FITC ................................... 54
2.2. Các phương pháp nghiên cứu thông số vật liệu .............................................. 55
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu hình thái và kích thước hạt .................................. 55
2.2.1.1. Hiển vi điện tử quét (SEM) ........................................................................ 56
2.2.1.2. Hiển vi điện tử truyền qua (TEM) ............................................................. 56
2.2.2. Phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS)
xác định độ đơn phân tán, đường kính thủy động học và thế Zeta ........................
2.2.3. Phương pháp phổ huỳnh quang tương quan (Fluorescence Correlation
Spectroscopy – FCS) xác định kích thước hạt và hệ số khuếch tán .......................
2.2.4. Phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại xác định cấu trúc hóa học ................ 59
2.2.5. Các phương pháp nghiên cứu tính chất quang lý ......................................... 63
2.2.5.1. Phương pháp phổ hấp thụ ......................................................................... 63
2.2.5.2. Phương pháp phổ huỳnh quang................................................................. 64
2.2.5.3. Hiệu suất lượng tử ..................................................................................... 65
2.2.5.4. Thời gian sống phát quang ........................................................................ 67
2.2.6. Phương pháp và thiết bị sử dụng trong ứng dụng sinh học .......................... 68
2.2.6.1. Kính hiển vi quang học .............................................................................. 68
2.2.6.2. Thiết bị đếm tế bào trong dòng chảy ......................................................... 70
2.3. Kết luận chương 2 ........................................................................................... 71
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ CHẾ TẠO VÀ CÁC ĐẶC TRƯNG QUANG LÝ........ 73
3.1. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các nhóm chức năng khác nhau trên bề
73
mặt theo phương pháp micelle thuận .....................................................................
3.1.1. Hình dạng, kích thước hạt ............................................................................ 73
3.1.2. Cấu trúc hóa học ........................................................................................... 74
3.1.3. Đường kính thủy động học ........................................................................... 77
3.1.4. Các đặc trưng quang học .............................................................................. 80
3.1.4.1. Hấp thụ và huỳnh quang............................................................................ 80
3.1.4.2. Hiệu suất lượng tử và thời gian sống phát quang ..................................... 81
3.2. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các kích thước khác nhau theo phương
pháp micelle thuận ..................................................................................................
3.2.1. Đường kính thủy động học và thế Zeta (ζ) .................................................. 86
3.2.2. Các đặc trưng quang lý phụ thuộc vào kích thước hạt nano ........................ 88
3.2.2.1. Tính chất quang ......................................................................................... 88
3.2.2.2. Độ phân cực huỳnh quang ......................................................................... 92
3.2.3.3. Kết quả đo kích thước hạt và hệ số khuếch tán bằng phương pháp
FCS .........................................................................................................................
3.3. Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein Bovine serum albumine (BSA) ...... 95
3.3.1. Hình dạng, kích thước .................................................................................. 95
3.3.2. Tính chất quang ............................................................................................ 96
3.4. Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein streptavidin (SA) ............................ 98
3.4.1. Hình dạng, kích thước .................................................................................. 98
3.4.2. Tính chất quang ............................................................................................ 98
3.4.2.1. Phổ huỳnh quang trong nước .................................................................... 98
3.4.2.2. Phổ huỳnh quang hạt nano silica bọc protein trong PBS ......................... 99
3.5. Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp micelle đảo ...................... 100
3.5.1. Ảnh hưởng của lượng ethanol đến khả năng phản ứng của FITC với
100
APTES ....................................................................................................................
3.5.2. Tính chất quang ............................................................................................ 102
3.6. Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp Stober .............................. 104
3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của lượng xúc tác lên kích thước hạt........................... 104
3.6.2. Tính chất quang ............................................................................................ 105
3.6.3. Chức năng hóa .............................................................................................. 107
3.6.3.1. Kết quả chức năng hóa hạt nano bằng nhóm chức NH2 ........................... 107
3.6.3.2. Kết quả dập tắt nhóm OH trên bề mặt hạt ................................................ 108
3.6.3.3. Chức năng hóa hạt nano silica bằng nhóm chức COOH.......................... 110
3.7. Kết luận chương 3 ........................................................................................... 112
CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG HẠT NANO SILICA LÀM CHẤT ĐÁNH DẤU
114
SINH HỌC .............................................................................................................
4.1. Thí nghiệm ứng dụng hạt nano silica làm chất đánh dấu y – sinh .................. 114
4.1.1. Thí nghiệm phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp miễn
114
dịch huỳnh quang....................................................................................................
4.1.1.1. Chế tạo phức hệ SiO2RB@KT đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 .......... 114
4.1.1.2. Sử dụng phức hệ SiO2RB@KT để nhận biết tế bào vi khuẩn E. coli
114
O157 :H7 ................................................................................................................
4.1.1.3. Hiện ảnh tế bào ......................................................................................... 114
4.1.1.4. Xây dựng phương pháp phổ quang học để xác định số lượng vi khuẩn ... 115
4.1.2. Phát hiện tế bào ung thư vú .......................................................................... 115
4.1.2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất ...................................................................... 115
4.1.2.2. Chế tạo phức hệ hạt nano silica chứa RB - kháng thể HER2
115
(SiO2RB@HER2) ....................................................................................................
4.1.2.3. Nuôi cấy tế bào .......................................................................................... 115
4.1.2.4. Sử dụng phức hệ SiO2RB@HER2 để nhận biết tế bào ung thư vú KPL4
4.1.2.5. Thí nghiệm đếm tế bào trong dòng chảy ................................................... 116
4.1.3. Phát hiện tế bào ung thư vú BT-474 ............................................................. 116
4.1.3.1. Chế tạo phức hệ hạt nano silica chứa FITC – kháng thể HER2
116
(SiO2FITC@HER2) ................................................................................................
2.1.3.2. Nhận biết tế bào BT-474bằng phức hệ SiO2FITC@HER2 ....................... 116
4.2. Kết quả phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp miễn dịch
117
huỳnh quang ...........................................................................................................
4.2.1. Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang ..................................................... 117
4.2.2. Xây dựng phương pháp quang phổ huỳnh quang xác định định lượng vi
119
khuẩn E. coli O157:H7 ...........................................................................................
4.3. Nhận biết tế bào ung thư vú ............................................................................ 121
4.3.1. Phát hiện tế bào ung thư vú bằng ảnh hiển vi huỳnh quang ........................ 121
4.3.2. Phát hiện định lượng tế bào ung thư vú bằng thiết bị đếm tế bào ............... 124
4.4. Phát hiện tế bào ung thư vú bằng hạt nano silica chứa tâm màu FITC ........... 127
4.5. Kết luận chương 4 ........................................................................................... 127
KẾT LUẬN ............................................................................................................ 129
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC SỬ DỤNG TRONG LUẬN
131
ÁN ..........................................................................................................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................... 133
Đối với các phân tử đơn giản gồm hai nguyên tử, dao động quay của phân tử
có thể coi là dao động không điều hòa của một quay tử và phổ thu được thường là
một phổ đám tập hợp nhiều vạch nhỏ ứng với tần số ν = νdd ± νqy. Các vạch nhỏ có
tần số cách đều nhau bằng νqy , còn chính bản thân νdd thì không xuất hiện.
Tất cả các phân tử được cấu tạo từ các nguyên tử nối với nhau bằng các liên
kết hóa học. Dao động của các nguyên tử liên kết hóa học giống như dao động của
một hệ thống các quả cầu nối với nhau bằng các lò xo. Chuyển động của các quả
cầu đó có thể coi là kết quả của sự chồng chập hai dao động: kéo căng và uốn cong.
Tần số dao động không những phụ thuộc vào bản chất của từng liên kết riêng
biệt như: C-H hay C-O, mà còn phụ thuộc vào cả phân tử và môi trường xung
quanh nó. Tương tự như trong hệ các quả cầu lò xo, cả hệ thống tác động lên dao
động của từng quả cầu. Biên độ dao động của một hệ sẽ tăng lên dưới tác động của
sự va đập. Tương tự như vậy, biên độ dao động của các liên kết hóa học và cùng
với chúng là dao động của các điện tích cũng tăng lên khi trường điện từ (sóng hồng
ngoại) tác động lên chúng. Sự khác nhau giữa hệ cầụ lò xo và phân tử nằm ở mức
năng lượng của dao động phân tử lượng tử hóa. Do đó các phân tử chỉ hấp thụ các
sóng hồng ngoại có năng lượng tương ứng với khoảng cách giữa hai mức năng
lượng dao động của nguyên tử. Như vậy, biên độ dao động tăng không liên tục mà
nhảy bậc.
Đối với phân tử nhiều nguyên tử, dao động quay thường rất phức tạp, tuy
nhiên luôn có thể quy một chuyển động phức tạp thành một số những dao động đơn
giản hơn gọi là dao động riêng. Giả sử phân tử có N nguyên tử, vị trí mỗi nguyên tử
được xác định bởi 3 tọa độ, như vậy phân tử có 3N bậc tự do. Trong số đó có 3 bậc
tự do dùng để mô tả chuyển động tịnh tiến, 3 bậc tự do dùng để mô tả chuyển động
quay của phân tử, còn lại 3N-6 bậc tự do dao động riêng. Nói cách khác, phân tử sẽ
có 3N-6 bậc dao động riêng (đối với phân tử không thẳng) và 3N-5 dao động riêng
(đối với phân tử thẳng). Mỗi dao động riêng có một mức năng lượng nhất định.
Trường hợp 2-3 dao động có cùng một mức năng lượng gọi là dao động suy biến.
Người ta phân biệt dao động riêng thành hai loại:
1- Dao động hóa trị (ký hiệu là υ) là những dao động làm thay đổi chiều dài
liên kết của các nguyên tử trong phân tử nhưng không làm thay đổi góc liên kết.
2- Dao động biến dạng (ký hiệu là δ) là những dao động làm thay đổi góc
liên kết nhưng không làm thay đổi chiều dài liên kết của các nguyên tử trong phân
tử.
Mỗi loại dao động còn được phân chia thành dao động đối xứng (ký hiệu là
υs và δs) và bất đối xứng (ký hiệu là υas và δas).
* Vị trí phổ:
Vùng phổ từ 1500 - 4000 cm-1 chứa các dải hấp thụ của dao động hoá trị hầu
hết các nhóm chức như: OH, NH, C=N, C=C... Nên được gọi là vùng nhóm chức.
Vùng phổ dưới 1600 cm-1 phức tạp hơn, gồm các dao động co dãn và biến dạng góc
của các liên kết. Đồng thời dao động này thường được tập hợp lại như C-C-C-O làm
cho tương tác giữa các liên kết mạnh hơn làm dịch vị trí, dãn rộng và biến dạng phổ.
Khoảng thấp hơn: 1300 - 650 cm-1 là vùng phổ đặc trưng của các liên kết và thường
dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là các nhóm chức của nó. Vùng này được gọi
là vùng “vân ngón tay”.
Dao động của các nhóm nguyên tử trong phân tử không phải là dao động
định vị mà chịu sự tương tác qua lại với các nhóm dao động khác trong toàn phân
tử. Đồng thời vị trí của phổ cũng phụ thuộc tỷ lệ thuận vào hằng số lực hóa trị và tỷ
lệ nghịch với khối lượng của các nguyên tử tham gia dao động.
Vị trí của phổ còn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác như: sự thế đồng vị, hiệu
ứng electron, các yếu tố không gian, các liên kết hydro nội phân tử và tương tác
giữa các phân tử hay là môi trường xung quanh phân tử.
* Cường độ và hình dạng phổ:
Phổ hồng ngoại được ghi dưới dạng đường cong sự phụ thuộc của phần trăm
truyền qua (100 I/I0) vào số sóng. Sự hấp thụ của các nhóm nguyên tử được thể hiện
bởi những đám phổ với các đỉnh phổ ở các số sóng xác định. Việc định lượng chính
xác cường độ thường gặp khó khăn, sai số lớn nên các phổ thường chỉ được đánh
giá định tính với mức độ: mạnh (m), trung bình (tb) và yếu (y).
Khi phân tích phổ hồng ngoại, ngoài việc xem xét vị trí như đã trình bày ở
trên, phân tử không thể hấp thụ bức xạ một cách hỗn loạn, mà chỉ hấp thụ những
bức xạ tương ứng chính xác với biến thiên giữa các mức năng lượng của chúng.
Theo nguyên tắc chọn lọc của cơ lượng tử, để một chuyển dời dao động có thể xảy
ra thì phải có sự biến đổi của momen lưỡng cực điện dµ/dr ≠ 0 trong quá trình
chuyển dời. Nghĩa là sự chuyển mức năng lượng dao động nhất thiết phải đi kèm
theo sự thay đổi của các trung tâm điện tích trong phân tử, tức là thay đổi sự phân
bố điện tích trong phân tử. Theo qui tắc chọn lọc này, những phân tử đối xứng về
mặt phân bố điện tích như hydro H2 hay Nitơ N2... không có quang phổ quay và
CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG HẠT NANO SILICA LÀM CHẤT
ĐÁNH DẤU SINH HỌC
4.1. Thí nghiệm ứng dụng hạt nano silica làm chất đánh dấu y - sinh
4.1.1. Thí nghiệm phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp miễn
dịch huỳnh quang
Một trong các tiêu chí của chất đánh dấu sinh học là khả năng gắn kết của
chất đó với các phần tử sinh học đặc hiệu. Vì vậy, dể khảo sát khả năng sử dụng hạt
silica làm chất đánh dấu sinh học, kháng thể đặc hiệu vi khuẩn E.coli O157:H7 và tế
bào ung thư vú đã được sử dụng để gắn kết với hạt nano silica chứa tâm màu RB để
tạo thành phức hệ hạt silica – kháng thể (SiO2RB@KT)
4.1.1.1. Chế tạo phức hệ SiO2RB@KT đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7
Lấy 80 µl kháng thể đặc hiệu nồng độ 0,1 mg/ml pha loãng 10 lần rồi hòa
với 1200 µl EDAC 4 mM trong đệm MES pH 5,5, vortex đều trong 30 phút để hoạt
hóa các nhóm carboxyl. Sau đó bổ sung 5 µl silica chứa tâm màu RB, kích thước 20
nm, nồng độ 10 mg/ml. Hỗn hợp dịch được ủ lắc ngang liên tục ở 30oC trong 3 giờ.
Sau đó, ly tâm 30.000 vòng/phút trong 1 giờ để loại bỏ hạt silica và kháng thể còn dư.
Rửa 2 lần với dịch PBS pH 7,4. Cặn thu được hòa tan vào 1500 µl PBS với BSA 1%
(Bovin serum albumine) và bảo quản ở 4oC.
4.1.1.2. Sử dụng phức hệ SiO2RB@KT để nhận biết tế bào vi khuẩn E. coli
O157:H7
Vi khuẩn E. coli O157:H7 được cung cấp bởi Viện Công nghệ Sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phức hệ SiO2RB@KT (50 µl) được trộn với vi khuẩn (5 µl, 104 CFU/ml), ủ
lắc trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, được ủ trong thời gian 30 phút ở 370C,
rồi li tâm ở 12.000 vòng/phút để loại bỏ các chất còn dư. Cặn thu được sau đó được
phân tán trong 100 μl dung dịch đệm 0,1 M phosphate buffered saline (PBS), quá
trình rửa như vậy được thực hiện 3 lần. Mẫu đối chứng ủ với hạt nano silica, không
có kháng thể cũng được thực hiện theo quy trình tương tự như trên.
4.1.1.3. Hiện ảnh tế bào
Các mẫu vi khuẩn E. coli O157:H7 sau khi ủ với phức hệ SiO2RB@KT được
chụp ảnh trên kính hiển vi truyền qua, huỳnh quang, điện tử quét (SEM) và điện tử
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Chế tạo và nghiên cứu tính chất quang của hạt nano silica chứa tâm màu và thử nghiệm ứng dụng trong đánh dấu
tui xin trân trọng Thank Phòng thí nghiệm trọng điểm Photonics – Viện Vật lý, Bộ Giáo dục và Đào tạo, Viện Vật lý và Phòng Sau đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tui trong quá trình làm luận án. Đặc biệt, tui xin chân thành Thank GS.TS. Viện trưởng Nguyễn Đại Hưng và TS. Nguyễn Thanh Bình đã tạo điều kiện để tui có thể hoàn thành được luận án của mình. tui xin Thank NCS. Nguyễn Đình Hoàng, ThS. Nguyễn Thị Thanh Bảo đã giúp đỡ tui thực hiện các phép đo quang học, phép đo thời gian sống và các phép đo tương quan huỳnh quang.
tui xin chân thành Thank PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳ, PGS.TS. Lê Quang Huấn, ThS. Trần Thanh Thủy, ThS. Lê Thị Thanh Xuân và cộng sự đã giúp đỡ tui trong các thí nghiệm đánh dấu sinh học.
NỘI DUNG:
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ LIÊN QUAN .................................. 10
1.1. Chất màu hữu cơ .............................................................................................. 10
1.1.1. Cấu trúc hóa học ........................................................................................... 10
1.1.2. Cấu trúc mức năng lượng và các dịch chuyển quang học ............................ 11
1.1.3. Quang phổ của chất màu .............................................................................. 13
1.1.4. Độ ổn định quang học của các tâm màu hữu cơ ........................................... 15
1.1.5. Hiện tượng dập tắt vì nồng độ ...................................................................... 16
1.1.6. Ảnh hưởng của môi trường .......................................................................... 17
1.1.6.1. Ảnh hưởng của dung môi........................................................................... 17
1.1.6.2. Sự kết tụ các phân tử màu ......................................................................... 18
1.2. Các hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ ....................................................... 18
1.2.1. Các hạt nano silica và latex .......................................................................... 18
1.2.2. Các hạt nano silica/ormosil .......................................................................... 19
1.2.3. Phương pháp chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu hữu cơ ........................ 20
1.2.3.1. Phương pháp Stober ............................................................................
1.2.3.2. Các phương pháp micelle ....................................................................
1.2.4. Các đặc trưng hóa lý ...............................................................................
1.2.4.1. Vật liệu nền ..........................................................................................
1.2.4.2. Độ chói và độ bền quang .....................................................................
1.2.4.3. Thế Zeta................................................................................................
1.2.5. Các hạt nano silica hợp sinh ......................................................................... 26
1.2.5.1. Yêu cầu của các hạt nano silica hợp sinh ............................................
1.2.5.2. Sự gắn kết của hạt nano silica với phân tử sinh học ..........................
1.2.6. Ứng dụng các hạt nano silica trong y – sinh học.......................................... 31
1.2.6.1. Phép thử miễn dịch (silica nanoparticles – based immunoassays) ........... 31
1.2.6.2. Tăng độ nhạy trong phân tích và hiện ảnh sinh học ................................. 31
1.1.6.3. Đầu dò DNA siêu nhạy .............................................................................. 32
1.1.6.4. Phân tích đa kênh ...................................................................................... 32
1.1.6.5. Hiện ảnh tế bào ung thư và chẩn đoán ung thư sớm................................. 33
1.1.6.6. Máy đếm dòng tế bào (flow cytometer) ..................................................... 34
1.2.6.7. Vận chuyển thuốc ...................................................................................... 35
1.3. Các đối tượng sinh học .................................................................................... 36
1.3.1. Protein ........................................................................................................... 36
1.3.2. Albumin - protein bovine serum albumin (BSA) ........................................ 36
1.3.3. Strepavidin (SA) ........................................................................................... 37
1.3.4. Kháng thể ...................................................................................................... 37
1.3.5. Kháng nguyên ............................................................................................... 38
1.3.6. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) .............................................................. 39
1.3.7. Phản ứng miễn dịch (phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể) ............ 39
1.3.7.1. Khái niệm................................................................................................... 39
1.3.7.2. Cơ chế kết hợp kháng nguyên và kháng thể .............................................. 39
1.4. Kết luận chương 1 ........................................................................................... 40
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM.............................................................................. 41
2.1. Các thí nghiệm chế tạo .................................................................................... 41
2.1.1. Chế tạo các hạt nano silica/ormosil (silica) chứa tâm màu RB bằng
41
phương pháp micelle thuận ....................................................................................
2.1.1.1. Chế tạo và chức năng hóa hạt nano silica chứa tâm màu RB .................. 41
2.1.1.2. Bọc hạt nano silica bằng protein............................................................... 46
2.1.1.3. Chế tạo mẫu cho nghiên cứu tính chất quang lý ....................................... 49
2.1.2. Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp
50
micelle đảo ..............................................................................................................
2.1.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ FITC đến khả năng phản ứng với
APTES .....................................................................................................................
2.1.2.2. Chế tạo hạt nano silica chứa tâm màu FITC ............................................ 51
2.1.3. Chế tạo các hạt nano silica chứa tâm màu FITC bằng phương pháp
Stober ......................................................................................................................
2.1.3.1. Chế tạo hạt nano silica chứa FITC. Khảo sát ảnh hưởng của lượng
xúc tác lên kích thước hạt .......................................................................................
2.1.3.2. Chức năng hóa bề mặt hạt nano silica chứa FITC ................................... 54
2.2. Các phương pháp nghiên cứu thông số vật liệu .............................................. 55
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu hình thái và kích thước hạt .................................. 55
2.2.1.1. Hiển vi điện tử quét (SEM) ........................................................................ 56
2.2.1.2. Hiển vi điện tử truyền qua (TEM) ............................................................. 56
2.2.2. Phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS)
xác định độ đơn phân tán, đường kính thủy động học và thế Zeta ........................
2.2.3. Phương pháp phổ huỳnh quang tương quan (Fluorescence Correlation
Spectroscopy – FCS) xác định kích thước hạt và hệ số khuếch tán .......................
2.2.4. Phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại xác định cấu trúc hóa học ................ 59
2.2.5. Các phương pháp nghiên cứu tính chất quang lý ......................................... 63
2.2.5.1. Phương pháp phổ hấp thụ ......................................................................... 63
2.2.5.2. Phương pháp phổ huỳnh quang................................................................. 64
2.2.5.3. Hiệu suất lượng tử ..................................................................................... 65
2.2.5.4. Thời gian sống phát quang ........................................................................ 67
2.2.6. Phương pháp và thiết bị sử dụng trong ứng dụng sinh học .......................... 68
2.2.6.1. Kính hiển vi quang học .............................................................................. 68
2.2.6.2. Thiết bị đếm tế bào trong dòng chảy ......................................................... 70
2.3. Kết luận chương 2 ........................................................................................... 71
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ CHẾ TẠO VÀ CÁC ĐẶC TRƯNG QUANG LÝ........ 73
3.1. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các nhóm chức năng khác nhau trên bề
73
mặt theo phương pháp micelle thuận .....................................................................
3.1.1. Hình dạng, kích thước hạt ............................................................................ 73
3.1.2. Cấu trúc hóa học ........................................................................................... 74
3.1.3. Đường kính thủy động học ........................................................................... 77
3.1.4. Các đặc trưng quang học .............................................................................. 80
3.1.4.1. Hấp thụ và huỳnh quang............................................................................ 80
3.1.4.2. Hiệu suất lượng tử và thời gian sống phát quang ..................................... 81
3.2. Kết quả chế tạo hạt nano silica với các kích thước khác nhau theo phương
pháp micelle thuận ..................................................................................................
3.2.1. Đường kính thủy động học và thế Zeta (ζ) .................................................. 86
3.2.2. Các đặc trưng quang lý phụ thuộc vào kích thước hạt nano ........................ 88
3.2.2.1. Tính chất quang ......................................................................................... 88
3.2.2.2. Độ phân cực huỳnh quang ......................................................................... 92
3.2.3.3. Kết quả đo kích thước hạt và hệ số khuếch tán bằng phương pháp
FCS .........................................................................................................................
3.3. Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein Bovine serum albumine (BSA) ...... 95
3.3.1. Hình dạng, kích thước .................................................................................. 95
3.3.2. Tính chất quang ............................................................................................ 96
3.4. Kết quả bọc hạt nano silica bằng protein streptavidin (SA) ............................ 98
3.4.1. Hình dạng, kích thước .................................................................................. 98
3.4.2. Tính chất quang ............................................................................................ 98
3.4.2.1. Phổ huỳnh quang trong nước .................................................................... 98
3.4.2.2. Phổ huỳnh quang hạt nano silica bọc protein trong PBS ......................... 99
3.5. Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp micelle đảo ...................... 100
3.5.1. Ảnh hưởng của lượng ethanol đến khả năng phản ứng của FITC với
100
APTES ....................................................................................................................
3.5.2. Tính chất quang ............................................................................................ 102
3.6. Kết quả chế tạo hạt nano silica theo phương pháp Stober .............................. 104
3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của lượng xúc tác lên kích thước hạt........................... 104
3.6.2. Tính chất quang ............................................................................................ 105
3.6.3. Chức năng hóa .............................................................................................. 107
3.6.3.1. Kết quả chức năng hóa hạt nano bằng nhóm chức NH2 ........................... 107
3.6.3.2. Kết quả dập tắt nhóm OH trên bề mặt hạt ................................................ 108
3.6.3.3. Chức năng hóa hạt nano silica bằng nhóm chức COOH.......................... 110
3.7. Kết luận chương 3 ........................................................................................... 112
CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG HẠT NANO SILICA LÀM CHẤT ĐÁNH DẤU
114
SINH HỌC .............................................................................................................
4.1. Thí nghiệm ứng dụng hạt nano silica làm chất đánh dấu y – sinh .................. 114
4.1.1. Thí nghiệm phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp miễn
114
dịch huỳnh quang....................................................................................................
4.1.1.1. Chế tạo phức hệ SiO2RB@KT đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 .......... 114
4.1.1.2. Sử dụng phức hệ SiO2RB@KT để nhận biết tế bào vi khuẩn E. coli
114
O157 :H7 ................................................................................................................
4.1.1.3. Hiện ảnh tế bào ......................................................................................... 114
4.1.1.4. Xây dựng phương pháp phổ quang học để xác định số lượng vi khuẩn ... 115
4.1.2. Phát hiện tế bào ung thư vú .......................................................................... 115
4.1.2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất ...................................................................... 115
4.1.2.2. Chế tạo phức hệ hạt nano silica chứa RB - kháng thể HER2
115
(SiO2RB@HER2) ....................................................................................................
4.1.2.3. Nuôi cấy tế bào .......................................................................................... 115
4.1.2.4. Sử dụng phức hệ SiO2RB@HER2 để nhận biết tế bào ung thư vú KPL4
4.1.2.5. Thí nghiệm đếm tế bào trong dòng chảy ................................................... 116
4.1.3. Phát hiện tế bào ung thư vú BT-474 ............................................................. 116
4.1.3.1. Chế tạo phức hệ hạt nano silica chứa FITC – kháng thể HER2
116
(SiO2FITC@HER2) ................................................................................................
2.1.3.2. Nhận biết tế bào BT-474bằng phức hệ SiO2FITC@HER2 ....................... 116
4.2. Kết quả phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp miễn dịch
117
huỳnh quang ...........................................................................................................
4.2.1. Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang ..................................................... 117
4.2.2. Xây dựng phương pháp quang phổ huỳnh quang xác định định lượng vi
119
khuẩn E. coli O157:H7 ...........................................................................................
4.3. Nhận biết tế bào ung thư vú ............................................................................ 121
4.3.1. Phát hiện tế bào ung thư vú bằng ảnh hiển vi huỳnh quang ........................ 121
4.3.2. Phát hiện định lượng tế bào ung thư vú bằng thiết bị đếm tế bào ............... 124
4.4. Phát hiện tế bào ung thư vú bằng hạt nano silica chứa tâm màu FITC ........... 127
4.5. Kết luận chương 4 ........................................................................................... 127
KẾT LUẬN ............................................................................................................ 129
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC SỬ DỤNG TRONG LUẬN
131
ÁN ..........................................................................................................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................... 133
Đối với các phân tử đơn giản gồm hai nguyên tử, dao động quay của phân tử
có thể coi là dao động không điều hòa của một quay tử và phổ thu được thường là
một phổ đám tập hợp nhiều vạch nhỏ ứng với tần số ν = νdd ± νqy. Các vạch nhỏ có
tần số cách đều nhau bằng νqy , còn chính bản thân νdd thì không xuất hiện.
Tất cả các phân tử được cấu tạo từ các nguyên tử nối với nhau bằng các liên
kết hóa học. Dao động của các nguyên tử liên kết hóa học giống như dao động của
một hệ thống các quả cầu nối với nhau bằng các lò xo. Chuyển động của các quả
cầu đó có thể coi là kết quả của sự chồng chập hai dao động: kéo căng và uốn cong.
Tần số dao động không những phụ thuộc vào bản chất của từng liên kết riêng
biệt như: C-H hay C-O, mà còn phụ thuộc vào cả phân tử và môi trường xung
quanh nó. Tương tự như trong hệ các quả cầu lò xo, cả hệ thống tác động lên dao
động của từng quả cầu. Biên độ dao động của một hệ sẽ tăng lên dưới tác động của
sự va đập. Tương tự như vậy, biên độ dao động của các liên kết hóa học và cùng
với chúng là dao động của các điện tích cũng tăng lên khi trường điện từ (sóng hồng
ngoại) tác động lên chúng. Sự khác nhau giữa hệ cầụ lò xo và phân tử nằm ở mức
năng lượng của dao động phân tử lượng tử hóa. Do đó các phân tử chỉ hấp thụ các
sóng hồng ngoại có năng lượng tương ứng với khoảng cách giữa hai mức năng
lượng dao động của nguyên tử. Như vậy, biên độ dao động tăng không liên tục mà
nhảy bậc.
Đối với phân tử nhiều nguyên tử, dao động quay thường rất phức tạp, tuy
nhiên luôn có thể quy một chuyển động phức tạp thành một số những dao động đơn
giản hơn gọi là dao động riêng. Giả sử phân tử có N nguyên tử, vị trí mỗi nguyên tử
được xác định bởi 3 tọa độ, như vậy phân tử có 3N bậc tự do. Trong số đó có 3 bậc
tự do dùng để mô tả chuyển động tịnh tiến, 3 bậc tự do dùng để mô tả chuyển động
quay của phân tử, còn lại 3N-6 bậc tự do dao động riêng. Nói cách khác, phân tử sẽ
có 3N-6 bậc dao động riêng (đối với phân tử không thẳng) và 3N-5 dao động riêng
(đối với phân tử thẳng). Mỗi dao động riêng có một mức năng lượng nhất định.
Trường hợp 2-3 dao động có cùng một mức năng lượng gọi là dao động suy biến.
Người ta phân biệt dao động riêng thành hai loại:
1- Dao động hóa trị (ký hiệu là υ) là những dao động làm thay đổi chiều dài
liên kết của các nguyên tử trong phân tử nhưng không làm thay đổi góc liên kết.
2- Dao động biến dạng (ký hiệu là δ) là những dao động làm thay đổi góc
liên kết nhưng không làm thay đổi chiều dài liên kết của các nguyên tử trong phân
tử.
Mỗi loại dao động còn được phân chia thành dao động đối xứng (ký hiệu là
υs và δs) và bất đối xứng (ký hiệu là υas và δas).
* Vị trí phổ:
Vùng phổ từ 1500 - 4000 cm-1 chứa các dải hấp thụ của dao động hoá trị hầu
hết các nhóm chức như: OH, NH, C=N, C=C... Nên được gọi là vùng nhóm chức.
Vùng phổ dưới 1600 cm-1 phức tạp hơn, gồm các dao động co dãn và biến dạng góc
của các liên kết. Đồng thời dao động này thường được tập hợp lại như C-C-C-O làm
cho tương tác giữa các liên kết mạnh hơn làm dịch vị trí, dãn rộng và biến dạng phổ.
Khoảng thấp hơn: 1300 - 650 cm-1 là vùng phổ đặc trưng của các liên kết và thường
dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là các nhóm chức của nó. Vùng này được gọi
là vùng “vân ngón tay”.
Dao động của các nhóm nguyên tử trong phân tử không phải là dao động
định vị mà chịu sự tương tác qua lại với các nhóm dao động khác trong toàn phân
tử. Đồng thời vị trí của phổ cũng phụ thuộc tỷ lệ thuận vào hằng số lực hóa trị và tỷ
lệ nghịch với khối lượng của các nguyên tử tham gia dao động.
Vị trí của phổ còn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác như: sự thế đồng vị, hiệu
ứng electron, các yếu tố không gian, các liên kết hydro nội phân tử và tương tác
giữa các phân tử hay là môi trường xung quanh phân tử.
* Cường độ và hình dạng phổ:
Phổ hồng ngoại được ghi dưới dạng đường cong sự phụ thuộc của phần trăm
truyền qua (100 I/I0) vào số sóng. Sự hấp thụ của các nhóm nguyên tử được thể hiện
bởi những đám phổ với các đỉnh phổ ở các số sóng xác định. Việc định lượng chính
xác cường độ thường gặp khó khăn, sai số lớn nên các phổ thường chỉ được đánh
giá định tính với mức độ: mạnh (m), trung bình (tb) và yếu (y).
Khi phân tích phổ hồng ngoại, ngoài việc xem xét vị trí như đã trình bày ở
trên, phân tử không thể hấp thụ bức xạ một cách hỗn loạn, mà chỉ hấp thụ những
bức xạ tương ứng chính xác với biến thiên giữa các mức năng lượng của chúng.
Theo nguyên tắc chọn lọc của cơ lượng tử, để một chuyển dời dao động có thể xảy
ra thì phải có sự biến đổi của momen lưỡng cực điện dµ/dr ≠ 0 trong quá trình
chuyển dời. Nghĩa là sự chuyển mức năng lượng dao động nhất thiết phải đi kèm
theo sự thay đổi của các trung tâm điện tích trong phân tử, tức là thay đổi sự phân
bố điện tích trong phân tử. Theo qui tắc chọn lọc này, những phân tử đối xứng về
mặt phân bố điện tích như hydro H2 hay Nitơ N2... không có quang phổ quay và
CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG HẠT NANO SILICA LÀM CHẤT
ĐÁNH DẤU SINH HỌC
4.1. Thí nghiệm ứng dụng hạt nano silica làm chất đánh dấu y - sinh
4.1.1. Thí nghiệm phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phương pháp miễn
dịch huỳnh quang
Một trong các tiêu chí của chất đánh dấu sinh học là khả năng gắn kết của
chất đó với các phần tử sinh học đặc hiệu. Vì vậy, dể khảo sát khả năng sử dụng hạt
silica làm chất đánh dấu sinh học, kháng thể đặc hiệu vi khuẩn E.coli O157:H7 và tế
bào ung thư vú đã được sử dụng để gắn kết với hạt nano silica chứa tâm màu RB để
tạo thành phức hệ hạt silica – kháng thể (SiO2RB@KT)
4.1.1.1. Chế tạo phức hệ SiO2RB@KT đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7
Lấy 80 µl kháng thể đặc hiệu nồng độ 0,1 mg/ml pha loãng 10 lần rồi hòa
với 1200 µl EDAC 4 mM trong đệm MES pH 5,5, vortex đều trong 30 phút để hoạt
hóa các nhóm carboxyl. Sau đó bổ sung 5 µl silica chứa tâm màu RB, kích thước 20
nm, nồng độ 10 mg/ml. Hỗn hợp dịch được ủ lắc ngang liên tục ở 30oC trong 3 giờ.
Sau đó, ly tâm 30.000 vòng/phút trong 1 giờ để loại bỏ hạt silica và kháng thể còn dư.
Rửa 2 lần với dịch PBS pH 7,4. Cặn thu được hòa tan vào 1500 µl PBS với BSA 1%
(Bovin serum albumine) và bảo quản ở 4oC.
4.1.1.2. Sử dụng phức hệ SiO2RB@KT để nhận biết tế bào vi khuẩn E. coli
O157:H7
Vi khuẩn E. coli O157:H7 được cung cấp bởi Viện Công nghệ Sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phức hệ SiO2RB@KT (50 µl) được trộn với vi khuẩn (5 µl, 104 CFU/ml), ủ
lắc trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, được ủ trong thời gian 30 phút ở 370C,
rồi li tâm ở 12.000 vòng/phút để loại bỏ các chất còn dư. Cặn thu được sau đó được
phân tán trong 100 μl dung dịch đệm 0,1 M phosphate buffered saline (PBS), quá
trình rửa như vậy được thực hiện 3 lần. Mẫu đối chứng ủ với hạt nano silica, không
có kháng thể cũng được thực hiện theo quy trình tương tự như trên.
4.1.1.3. Hiện ảnh tế bào
Các mẫu vi khuẩn E. coli O157:H7 sau khi ủ với phức hệ SiO2RB@KT được
chụp ảnh trên kính hiển vi truyền qua, huỳnh quang, điện tử quét (SEM) và điện tử
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links