nguyenlam_nguyenlam26
New Member
Luận văn: Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pangasius hypophthalmus bằng kỹ thuật lamp (Loop-mediated isothermal amplification) : Luận án TS. Sinh học: 62 42 40 01
Nhà xuất bản: ĐHKHTN
Ngày: 2013
Được tạo ra: Wed Dec 18 14:57:36 2013
Đã thay đổi: Wed Dec 18 14:57:36 2013
Miêu tả: 149 tr.
Luận án TS. Vi sinh học -- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, 2013
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6
1.1. CÁ TRA VÀ BỆNH GAN THẬN MỦ 6
1.1.1. Cá tra Pangasianodon hypophthalmus 6
1.1.2. Bệnh gan mủ thận 9
1.1.2.1. Tác nhân gây bệnh 9
1.1.2.2. Đường lây truyền 11
1.1.2.3. Triệu chứng bệnh 12
1.1.2.4. Bệnh tích 13
1.1.2.5. Khả năng bùng phát bệnh 16
1.1.2.6. Điều trị bệnh 16
1.2. VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri 181.2.1. Đặc điểm sinh học 18
1.2.2. Đặc điểm hệ gen 23
1.2.3. Độc tố gây bệnh và gen mã hóa độc tố gây bệnh 24
1.3. TÌNH HÌNH BỆNH DỊCH 24
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN Edwarsiella ictaluri 28
1.4.1. Phương pháp vi sinh và hóa sinh 28
1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử 29
1.5. KỸ THUẬT LAMP (Loop- mediated isothermal amplifications) 30
1.5.1. Giới thiệu về kỹ thuật LAMP 32
1.5.2. Nguyên lý thiết kế mồi cho phản ứng LAMP 33
1.5.3. Cơ chế khuếch đại của phản ứng LAMP 35
1.5.4. Các cách phát hiện sự khuếch đại của phản ứng
LAMP
38
1.5.4.1. Điện di trên gel agarose 38
1.5.4.2. Phát hiện dựa vào chất phát huỳnh quang 39
1.5.4.3. Phát hiện dựa vào sản phẩm phụ của phản ứng 40
1.5.5. Ưu điểm của phương pháp LAMP 42
1.5.6. Các hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP tại Việt
Nam
43
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC 46
2.1.1. Vật liệu 46
2.1.2. Hóa chất và máy móc thiết bị 47
2.2. PHƯƠNG PHÁP 48
2.2.1. Phương pháp vi sinh và hóa sinh 49
2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử 51
2.2.2.1. Tách chiết DNA từ vi khuẩn 51
2.2.2.2. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli 51
2.2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 52
2.2.2.4. Thiết kế và tổng hợp các cặp mồi 53
2.2.2.5. Kĩ thuật PCR và LAMP 55
2.2.2.6. Phản ứng cắt DNA plasmid bằng enzym hạn chế 56
2.2.2.7. Ghép nối các đoạn DNA 57
2.2.2.8. Biến nạp DNA plasmid 58
2.2.2.9. Chọn lọc các thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp 59
2.2.2.10. Tinh sạch sản phẩm DNA plasmid bằng QIAGEN kit 59
2.2.2.11. Xác định trình tự nucleic acid 60
2.2.3. Tối ưu các điều kiện phản ứng LAMP 602.2.3.1. Xác định độ biến thiên Mg2+ trong phản ứng 60
2.2.3.2. Xác định nồng độ Mg2+ tối ưu 60
2.2.3.3. Xác định nồng dNTPs tối ưu 61
2.2.3.4. Xác định tỉ lệ mồi tối ưu 61
2.2.3.5. Xác định nồng độ betaine tối ưu 61
2.2.3.6. Xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu 61
2.2.3.7. Xác định thời gian phản ứng tối ưu 61
2.2.3.8. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng LAMP 61
2.2.3.9. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP 62
2.2.4. Phương pháp cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh vào vật chủ 62
2.2.4.1. Thiết kế thí nghiệm cảm nhiễm 62
2.2.4.2. Xác định LD50 63
2.2.4.3. Giải phẫu mô học 64
2.2.5. Xử lí số liệu bằng phần mềm vi tính 64
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 66
3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ TRA VIỆT NAM 66
3.1.1. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn 68
3.1.2. Nhuộm Gram 69
3.1.3. Khả năng di động, sinh indol và sinh H2S 69
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi3.1.4. Xác định hoạt tính catalase 72
3.1.5. Hoạt tính chondroitinase 73
3.1.6. Hoạt tính tan huyết 74
3.2. PHÂN LOẠI VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC
PHÂN TỬ
76
3.2.1. Tách chiết DNA genom của vi khuẩn 76
3.2.2. Phân loại bằng so sánh trình tự rDNA 16S 77
3.3. PHÂN LẬP, TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN eip18
CỦA VI KHUẨN E. ictaluri
79
3.3.1. Phân lập gen eip18 80
3.3.2. Tách dòng gen eip18 bằng vector pJet 2.1/blunt 81
3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen eip18 trong vector tái tổ hợp 81
3.3.4. Xác định trình tự gen eip18 83
3.4. THÍ NGHIỆM CẢM NHIỄM VI KHUẨN E. ictaluri 86
3.4.1. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E5 86
3.4.2. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E7 87
3.4.3. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E40 88
3.4.4. Dấu hiệu bệnh lý của cá sau khi cảm nhiễm 91
3.4.5. Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn 93
3.5. PHÁT HIỆN GEN eip18 CỦA VI KHUẨN E. ictaluri BẰNG KỸ
THUẬT LAMP
953.5.1. Khuếch đại gen eip18 bằng kỹ thuật LAMP 95
3.5.2. Tối ưu các điều kiện của phản ứng LAMP 97
3.5.2.1. Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng 97
3.5.2.2. Ảnh hưởng thời gian phản ứng 98
3.5.2.3. Ảnh hưởng của nồng dNTPs 99
3.5.2.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ mồi 100
3.5.2.5. Ảnh hưởng của nồng độ betaine 100
3.5.2.6. Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ 101
3.5.2.7. Ngưỡng phát hiện gen eip18 của phản ứng LAMP sử
dụng chỉ thị Calcein
105
3.5.2.8. Độ đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại gen eip18 bằng
phương pháp LAMP
108
KẾT LUẬN 110
KIẾN NGHỊ 112
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN
ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN
113
TÀI LIỆU THAM KHẢO 11
MỞ ĐẦU
Nuôi trồng thủy sản trong đó có nuôi cá tra thương phẩm hiện đóng một vai trò
quan trọng trong ngành xuất khẩu nói chung và xuất khẩu thủy sản nói riêng. Hoạt
động này đã và đang được nhiều chính phủ khuyến khích nhằm tạo ra lượng hàng hóa
có giá trị kinh tế cao, giải quyết vấn đề việc làm cho người lao động, tăng thu nhập và
góp phần đẩy lùi cùng kiệt đói ở các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, trong 10 năm trở
lại đây nghề nuôi cá tra đang phát triển rất nhanh với quy mô lớn tại một số tỉnh đồng
bằng Sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang… với
diện tích nuôi trồng đạt 6.300 ha mặt nước tính đến năm 2011 [15]. Cá tra Pangasius
hypophthalmus là loài đặc hữu của lưu vực sông Mê Kông và được xem là một trong
những đối tượng xuất khẩu tiềm năng. Ước tính trung bình kim ngạch xuất khẩu cá tra
hàng năm đóng góp khoảng 10% tổng kim ngạch xuất khẩu. Theo thống kê của Hiệp
hội nuôi trồng và xuất khẩu thủy sản, năm 2008 xuất khẩu cá tra ra thị trường thế giới
đạt 1,2 tỷ USD, năm 2009 đạt 1,34 tỷ USD, năm 2010 đạt 1,4 tỷ USD, năm 2011 đạt
1,8 tỷ USD, dự kiến kim ngạch xuất khẩu cá tra ra thị trường thế giới bao gồm Châu
Âu, Mỹ, Mexico… đạt 1,8 đến 2 tỷ USD đến hết năm 2012 [16].
Sự phát triển quá nhanh không theo quy hoạch của ngành nuôi cá tra tại khu vực
Đồng bằng sông Cửu long đã dẫn đến sự bùng nổ dịch bệnh trên diện rộng, dịch bệnh
diễn ra hàng năm gây thiệt hại không nhỏ cho người dân, ảnh hưởng nghiêm trọng tới
môi trường thủy sản và các ngành kinh tế liên quan. Một trong những bệnh nguy hiểm
trên cá tra là bệnh gan thận mủ hay còn gọi là bệnh đốm trắng nội tạng được phát hiện
lần đầu tiên tại Việt Nam vào đầu mùa lũ năm 1998 ở một số vùng nuôi cá thâm canh
trọng điểm như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau đó bệnh lan rộng ra các tỉnh
nuôi cá tra lân cận và cả một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre,
Sóc Trăng [3]. Thời kỳ cao điểm của bệnh dịch thường vào tháng 9 tới tháng 12. Bệnh
được đánh giá là vô cùng nguy hiểm do tốc độ lây lan nhanh, khó kiểm soát và khó
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi2
điều trị do bệnh không có những triệu chứng điển hình ở giai đoạn sớm. Tốc độ lây lan
của bệnh tỷ lệ thuận với mức độ thâm canh, mật độ nuôi cá trên một đơn vị diện tích ao
nuôi. Thêm vào đó, vấn đề quản lý nguồn nước, quản lý thức ăn và khống chế bệnh
dịch còn chưa đáp ứng kịp với việc mở rộng diện tích nuôi trồng hàng năm dẫn đến
việc khi đã xuất hiện bệnh thì thường gây ra dịch cho cả một vùng nuôi trồng thủy sản.
Do đó, việc xác định sớm và nhanh tác nhân gây bệnh sẽ đóng góp không nhỏ vào vấn
đề kiểm soát bệnh dịch, giảm thiểu những tổn thất kinh tế cho người nuôi và các ngành
kinh tế liên quan. Tại Việt Nam, tuy đã có nhiều công trình nghiên cứu xác định tác
nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nhưng chưa có sự thống nhất về kết quả. Năm
2001, Ferguson và cs đã công bố tác nhân gây bệnh là Bacillus sp. [43]. Một năm sau
đó tác giả lại đính chính tác nhân gây bệnh là Edwardsiella ictaluri [36]. Cũng trong
năm đó, ở Indonesia nhóm nghiên cứu của Kei Yuasa và cs lần đầu tiên chứng minh E.
ictaluri là tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng ở cá tra [119]. Năm 2003 Trần Thị
Minh Tâm và cs công bố tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Hanfia alvei và Pleisiomonas
shigelloides [11]. Khác hoàn toàn với các kết quả nghiên cứu trước đây, khi Lý Thị
Thanh Loan và cs năm 2007 công bố tác nhân gây bệnh là Clostridium sp. - trực khuẩn
Gram dương, kỵ khí bắt buộc trong khi các tác nhân được công bố trước đây đều là
trực khuẩn Gram âm [7]. Còn tại Mỹ, các nhà khoa học đã khẳng định chính xác tác
nhân gây hoại tử gan, thận và nhiễm trùng huyết trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus
là vi khuẩn E. ictaluri [94]. Mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu khẳng định tác
nhân gây bệnh gan thận mủ là E. ictaluri nhưng bên cạnh đó vẫn tồn tại những ý kiến
cho rằng đó là do vi khuẩn khác gây ra. Như vậy, việc xác định tác nhân chính gây
bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam là vấn đề cần được làm sáng tỏ.
Có rất nhiều phương pháp khác nhau để xác định sự có mặt của một tác nhân
gây bệnh từ những phương pháp truyền thống như: phân lập trên môi trường chọn lọc,
xác định đặc tính sinh lý, hóa sinh, phương pháp huyết thanh học… đến các phương
pháp phân tử như PCR, RT-PCR, multiplex PCR… Tuy nhiên, việc phát triển một3
phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh và có khả năng ứng dụng
nhanh bên ngoài phòng thí nghiệm đóng vai trò quan trọng không chỉ góp phần khẳng
định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam mà còn có ý nghĩa quan trọng
trong phòng chống, kiểm soát và điều trị bệnh. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tui tiến
hành đề tài:
“Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam
Pagasius hypophthalmus bằng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal
amplification”
Mục tiêu của đề tài:
- Xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pangasius
hypophthalmus.
- Chẩn đoán nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh trên các mẫu bệnh phẩm bằng
kỹ thuật LAMP.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi4
Nội dung nghiên cứu:
- Phân lập vi khuẩn từ các mẫu cá tra bị bệnh gan thận mủ thu được tại khu vực
Đồng bằng Sông Cửu Long.
- Xác định một số đặc điểm sinh hóa và phân loại dựa vào trình tự gen mã hóa
rARN 16S.
- Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen đặc trưng của vi khuẩn phân lập
được.
- Sử dụng kỹ thuật LAMP để phát hiện vi khuẩn dựa trên trình tự của gen đặc
trưng của vi khuẩn đó.
- Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng LAMP khuếch đại gen đặc trưng của vi
khuẩn
- Sử dụng chỉ thị kim loại Calcein để làm dấu hiệu phát hiện phản ứng bằng mắt
thường.5
Những đóng góp mới của luận án:
- Lần đầu tiên ứng dụng một phương pháp chẩn đoán phẩn tử mới có tên là
LAMP – khuếch đại đẳng nhiệt có tạo thành các vòng để xác định bệnh do vi
khuẩn gây ra ở thủy sản.
- Đây là phương pháp đơn giản, phát hiện nhanh kết quả bằng mắt thường dựa
vào sự thay đổi của chỉ thị kim loại Calcein từ cam sang xanh mà không cần sự
hỗ trợ của các thiết bị nghiên cứu khác.
Luận án được thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi6
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÁ TRA VÀ BỆNH GAN THẬN MỦ
1.1.1. Cá tra Pangasius hypophthalmus
Cá tra và cá basa là hai trong số 11 loài thuộc họ cá tra Pangasiidae đã được xác
định ở sông Cửu Long. Theo dẫn liệu từ
của loài cá tra được xác định như sau :
Giới: Animalia Linnaeus, 1758
Ngành: Chordata Bateson, 1885
Ngành phụ: Vertebrata Cuvier, 1812
Tổng lớp: Osteichthyes Huxley, 1880 – Bony fishes
Lớp: Actinopterygii Huxley, 1880 – Ray-finned fishes
Lớp phụ: Neopterygii
Tổng bộ: Ostaryphysi
Bộ: Siluriformes
Họ cá tra: Pangasiidae - Bleeker, 1858
Giống cá tra dầu: Pangasius Valenciennes in Cuvier and Valenciennes, 1840
Loài cá tra: Pangasius hypophthalmus (Sauvage, 1878)
Các đồng danh của loài cá tra bao gồm:
- Helicophagus hypophthalmus Sauvage, 1878
- Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878
- Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878
- Pangasius pangasius non Hamilton,1822
- Pangasius pleurotaenia non Sauvage, 1878
- Pangasius sutchi Fowler, 1937
Cá tra phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng hạ lưu sông Mê kông, có mặt ở cả bốn
nước Lào, Việt Nam, Campuchia, Thái Lan. Tài liệu phân loại gần đây nhất của tác giả
W. Rainboth xếp cá tra thuộc giống cá tra dầu. Tên loài Pangasianodon hypophthalmus7
được ông sử dụng lần đầu vào năm 1996 để chỉ định cho loài cá Tra và sau đó được
nhiều tác giả khác sử dụng phổ biến đến nay [85]. Tên đặt cho loài này khác nhau theo
vùng phân bố. Ở Campuchia là Trey pra (tên Khmer), Lào là Pa souay kheo, pa suay,
Thái là Pla saa wha, pla suey và Việt Nam là cá tra [14].
Ở nước ta những năm trước đây khi chưa có sinh sản cá nhân tạo, cá bột và cá
tra giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi,
rất ít gặp ở tự nhiên và địa phận Việt Nam do cá có tập tính di cư ngược dòng sông Mê
kông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên. Hiện nay, cá tra nước ta được đưa vào
nuôi công nghiệp trên quy mô lớn tại các vùng thuộc đồng bằng Sông Cửu Long bao
gồm các tỉnh trọng điểm như Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Bến Tre và
một số tỉnh lân cận với diện tích mặt nước lên đến 6.300 ha bao gồm cả diện tích mặt
nước tận dụng trên các sông lớn như sông Tiền và sông Hậu [15].
Cá nheo Mỹ thuộc họ Ictaluridae, bộ Siluriformes [103] với đặc điểm gồm 8 râu
quanh miệng, đuôi xẻ đôi sâu, nhiều đốm 2 bên cơ thể, vây lưng và vây ngực có gai
nhọn, cứng [110]. Loài cá này đẻ trứng dễ dàng nhưng lại không sinh sản trong ao
nuôi. Loài này có khả năng chịu oxi thấp, mật độ nuôi cao và có khả năng thích ứng
nhanh với sự thay đổi khí hậu, sử dụng được thức ăn công nghiệp nên được xem là đối
tượng tiềm năng của các mô hình nuôi trồng và sản xuất thủy sản ở quy mô công
nghiệp. Khác với cá nheo Mỹ về một số đặc điểm sinh học trong đó đặc điểm dễ nhận
thấy nhất là cá tra Pangasius hypophthalmus chỉ có 2 đôi râu ở miệng, đôi râu mép dài
và đôi râu hàm dưới ngắn [14]. Đối tượng này được nuôi ở quy mô công nghiệp ở một
số tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre,
Tiền Giang… với tốc độ phát triển rất nhanh và đem lại lợi ích cao cho người nông
dân. Tuy nhiên, thiệt hại hàng năm do bệnh dịch gây ra cũng rất lớn và mặc dù được
phát hiện muộn hơn so với một số các bệnh khác nhưng bệnh gan thận mủ được đánh
giá là bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng. Tỷ lệ cá chết do nhiễm bệnh cao, từ 50 - 60%
và nguy hiểm nhất là giai đoạn cá giống. Ở giai đoạn này tỷ lệ cá chết có thể lên tới
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi8
90% [3]. Bệnh nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời sẽ rất khó kiểm soát và
ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất mùa vụ và việc xuất khẩu ra thị trường thế giới.
Bảng 1.1. Diện tích và sản lượng nuôi cá tra ở các địa phương năm 2011 [15]
Tỉnh Sản lượng (tấn) Diện tích nuôi trồng (ha)
Tây Ninh 4.500 25
Tiền Giang 36.700 180
Bến Tre 126.750 650
Trà Vinh 28.622 131,7
Vĩnh Long 111.517 405,9
Đồng Tháp 341.884 1529
An Giang 245.000 1330
Cần Thơ 163.444 937
Hậu Giang 43.470 189
Sóc Trăng 27.400 167
Kiên Giang 6.966 27
Tổng cộng 1.136.253 5571,6
Về mặt xuất khẩu, cá tra là một trong những đối tượng xuất khẩu quan trọng có
đóng góp không nhỏ làm tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản hàng năm của Việt Nam.
Sản phẩm xuất khẩu chiếm ưu thế vẫn là hàng phi lê đông lạnh với giá trị xuất khẩu đạt
1,79 tỷ USD năm 2011 chiếm 99% tỷ trọng xuất khẩu cá tra của Việt Nam. Mặt hàng
chế biến vẫn còn khiêm tốn, chỉ chiếm 1% tổng giá trị xuất khẩu cá tra. Tính đến năm
2011, đã có hơn 230 doanh nghiệp xuất khẩu cá tra đến hơn 130 thị trường trên thế giới
bao gồm Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc và Hồng Kông, Australia,
Canada, Mehico, Nga… đạt giá trị 1,8 tỷ USD, tăng gần 26,5% với khối lượng xuất
khẩu trên 600 nghìn tấn, tăng 3% so với năm 2010 [15].9
1.1.2. Bệnh gan thận mủ
Bệnh gan thận mủ hay còn gọi là bệnh đốm trắng nội tạng, bệnh hoại tử gan
thận… là một trong những bệnh truyền nhiễm do tác nhân vi khuẩn gây ra. Động vật
thủy sản bị nhiễm bệnh và những xác động vật thủy sản bị bệnh chết là nguồn gây bệnh
chính. Tác nhân gây bệnh sinh sản rất nhanh làm tăng số lượng và đi vào môi trường
nước bằng nhiều con đường khác nhau như: theo các vết loét của cá để đi ra nước qua
hệ thống cơ quan bài tiết, cơ quan tiêu hóa, cơ quan sinh dục hay qua mang, xoang
miệng, xoang mũi. Ngoài ra, trong nước có nhiều chất mùn bã hữu cơ, nước thải các
nhà máy công nghiệp, nước thải của các trại chăn nuôi gia cầm, gia súc, nước thải sinh
hoạt, phân rác… cũng tạo điều kiện cho bệnh truyền nhiễm phát sinh, phát triển. Bệnh
lại có thể lây truyền theo chiều ngang giữa các cá thể và theo chiều dọc từ thế hệ này
sang thế hệ khác và có thể lây truyền trực tiếp hay gián tiếp. Do đó, khi đã xuất hiện cá
thể bệnh trong ao nuôi mà không phát hiện kịp thời để có hướng điều trị thích hợp thì
sẽ rất dễ bùng phát thành dịch gây tổn thất về kinh tế lớn cho người nuôi.
Ở ĐBSCL, bệnh gan thận mủ xuất hiện lần đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở các
tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau
đó, bệnh lan dần đến các vùng có nuôi cá tra lân cận. Đặc biệt, những năm gần đây
bệnh này cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến
Tre, Sóc Trăng [3]… và hiện nay, hầu hết các tỉnh có hoạt động nuôi trồng cá tra đều
có các báo cáo về việc phát hiện bệnh tại các ao nuôi và tình hình thiệt hại hàng năm.
1.1.2.1. Tác nhân gây bệnh
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri lần đầu tiên được phân lập năm 1976 từ cá da
trơn bị bệnh và đây là tác nhân chính gây nhiễm trùng huyết nội tạng trên cá da trơn,
một bệnh nghiêm trọng ảnh hưởng lớn đến ngành nuôi cá da trơn thương mại. Bệnh
tiến triển nhanh chóng và tỷ lệ tử vong cao làm thiệt hại đáng kể cho người nuôi cá
nheo ở vùng Đông nam nước Mỹ. Kể từ lần đầu tiên mô tả bệnh nhiễm khuẩn huyết
đường ruột trên cá da trơn, vi khuẩn E. ictaluri đã liên tục được phân lập từ các loài cá
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi10
không phải là cá da trơn như cá kiếm xanh, cá hồi … Vi khuẩn có thể được phân lập từ
thận, máu, não trên môi trường giàu dinh dưỡng ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ. Vi
khuẩn phát triển chậm nên việc xác định hình thái khuẩn lạc cũng như các đặc tính sinh
hóa điển hình cần nhiều thời gian. Đến năm 1981, Hawke và cs đã mô tả đầy đủ các
đặc tính của vi khuẩn và xếp vi khuẩn này vào chi Edwardsiella [49].
Trên đối tượng cá da trơn được nuôi trồng với mục đích xuất khẩu ở Việt Nam
như cá tra và cá basa những năm gần đây có dấu hiệu biểu hiện bệnh gan thận mủ hay
còn được gọi là bệnh đốm trắng gan, thận gây thiệt hại lớn cho người nuôi. Cá thường
bị nhiễm bệnh vào các tháng cuối năm khi nhiệt độ nước hạ thấp, khoảng từ tháng 9
đến tháng 1 năm sau. Tuy nhiên, hiện nay bệnh đã trở nên phổ biến trên cá tra và xảy ra
quanh năm. Nguyên nhân chính là do việc tăng diện tích và mức độ thâm canh cũng
như việc sát trùng nguồn nước của những ao nuôi bị nhiễm bệnh trước khi thải ra môi
trường chưa được kiểm soát triệt để. Thời điểm phát triển bệnh và khả năng lây lan của
bệnh khác nhau theo từng năm liên quan tới những biến động về thời tiết và điều kiện
nuôi trồng. Vi khuẩn luôn tồn tại trong môi trường ao nuôi và trong cơ thể cá khỏe
mạnh, khi bị sốc do vận chuyển, thay đổi nhiệt độ, thức ăn cũng có thể dẫn đến bùng
phát bệnh. Trung bình trong một vụ nuôi, bệnh có thể xuất hiện 3-4 lần, hao hụt giống
từ 10-50% chủ yếu ở giai đoạn cá giống từ 300-500 g tùy thuộc vào chế độ chăm sóc
và quản lý [2].
Tác nhân chính gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam vẫn còn là câu hỏi
chưa có câu trả lời chính xác. Bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi ở Đồng Bằng Sông
Cửu Long được phát hiện đầu tiên vào cuối năm 1998 và gọi là bệnh BNP (Bacillary
Necrosis of Pangasius) [43]. Khi cá tra bị bệnh, biểu hiện bên ngoài không có gì đặc
biệt, một số có hiện tượng xuất huyết ở các vây, có khi xuất huyết toàn thân, khi giải
phẫu và quan sát nội tạng thấy có nhiều đốm trắng trên gan, thận và tỳ tạng, trong
xoang bụng có chứa dịch hơi đặc. Theo Từ Thanh Dung và cs (2005) ở khu vực
ĐBSCL bệnh gan, thận mủ ảnh hưởng chủ yếu đến các tỉnh có nghề nuôi cá tra thâm11
canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ, sau đó bệnh lây lan sang
các vùng lân cận và hiện tại bệnh cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nuôi cá
tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng. Các vi khuẩn phân lập từ cá tra bị bệnh gan
thận mủ được định danh là E. ictaluri dựa trên các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh
hoá [36]. Còn ở khu vực Châu Á, Yuasa và cs lần đầu tiên phát hiện cá tra nuôi trong
ao ở Sumatra, Indonexia có dấu hiệu bệnh lý tương tự như bệnh gan thận mủ và xác
định tác nhân gây bệnh là E. ictaluri vào năm 2003 [119]. Tuy nhiên, kết quả nghiên
cứu của Trần Thị Minh Tâm và cs năm 2003 cho rằng tác nhân gây bệnh gan thận mủ
trên cá tra là hai loài vi khuẩn Hafnia alvei và Pleisiomonas shigelloides [11]. Lý Thị
Thanh Loan và cs năm 2007 ghi nhận kết quả nghiên cứu bước đầu tác nhân gây bệnh
gan thận mủ ở cá tra là vi khuẩn Clostridium sp. [7]. Năm 2008, tác giả Đặng Thị
Hoàng Oanh cùng các đồng nghiệp tại khoa Bệnh học thủy sản, Đại học Cần Thơ cũng
xác định vi khuẩn phân lập từ cá tra bị bệnh gan thận mủ được thu từ ao nuôi và từ thí
nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp sinh hoá truyền thống kết hợp với kit API 20 là
vi khuẩn E. ictaluri. Sau đó, sử dụng phương pháp PCR phát hiện vùng đặc hiệu nằm
giữa đoạn gen rADN 16S và 23S của vi khuẩn E. ictaluri để khẳng định kết quả định
danh bằng phương pháp sinh hoá [8]. Năm 2010, Crumlish và cs đã cảm nhiễm cá tra
giống với vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila bằng cả hai phương pháp ngâm và tiêm
đã một lần nữa khẳng định E. ictaluri là tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra
Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage) [34].
Như vậy, cho đến thời điểm này việc xác định chính xác đâu là tác nhân chính
gây bệnh gan thận mủ trên cá tra vẫn chưa có một câu trả lời thỏa đáng, nhưng có thể
khẳng định vi khuẩn E. ictaluri là một trong những đối tượng cần được nghiên cứu kỹ
càng hơn.
1.1.2.2. Đường lây truyền
Vi khuẩn E. ictaluri có thể nhiễm vào cá bằng hai đường khác nhau: Vi khuẩn
trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di chuyển
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi12
vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não [68]. Bệnh lan rộng từ màng não đến sọ
và da. Vi khuẩn E. ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hoá qua niêm mạc
ruột vào máu gây nhiễm trùng máu. Qua đường tiêu hóa, vi khuẩn vào mao mạch trong
biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố của da. Cá da trơn còn nhiễm E. ictaluri qua đường
miệng gây nhiễm khuẩn ruột. Bệnh tiến triển gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận
trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm khuẩn [94].
1.1.2.3. Triệu chứng bệnh
Cá tra Việt Nam mắc bệnh gan thận mủ có những biểu hiện như sau [3]:
- Ở mức độ nhẹ cá ăn ít, gầy yếu, bụng chướng to, mắt hơi lồi, bên ngoài thân cá
bình thường không biểu hiện xuất huyết nhưng khi mổ kiểm tra gan, thận, tỳ tạng xuất
hiện nhiều đốm trắng như đốm mủ, kích thước từ 1-3 mm. Đó là biểu hiện bệnh lý đặc
trưng nhất của bệnh gan thận mủ.
Hình 1.1. Cá tra bị bệnh gan thận mủ với bụng sưng to và nhiều đốm trắng ở nội tạng
- Mức độ nặng: Cá bệnh bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước, nhào lộn và xoay
tròn. Khi bệnh nặng cá không phản ứng với tiếng động. Một số cá xuất huyết tất cả các
vây hay xuất huyết toàn thân. Đó là những biểu hiện đặc trưng nhất của bệnh gan thận
mủ. Trường hợp nặng cá xuất huyết trầm trọng, khi nhấc lên khỏi mặt nước máu sẽ
chảy ra từ da và mang. Một số cá bệnh còn biểu hiện màu sắc nhợt nhạt, có nhiều mảng
nhợt lớn, nhỏ trên da. Số lượng cá chết hàng ngày khá cao và tăng dần [12].13
1.1.2.4. Bệnh tích
Bệnh tích đại thể [43]
Gan, thận cá bệnh sưng rất to, thận có hiện tượng nhũn, tỳ tạng sưng ít hơn.
Trên gan, thận, tỳ tạng xuất hiện nhiều đốm trắng tròn, đường kính khoảng 1- 3 mm
khắp bề mặt và cả bên trong. Những đốm trắng này có chứa dịch hơi đặc. Khi cấy dịch
trong các đốm trắng này lên môi trường thạch sau 24 giờ thấy xuất hiện các khuẩn lạc
thuần nhất.
Các đốm trắng này dễ nhầm lẫn với các đốm trắng do nhóm kí sinh trùng gây ra.
Tuy nhiên, đốm trắng do ký sinh trùng gây ra thường xuất hiện không nhiều, đa số chỉ
xuất hiện trên tỳ tạng và không nổi rõ. Khi quan sát dưới kính hiển vi, nếu bên trong
các đốm trắng có chứa dịch màu trắng như sữa đặc thì đó kí sinh trùng. Còn khi cá bị
bệnh đốm trắng do vi khuẩn thì các đốm trắng nổi rất nhiều, lộ rõ trên bề mặt và xuất
hiện trên cả ba cơ quan là gan, thận và tỳ tạng.
Bệnh tích vi thể
Hình 1.2. Bệnh tích trên gan thận và tỳ tạng (Bùi Quang Tề 2006, Bệnh học thủy sản)
Gan
Quan sát tiêu bản ở gan có đốm trắng cho thấy đây là vùng hoại tử. Các tế bào
gan không còn sát nhau như ở mô thường mà tách rời ra từng tế bào hay thoái hoá
thành một vùng không còn nhận ra được cấu trúc với nhiều mức độ. Giai đoạn đầu có
hiện tượng sung huyết động mạch và tĩnh mạch gan, đặc biệt là hệ thống xoang mao
mạch giữa các dãy tế bào gan làm cho toàn bộ tổ chức gan bị sưng to. Sau đó, do quá
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi14
trình sung huyết kéo dài dẫn đến vỡ mạch máu và giải thoát nhiều enzym (protease,
lipase) làm các tế bào ở vùng viêm bị hủy hoại dẫn đến hoại tử. Quan sát thấy những tế
bào đã tách rời nhau, nhân tế bào co lại và vỡ vụn, cuối cùng những tế bào này bị tiêu
hủy [3].
Khi cá bị bệnh nặng, những tổn thương lan rộng làm gan không còn chức năng
khử độc và lọc máu, làm chất độc tích tụ trong cơ thể kết hợp với những yếu tố khác
làm cá chết. Ngoài ra, do tổ chức gan bị hư hại làm mất khả năng tiết mật của gan. Một
số cá mới chết khi mổ ra thấy túi mật bị vỡ, dịch mật lan tràn khắp nội quan [13]. Điều
này có thể do khi gan bị hoại tử đồng thời cũng hoại tử ống dẫn mật và túi mật làm túi
mật vỡ làm dịch mật thoát ra ngoài .
Thận
Cấu trúc vi thể của thận bị hủy hoại trầm trọng, các phản ứng sưng viêm xảy ra
ở toàn bộ tổ chức. Thận sưng to đồng thời bị nhũn do sung huyết, một phần có thể do
tích tụ nước trong thận mà không đào thải được do hệ thống tiểu cầu thận và ống thận
bị tổn thương. Phản ứng viêm kéo dài gây hoại tử và mất chức năng các đơn vị cấu tạo
nên thận. Mô tạo máu nằm xen kẽ với các tế bào kẽ và các tế bào nội tiết của thận cũng
bị hoại tử làm cho máu trong cơ thể bị giảm sút. Khi thận bị hoại tử, chức năng bài tiết
chất thải trong quá trình trao đổi chất bị ngưng trệ. Trong khi đó quá trình trao đổi chất
lại đặc biệt tăng mạnh do cơ thể cá huy động các tổ chức nhằm đào thải các tác nhân
gây bệnh. Ngoài ra, hai loại hormon tuyến thượng thận là adrenalin và noradrenalin
không được sản xuất khi thận bị hoại tử cũng góp phần làm rối loạn chức năng sinh lý
của cá [13].
Tỳ tạng
Cùng với gan và thận, tỳ tạng cũng là cơ quan bị hủy hoại nặng khi cá bị bệnh.
Những đốm trắng trên tỳ tạng là những vùng mô hoại tử với nhiều mức độ khác nhau.
Đối với cá bệnh nặng, tỳ tạng xuất hiện nhiều vùng hoại tử dạng hạt lan rộng,
phá hủy các tiểu thể hình elip tròn xoay (là vùng chức năng của tỳ tạng, nơi tiêu huỷ15
các vật lạ và vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể). Khi tác nhân gây bệnh xâm nhập quá
nhiều sẽ gây ra tình trạng quá tải đến một lúc nào đó tế bào sẽ mất chức năng và thoái
hoá. Quá trình hoại tử ở tỳ tạng bắt đầu từ quá trình thoái hoá và hoại tử các tiểu thể tỳ
tạng làm mất chức năng tạo hồng cầu mới và phá hủy hồng cầu già cũng như không thể
sản xuất các tế bào lympho và bạch cầu bảo vệ cơ thể, chống các tác nhân gây bệnh.
Cũng như thận, mô tạo máu bị phá hủy nên tỳ tạng mất chức năng cung cấp máu cho
cơ thể [13] [11].
Mang
Quan sát lát cắt ngang của mang cá dưới kính hiển vi cho thấy có những vùng
các sợi mang bị dính lại với nhau. Điều này có thể do khi vi khuẩn tấn công, phản ứng
miễn dịch tự bảo vệ của cơ thể cá làm cho các sợi mang bị sưng lên và khi hai hoặc
nhiều sợi mang ở gần nhau sưng lên cùng lúc sẽ dẫn đến sự tiếp xúc của các sợi mang.
Sợi mang chỉ được bao bọc bởi một lớp tế bào rất mỏng với nhiều mạch máu nhỏ nên
rất dễ bị phình lên dưới tác động của phản ứng viêm hay do vi khuẩn tấn công [12].
Sự kết dính của các sợi mang làm giảm khả năng hô hấp của cá. Do đó, cá bệnh
sẽ có biểu hiện thiếu oxy và thường tập trung ở mặt nước. Bệnh càng trầm trọng hơn
khi cá bị mất máu do hiện tượng xuất huyết và vùng mô tạo máu ở thận và tỳ tạng bị
hủy hoại.
Tim và cơ
Quan sát tiêu bản tim và cơ cá bệnh dưới kính hiển vi không thấy biến đổi lớn
về mô học. Điều này chứng tỏ hai cơ quan này ít bị ảnh hưởng trực tiếp bởi vi khuẩn.
Tóm lại, khi cá bị bệnh gan thận mủ các cơ quan bị huỷ hoại nặng nhất là gan,
thận, tỳ tạng kế đến là mang, cuối cùng bị ảnh hưởng nhẹ nhất là tim và cơ. Nguyên
nhân làm chết cá có thể do gan, thận, tỳ tạng, mang bị hư hại dẫn đến mất chức năng
của các cơ quan này [4].
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi16
1.1.2.5. Khả năng bùng phát bệnh
Tốc độ lây lan của bệnh gan thận mủ rất nhanh. Trong điều kiện thí nghiệm khi
có mầm bệnh xâm nhập, khoảng 3- 4 ngày toàn bộ cá nuôi trong bể đều bị nhiễm bệnh
nếu không có biện pháp chăm sóc và quản lý hệ thống nuôi. Do đó cần áp dụng biện
pháp phòng bệnh tích cực một cách đồng bộ. Xác cá chết phải chôn và xử lý vôi bột để
hạn chế sự lây lan của mầm bệnh. Không dùng cơ quan nội tạng, máu, mỡ và các phụ
phẩm nhà máy chế biến thuỷ sản làm thức ăn trở lại cho cá vì nếu gặp phải nguồn sản
phẩm nhiễm khuẩn, mầm bệnh sẽ tồn tại lâu trong môi trường nước và phát tán vi
khuẩn gây bệnh vào ao bè nuôi, lây sang nhiều khu vực nuôi cá khác gây ra đại dịch.
1.1.2.6. Điều trị bệnh
Khi cá bị bệnh liệu pháp kháng sinh và chất hóa học là ưu tiên hàng đầu trong
điều trị. Tuy nhiên, vi khuẩn E. ictaluri có khả năng đề kháng với một số loại thuốc
kháng sinh Oxytetracylin, Oxolinic axit, Sulphonamid; vi khuẩn E. ictaluri còn kháng
lại: Bactrime (100%), Colistin (97,9%), Amoxicilin (40,4%), Tetracyclin (31,9%),
Doxycyclin (27,7%) và thể hiện tính nhạy với các kháng sinh: Doxycyclin (63,8%),
Amoxicilin (59,6%), Tetracyclin (48,9%), Florfenicol (27,7%), Colistin (2,1%) [46].
Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh làm cho các sản phẩm thủy sản sau đó
thường không được ưa chuộng do sự tích lũy thuốc, hoá chất trong thịt, tạo chủng
kháng thuốc và gây ô nhiễm môi trường nước.
Tại Việt Nam, hiện nay các loại thuốc và hóa chất cấm sử dụng trong nuôi trồng
thủy sản ngày càng tăng trong khi việc phòng và trị bệnh chủ yếu phụ thuộc vào các
loại thuốc kháng sinh và hóa chất đã khiến cho việc xuất khẩu thuỷ sản gặp rất nhiều
khó khăn. Ví dụ cụ thể như việc cấm sử dụng chloramfenicol, flomequine và xanh
malachite đã ảnh hưởng lớn cho nghề xuất khẩu cá tra và cá basa của Việt Nam trong
năm 2005 và 2006. Mỹ là một trong những thị trường nhập khẩu cá tra và cá basa lớn
của Việt Nam nhưng từ năm 2005 đã tăng thuế nhập khẩu đối với mặt hàng này vì thế
Việt Nam cần tìm thị trường mới. Tuy nhiên, việc tìm đầu ra cho các sản phẩm17
của hai đối tượng trên là rất khó khăn do chưa kiểm soát được việc sử dụng các loại
thuốc kháng sinh trong danh mục cấm sử dụng và tồn dư chất kháng sinh trong các sản
phẩm đã chế biến.
Hiện vẫn chưa có một loại vacxin nào được nghiên cứu và sử dụng trong khi thế
giới đang sử dụng chế phẩm Edwardsiella ictaluri bacterin (Escogen J) để điều trị bệnh
hoại tử gan tuỵ cho cá nheo Mỹ. Tuy nhiên, hiệu lực của vacxin còn phụ thuộc vào rất
nhiều yếu tố như di truyền, kích thước cá, mùa vụ, nhiệt độ, chất lượng nước, phương
pháp sử dụng và yếu tố dinh dưỡng, tình trạng sức khoẻ và tình trạng sử dụng kết hợp
với một số loại thuốc khác. Nghiên cứu của Wise và Shoemaker cho thấy việc sử dụng
vacxin sống cải tiến cho cá ở giai đoạn 7 đến 31 ngày tuổi đã nâng tỉ lệ sống sót của cá
lên từ 45,3 đến 79,5% [38]. Điều này chỉ ra rằng việc dùng vacxin để phòng bệnh cho
cá cũng chỉ thu được hiệu quả thấp.
Đứng trước khó khăn là chưa có vacxin phòng bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây
ra cho đối tượng cá tra và cá basa ở Việt Nam một cách hiệu quả, thì việc chẩn đoán
sớm đóng vai trò quan trọng để có phác đồ điều trị kháng sinh thích hợp, giảm thiểu
những thiệt hại về kinh tế cho người dân. Theo các nghiên cứu gần đây vi khuẩn E.
ictaluri gây bệnh gan thận mủ ở cá tra rất nhạy cảm với thuốc kháng sinh florfenicol.
Đây là loại thuốc kháng sinh mới được FDA cấp phép sử dụng để điều trị bệnh cá của
nhiều quốc gia trên thế giới kể cả Mỹ, thị trường xuất khẩu cá tra lớn nhất của Việt
Nam với tên thương mại là Aquaflor [109].
Florfenicol có công thức hóa học là C12H14Cl2FNO4S, là chất kháng sinh thế hệ
mới nhất của fenicol và là dẫn xuất của chloramfenicol có tác dụng ức khuẩn nhưng
cũng có tác dụng diệt khuẩn trong một số trường hợp bệnh truyền nhiễm với những
điều kiện nhất định và nồng độ cao hơn. Thuốc có tác dụng ức chế vi khuẩn ở nồng độ
thấp, hoạt phổ rất rộng, tác dụng trên nhiều loài vi khuẩn Gram âm và Gram dương,
một số vi khuẩn ký sinh nội bào như Risketsia, Chlamydia, vi khuẩn kỵ khí như
Clostridium spp. Tác dụng kháng khuẩn của florfenicol là do khả năng liên kết với tiểu
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi18
đơn vị 50S của riboxom, ngăn cản sự hình thành liên kết peptit giữa các axit amin dẫn
đến ức chế quá trình tổng hợp protein làm cho vi khuẩn này không còn khả năng phát
triển [37].
Bệnh gan thận mủ thường gây thiệt hại nghiêm trọng ở giai đoạn cá tra giống và
giai đoạn cá nhỡ từ 300 – 500 g, nếu không được phát hiện kịp thời ở giai đoạn mới
xuất hiện bệnh thì việc điều trị sẽ không có hiệu quả và gây tổn thất lớn cho người dân.
Mặt khác do chưa có những hiểu biết đúng đắn nên việc sử dụng thuốc kháng sinh còn
tùy tiện, không đúng về liều lượng và liệu trình điều trị, sử dụng thuốc kháng sinh liều
thấp để phòng bệnh trước cho cá… Đây là những nguyên nhân chính dẫn đến hiệu quả
điều trị của thuốc kháng sinh ngày càng giảm theo thời gian sử dụng. Thêm vào đó,
việc sử dụng thuốc không đúng liều lượng đã dẫn đến việc hình thành các chủng vi
khuẩn E. ictaluri kháng thuốc và là trở ngại chính trong việc điều trị và khống chế tác
hại của bệnh.
1.2. VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri
1.2.1. Đặc điểm sinh học
Edwardsiella là một trong những chi mới của họ Enterobacteriaceae được đặt
tên theo tên nhà bác học người Mỹ P.R. Edwards (1901–1966) - người đầu tiên đã phân
lập và phân loại được vi khuẩn này. Chi Edwardsiella gồm 3 loài: Edwardsiella tarda,
Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella hoshinae trong đó E. tarda và E. ictaluri được
xem là những đối tượng gây bệnh chủ yếu trên cá da trơn [46].
E. ictaluri là loài có tên trong hệ thống phân loại muộn nhất. Vi khuẩn này lần
đầu tiên được đặt tên bởi Hawke, 1981 khi ông phân lập được vi khuẩn từ cá nheo Mỹ
Ictalurus sp. bị bệnh nhiễm trùng huyết [49]. Các đặc điểm sinh hóa của loài này có sai
khác với E. tarda ở một số đặc tính như không sinh H2S, không sinh indol, di động ở
25oC và không di động ở 37oC. Khác với E. tarda có khả năng gây bệnh cả trên động
vật và người thì vi khuẩn E. ictaluri chỉ tìm thấy trên các loài động vật máu lạnh đặc
biệt là trong môi trường nước ngọt [46].19
Các vi khuẩn thuộc chi Edwardsiella mang đặc điểm điển hình của vi khuẩn
thuộc họ Enterobacteriaceae: Gram âm, hình que thẳng, nhỏ, kích thước 1×2-3 µm,
không hình thành bào tử và di động bằng tiên mao hay không di động. Kích thước
khuẩn lạc trên môi trường cơ sở sau 24 giờ nuôi cấy rất nhỏ (0,5-1 mm) [108].
Hình 1.3. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri soi dưới kính hiển vi điện tử (A) và nhuộm Gram (B) [125]
Trong phòng thí nghiệm, nhiệt độ tối ưu cho tăng trưởng của E. ictaluri khi nuôi
cấy trong ống nghiệm là từ 25 - 30oC và nhiệt độ môi trường thích hợp cho vi khuẩn
bùng phát thành bệnh là khoảng 22 - 28oC phản ánh sự thích ứng của chúng trong vật
chủ biến nhiệt. Trong khi đó E. tarda và E. hoshinae sinh trưởng và phát triển ở nhiệt
độ cao hơn, khoảng 37oC. Một khác biệt nữa so với hai vi khuẩn còn lại là E. ictaluri
sinh trưởng rất chậm trên môi trường thạch, thông thường sau 2-3 ngày nuôi cấy ở
300C mới tạo thành khuẩn lạc kích thước 1 mm. Về mặt sinh hóa, E. ictaluri cũng ít
hoạt tính hơn so với các loài Edwardsiella khác. E. ictaluri có khả năng di động yếu
khi nuôi cấy tại 25 - 30oC và hoàn toàn không di động khi nuôi cấy ở nhiệt độ cao. Khả
năng di động này có thể thay đổi phụ thuộc vào các điều kiện sinh trưởng khác nhau
[46, 108].
Vi khuẩn E. ictaluri mang những đặc điểm điển hình của họ Enterobacteriaceae
như kị khí không bắt buộc, hoạt tính catalase dương tính, hoạt tính oxidase âm tính, lên
men đường và nhiều loại carbohydrate khác do đó liên quan đến sản xuất axít và khí.
A B
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi20
Khác với E. tarda, vi khuẩn E. ictaluri không sinh H2S và không sinh indol. Do hai
loài này có hình dạng rất giống nhau và cùng là tác nhân gây bệnh trên cá tra nên sự
khác nhau về các hoạt tính sinh hóa là đặc điểm quan trọng để phân biệt và xác định
được chính xác tác nhân gây trên cùng một vật chủ [82]. E.ictaluri hầu như không có
khả năng sinh các enzym như lipase, protease, pectinase, collagenase, chitinase,
hyaluronidase và hầu hết các enzym ngoại bào khác. Tuy nhiên, đặc điểm sinh hóa điển
hình của E. ictaluri là khả năng sinh enzym phân giải chondroitin – một thành phần
chính của sụn [108]. Khả năng này liên quan trực tiếp tới việc truyền bệnh qua sọ của
cá đặc biệt đối với cá giống có tỷ lệ sụn cao. Khả năng gây tan huyết cũng là một trong
những hoạt tính quan trọng liên quan tới độc tính của vi khuẩn. Do là loài ưa huyết nên
vi khuẩn gây bệnh thường chỉ phân lập được ở những cơ quan nhiều máu như gan,
thận, tỳ tạng, rất hiếm khi phân lập được vi khuẩn từ mô não cá bệnh.
Trước đây, hầu hết các nghiên cứu về Edwarsiella tập trung vào E. tarda, ít có
thông tin về các loài khác. Theo Aoki và Holland, thành phần màng ngoài của E. tarda
gồm một số protein với kích thước 27, 35 và 46 kDa và một số có protein có kích
thước từ 52-56 kDa [22]. Những nghiên cứu về lipopolysaccharide của ba loài thuộc
chi Edwarsiella chỉ ra rằng mỗi loài có thể được chia ra làm nhiều dạng khác nhau.
Một vài chủng của E. tarda cần nicotinamide và các axit amin như cysteine,
methionine để sinh trưởng, các loài khác của chi có thể có các nhu cầu tương tự. Các
loài thuộc chi Edwarsiella phát triển cần ít chất bổ sung vào hơn là các thành viên khác
thuộc họ Enterobacteriaceae và hình thái khuẩn lạc đơn cũng nhỏ hơn sau khi được
nuôi cấy trên môi trường thạch trong vòng 24 giờ ở 37oC. Ngược lại với hai loài
Edwardsiella còn lại, nhiệt độ tăng trưởng tối ưu của E. ictaluri nằm trong khoảng 25-
30oC và phát triển rất chậm khi nuôi trên đĩa thạch, thường từ 2-3 ngày ở 30oC tạo ra
khuẩn lạc có đường kính 1 mm [46].
Vi khuẩn E. tarda có thể gây ra sự bùng phát bệnh xuất huyết trong ao nuôi cá
chình [50] [107] hay bệnh thối rữa khí thũng ở cá da trơn và nhiễm trùng cơ hội ở21
khuếch đại thông thường khác như PCR hay RT-PCR nên dấu hiệu chuyển màu rất rõ
ràng. Nếu phản ứng dương tính, dung dịch phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh sáng,
ngược lại vẫn giữ nguyên màu cam. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là với hàm lượng ADN
lớn được khuếch đại sau phản ứng thì việc lây nhiễm là điều có thể xảy ra với bất cứ
phòng thí nghiệm nào. Do đó, để tránh việc lây nhiễm và thuận lợi trong việc ứng dụng
ngoài thực tế, có giá trị về mặt kinh tế thì Calcein đáp ứng được các tiêu trí trên hơn là
SYBR Green I.
3.5.2.7. Ngưỡng phát hiện gen eip18 của phản ứng LAMP sử dụng chỉ thị Calcein
Để xác định giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP khuếch đại gen eip18 của
vi khuẩn E. ictaluri, phản ứng được tiến hành với nồng độ ADN khuôn giảm đi 10 lần
cho mỗi thí nghiệm. Nồng độ ADN genom ban đầu được xác định thông qua độ hấp
thụ quang ở bước sóng 260 nm là 94 ng/l. Các thí nghiệm được tiến hành với ADN
khuôn ban đầu là 94 ng/l giảm dần nồng độ theo cấp số 10 từ 94 ng đến 94 at (Bảng
3.7).
Bảng 3.7. So sánh giới hạn phát hiện của phương pháp LAMP và PCR
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Nhà xuất bản: ĐHKHTN
Ngày: 2013
Được tạo ra: Wed Dec 18 14:57:36 2013
Đã thay đổi: Wed Dec 18 14:57:36 2013
Miêu tả: 149 tr.
Luận án TS. Vi sinh học -- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, 2013
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6
1.1. CÁ TRA VÀ BỆNH GAN THẬN MỦ 6
1.1.1. Cá tra Pangasianodon hypophthalmus 6
1.1.2. Bệnh gan mủ thận 9
1.1.2.1. Tác nhân gây bệnh 9
1.1.2.2. Đường lây truyền 11
1.1.2.3. Triệu chứng bệnh 12
1.1.2.4. Bệnh tích 13
1.1.2.5. Khả năng bùng phát bệnh 16
1.1.2.6. Điều trị bệnh 16
1.2. VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri 181.2.1. Đặc điểm sinh học 18
1.2.2. Đặc điểm hệ gen 23
1.2.3. Độc tố gây bệnh và gen mã hóa độc tố gây bệnh 24
1.3. TÌNH HÌNH BỆNH DỊCH 24
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN Edwarsiella ictaluri 28
1.4.1. Phương pháp vi sinh và hóa sinh 28
1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử 29
1.5. KỸ THUẬT LAMP (Loop- mediated isothermal amplifications) 30
1.5.1. Giới thiệu về kỹ thuật LAMP 32
1.5.2. Nguyên lý thiết kế mồi cho phản ứng LAMP 33
1.5.3. Cơ chế khuếch đại của phản ứng LAMP 35
1.5.4. Các cách phát hiện sự khuếch đại của phản ứng
LAMP
38
1.5.4.1. Điện di trên gel agarose 38
1.5.4.2. Phát hiện dựa vào chất phát huỳnh quang 39
1.5.4.3. Phát hiện dựa vào sản phẩm phụ của phản ứng 40
1.5.5. Ưu điểm của phương pháp LAMP 42
1.5.6. Các hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP tại Việt
Nam
43
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC 46
2.1.1. Vật liệu 46
2.1.2. Hóa chất và máy móc thiết bị 47
2.2. PHƯƠNG PHÁP 48
2.2.1. Phương pháp vi sinh và hóa sinh 49
2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử 51
2.2.2.1. Tách chiết DNA từ vi khuẩn 51
2.2.2.2. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli 51
2.2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 52
2.2.2.4. Thiết kế và tổng hợp các cặp mồi 53
2.2.2.5. Kĩ thuật PCR và LAMP 55
2.2.2.6. Phản ứng cắt DNA plasmid bằng enzym hạn chế 56
2.2.2.7. Ghép nối các đoạn DNA 57
2.2.2.8. Biến nạp DNA plasmid 58
2.2.2.9. Chọn lọc các thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp 59
2.2.2.10. Tinh sạch sản phẩm DNA plasmid bằng QIAGEN kit 59
2.2.2.11. Xác định trình tự nucleic acid 60
2.2.3. Tối ưu các điều kiện phản ứng LAMP 602.2.3.1. Xác định độ biến thiên Mg2+ trong phản ứng 60
2.2.3.2. Xác định nồng độ Mg2+ tối ưu 60
2.2.3.3. Xác định nồng dNTPs tối ưu 61
2.2.3.4. Xác định tỉ lệ mồi tối ưu 61
2.2.3.5. Xác định nồng độ betaine tối ưu 61
2.2.3.6. Xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu 61
2.2.3.7. Xác định thời gian phản ứng tối ưu 61
2.2.3.8. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng LAMP 61
2.2.3.9. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP 62
2.2.4. Phương pháp cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh vào vật chủ 62
2.2.4.1. Thiết kế thí nghiệm cảm nhiễm 62
2.2.4.2. Xác định LD50 63
2.2.4.3. Giải phẫu mô học 64
2.2.5. Xử lí số liệu bằng phần mềm vi tính 64
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 66
3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ TRA VIỆT NAM 66
3.1.1. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn 68
3.1.2. Nhuộm Gram 69
3.1.3. Khả năng di động, sinh indol và sinh H2S 69
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi3.1.4. Xác định hoạt tính catalase 72
3.1.5. Hoạt tính chondroitinase 73
3.1.6. Hoạt tính tan huyết 74
3.2. PHÂN LOẠI VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC
PHÂN TỬ
76
3.2.1. Tách chiết DNA genom của vi khuẩn 76
3.2.2. Phân loại bằng so sánh trình tự rDNA 16S 77
3.3. PHÂN LẬP, TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN eip18
CỦA VI KHUẨN E. ictaluri
79
3.3.1. Phân lập gen eip18 80
3.3.2. Tách dòng gen eip18 bằng vector pJet 2.1/blunt 81
3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen eip18 trong vector tái tổ hợp 81
3.3.4. Xác định trình tự gen eip18 83
3.4. THÍ NGHIỆM CẢM NHIỄM VI KHUẨN E. ictaluri 86
3.4.1. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E5 86
3.4.2. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E7 87
3.4.3. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E40 88
3.4.4. Dấu hiệu bệnh lý của cá sau khi cảm nhiễm 91
3.4.5. Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn 93
3.5. PHÁT HIỆN GEN eip18 CỦA VI KHUẨN E. ictaluri BẰNG KỸ
THUẬT LAMP
953.5.1. Khuếch đại gen eip18 bằng kỹ thuật LAMP 95
3.5.2. Tối ưu các điều kiện của phản ứng LAMP 97
3.5.2.1. Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng 97
3.5.2.2. Ảnh hưởng thời gian phản ứng 98
3.5.2.3. Ảnh hưởng của nồng dNTPs 99
3.5.2.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ mồi 100
3.5.2.5. Ảnh hưởng của nồng độ betaine 100
3.5.2.6. Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ 101
3.5.2.7. Ngưỡng phát hiện gen eip18 của phản ứng LAMP sử
dụng chỉ thị Calcein
105
3.5.2.8. Độ đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại gen eip18 bằng
phương pháp LAMP
108
KẾT LUẬN 110
KIẾN NGHỊ 112
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN
ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN
113
TÀI LIỆU THAM KHẢO 11
MỞ ĐẦU
Nuôi trồng thủy sản trong đó có nuôi cá tra thương phẩm hiện đóng một vai trò
quan trọng trong ngành xuất khẩu nói chung và xuất khẩu thủy sản nói riêng. Hoạt
động này đã và đang được nhiều chính phủ khuyến khích nhằm tạo ra lượng hàng hóa
có giá trị kinh tế cao, giải quyết vấn đề việc làm cho người lao động, tăng thu nhập và
góp phần đẩy lùi cùng kiệt đói ở các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, trong 10 năm trở
lại đây nghề nuôi cá tra đang phát triển rất nhanh với quy mô lớn tại một số tỉnh đồng
bằng Sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang… với
diện tích nuôi trồng đạt 6.300 ha mặt nước tính đến năm 2011 [15]. Cá tra Pangasius
hypophthalmus là loài đặc hữu của lưu vực sông Mê Kông và được xem là một trong
những đối tượng xuất khẩu tiềm năng. Ước tính trung bình kim ngạch xuất khẩu cá tra
hàng năm đóng góp khoảng 10% tổng kim ngạch xuất khẩu. Theo thống kê của Hiệp
hội nuôi trồng và xuất khẩu thủy sản, năm 2008 xuất khẩu cá tra ra thị trường thế giới
đạt 1,2 tỷ USD, năm 2009 đạt 1,34 tỷ USD, năm 2010 đạt 1,4 tỷ USD, năm 2011 đạt
1,8 tỷ USD, dự kiến kim ngạch xuất khẩu cá tra ra thị trường thế giới bao gồm Châu
Âu, Mỹ, Mexico… đạt 1,8 đến 2 tỷ USD đến hết năm 2012 [16].
Sự phát triển quá nhanh không theo quy hoạch của ngành nuôi cá tra tại khu vực
Đồng bằng sông Cửu long đã dẫn đến sự bùng nổ dịch bệnh trên diện rộng, dịch bệnh
diễn ra hàng năm gây thiệt hại không nhỏ cho người dân, ảnh hưởng nghiêm trọng tới
môi trường thủy sản và các ngành kinh tế liên quan. Một trong những bệnh nguy hiểm
trên cá tra là bệnh gan thận mủ hay còn gọi là bệnh đốm trắng nội tạng được phát hiện
lần đầu tiên tại Việt Nam vào đầu mùa lũ năm 1998 ở một số vùng nuôi cá thâm canh
trọng điểm như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau đó bệnh lan rộng ra các tỉnh
nuôi cá tra lân cận và cả một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre,
Sóc Trăng [3]. Thời kỳ cao điểm của bệnh dịch thường vào tháng 9 tới tháng 12. Bệnh
được đánh giá là vô cùng nguy hiểm do tốc độ lây lan nhanh, khó kiểm soát và khó
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi2
điều trị do bệnh không có những triệu chứng điển hình ở giai đoạn sớm. Tốc độ lây lan
của bệnh tỷ lệ thuận với mức độ thâm canh, mật độ nuôi cá trên một đơn vị diện tích ao
nuôi. Thêm vào đó, vấn đề quản lý nguồn nước, quản lý thức ăn và khống chế bệnh
dịch còn chưa đáp ứng kịp với việc mở rộng diện tích nuôi trồng hàng năm dẫn đến
việc khi đã xuất hiện bệnh thì thường gây ra dịch cho cả một vùng nuôi trồng thủy sản.
Do đó, việc xác định sớm và nhanh tác nhân gây bệnh sẽ đóng góp không nhỏ vào vấn
đề kiểm soát bệnh dịch, giảm thiểu những tổn thất kinh tế cho người nuôi và các ngành
kinh tế liên quan. Tại Việt Nam, tuy đã có nhiều công trình nghiên cứu xác định tác
nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nhưng chưa có sự thống nhất về kết quả. Năm
2001, Ferguson và cs đã công bố tác nhân gây bệnh là Bacillus sp. [43]. Một năm sau
đó tác giả lại đính chính tác nhân gây bệnh là Edwardsiella ictaluri [36]. Cũng trong
năm đó, ở Indonesia nhóm nghiên cứu của Kei Yuasa và cs lần đầu tiên chứng minh E.
ictaluri là tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng ở cá tra [119]. Năm 2003 Trần Thị
Minh Tâm và cs công bố tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Hanfia alvei và Pleisiomonas
shigelloides [11]. Khác hoàn toàn với các kết quả nghiên cứu trước đây, khi Lý Thị
Thanh Loan và cs năm 2007 công bố tác nhân gây bệnh là Clostridium sp. - trực khuẩn
Gram dương, kỵ khí bắt buộc trong khi các tác nhân được công bố trước đây đều là
trực khuẩn Gram âm [7]. Còn tại Mỹ, các nhà khoa học đã khẳng định chính xác tác
nhân gây hoại tử gan, thận và nhiễm trùng huyết trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus
là vi khuẩn E. ictaluri [94]. Mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu khẳng định tác
nhân gây bệnh gan thận mủ là E. ictaluri nhưng bên cạnh đó vẫn tồn tại những ý kiến
cho rằng đó là do vi khuẩn khác gây ra. Như vậy, việc xác định tác nhân chính gây
bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam là vấn đề cần được làm sáng tỏ.
Có rất nhiều phương pháp khác nhau để xác định sự có mặt của một tác nhân
gây bệnh từ những phương pháp truyền thống như: phân lập trên môi trường chọn lọc,
xác định đặc tính sinh lý, hóa sinh, phương pháp huyết thanh học… đến các phương
pháp phân tử như PCR, RT-PCR, multiplex PCR… Tuy nhiên, việc phát triển một3
phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh và có khả năng ứng dụng
nhanh bên ngoài phòng thí nghiệm đóng vai trò quan trọng không chỉ góp phần khẳng
định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam mà còn có ý nghĩa quan trọng
trong phòng chống, kiểm soát và điều trị bệnh. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tui tiến
hành đề tài:
“Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam
Pagasius hypophthalmus bằng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal
amplification”
Mục tiêu của đề tài:
- Xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pangasius
hypophthalmus.
- Chẩn đoán nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh trên các mẫu bệnh phẩm bằng
kỹ thuật LAMP.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi4
Nội dung nghiên cứu:
- Phân lập vi khuẩn từ các mẫu cá tra bị bệnh gan thận mủ thu được tại khu vực
Đồng bằng Sông Cửu Long.
- Xác định một số đặc điểm sinh hóa và phân loại dựa vào trình tự gen mã hóa
rARN 16S.
- Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen đặc trưng của vi khuẩn phân lập
được.
- Sử dụng kỹ thuật LAMP để phát hiện vi khuẩn dựa trên trình tự của gen đặc
trưng của vi khuẩn đó.
- Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng LAMP khuếch đại gen đặc trưng của vi
khuẩn
- Sử dụng chỉ thị kim loại Calcein để làm dấu hiệu phát hiện phản ứng bằng mắt
thường.5
Những đóng góp mới của luận án:
- Lần đầu tiên ứng dụng một phương pháp chẩn đoán phẩn tử mới có tên là
LAMP – khuếch đại đẳng nhiệt có tạo thành các vòng để xác định bệnh do vi
khuẩn gây ra ở thủy sản.
- Đây là phương pháp đơn giản, phát hiện nhanh kết quả bằng mắt thường dựa
vào sự thay đổi của chỉ thị kim loại Calcein từ cam sang xanh mà không cần sự
hỗ trợ của các thiết bị nghiên cứu khác.
Luận án được thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi6
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÁ TRA VÀ BỆNH GAN THẬN MỦ
1.1.1. Cá tra Pangasius hypophthalmus
Cá tra và cá basa là hai trong số 11 loài thuộc họ cá tra Pangasiidae đã được xác
định ở sông Cửu Long. Theo dẫn liệu từ
You must be registered for see links
[124], hệ thống phân loạicủa loài cá tra được xác định như sau :
Giới: Animalia Linnaeus, 1758
Ngành: Chordata Bateson, 1885
Ngành phụ: Vertebrata Cuvier, 1812
Tổng lớp: Osteichthyes Huxley, 1880 – Bony fishes
Lớp: Actinopterygii Huxley, 1880 – Ray-finned fishes
Lớp phụ: Neopterygii
Tổng bộ: Ostaryphysi
Bộ: Siluriformes
Họ cá tra: Pangasiidae - Bleeker, 1858
Giống cá tra dầu: Pangasius Valenciennes in Cuvier and Valenciennes, 1840
Loài cá tra: Pangasius hypophthalmus (Sauvage, 1878)
Các đồng danh của loài cá tra bao gồm:
- Helicophagus hypophthalmus Sauvage, 1878
- Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878
- Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878
- Pangasius pangasius non Hamilton,1822
- Pangasius pleurotaenia non Sauvage, 1878
- Pangasius sutchi Fowler, 1937
Cá tra phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng hạ lưu sông Mê kông, có mặt ở cả bốn
nước Lào, Việt Nam, Campuchia, Thái Lan. Tài liệu phân loại gần đây nhất của tác giả
W. Rainboth xếp cá tra thuộc giống cá tra dầu. Tên loài Pangasianodon hypophthalmus7
được ông sử dụng lần đầu vào năm 1996 để chỉ định cho loài cá Tra và sau đó được
nhiều tác giả khác sử dụng phổ biến đến nay [85]. Tên đặt cho loài này khác nhau theo
vùng phân bố. Ở Campuchia là Trey pra (tên Khmer), Lào là Pa souay kheo, pa suay,
Thái là Pla saa wha, pla suey và Việt Nam là cá tra [14].
Ở nước ta những năm trước đây khi chưa có sinh sản cá nhân tạo, cá bột và cá
tra giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi,
rất ít gặp ở tự nhiên và địa phận Việt Nam do cá có tập tính di cư ngược dòng sông Mê
kông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên. Hiện nay, cá tra nước ta được đưa vào
nuôi công nghiệp trên quy mô lớn tại các vùng thuộc đồng bằng Sông Cửu Long bao
gồm các tỉnh trọng điểm như Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Bến Tre và
một số tỉnh lân cận với diện tích mặt nước lên đến 6.300 ha bao gồm cả diện tích mặt
nước tận dụng trên các sông lớn như sông Tiền và sông Hậu [15].
Cá nheo Mỹ thuộc họ Ictaluridae, bộ Siluriformes [103] với đặc điểm gồm 8 râu
quanh miệng, đuôi xẻ đôi sâu, nhiều đốm 2 bên cơ thể, vây lưng và vây ngực có gai
nhọn, cứng [110]. Loài cá này đẻ trứng dễ dàng nhưng lại không sinh sản trong ao
nuôi. Loài này có khả năng chịu oxi thấp, mật độ nuôi cao và có khả năng thích ứng
nhanh với sự thay đổi khí hậu, sử dụng được thức ăn công nghiệp nên được xem là đối
tượng tiềm năng của các mô hình nuôi trồng và sản xuất thủy sản ở quy mô công
nghiệp. Khác với cá nheo Mỹ về một số đặc điểm sinh học trong đó đặc điểm dễ nhận
thấy nhất là cá tra Pangasius hypophthalmus chỉ có 2 đôi râu ở miệng, đôi râu mép dài
và đôi râu hàm dưới ngắn [14]. Đối tượng này được nuôi ở quy mô công nghiệp ở một
số tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre,
Tiền Giang… với tốc độ phát triển rất nhanh và đem lại lợi ích cao cho người nông
dân. Tuy nhiên, thiệt hại hàng năm do bệnh dịch gây ra cũng rất lớn và mặc dù được
phát hiện muộn hơn so với một số các bệnh khác nhưng bệnh gan thận mủ được đánh
giá là bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng. Tỷ lệ cá chết do nhiễm bệnh cao, từ 50 - 60%
và nguy hiểm nhất là giai đoạn cá giống. Ở giai đoạn này tỷ lệ cá chết có thể lên tới
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi8
90% [3]. Bệnh nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời sẽ rất khó kiểm soát và
ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất mùa vụ và việc xuất khẩu ra thị trường thế giới.
Bảng 1.1. Diện tích và sản lượng nuôi cá tra ở các địa phương năm 2011 [15]
Tỉnh Sản lượng (tấn) Diện tích nuôi trồng (ha)
Tây Ninh 4.500 25
Tiền Giang 36.700 180
Bến Tre 126.750 650
Trà Vinh 28.622 131,7
Vĩnh Long 111.517 405,9
Đồng Tháp 341.884 1529
An Giang 245.000 1330
Cần Thơ 163.444 937
Hậu Giang 43.470 189
Sóc Trăng 27.400 167
Kiên Giang 6.966 27
Tổng cộng 1.136.253 5571,6
Về mặt xuất khẩu, cá tra là một trong những đối tượng xuất khẩu quan trọng có
đóng góp không nhỏ làm tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản hàng năm của Việt Nam.
Sản phẩm xuất khẩu chiếm ưu thế vẫn là hàng phi lê đông lạnh với giá trị xuất khẩu đạt
1,79 tỷ USD năm 2011 chiếm 99% tỷ trọng xuất khẩu cá tra của Việt Nam. Mặt hàng
chế biến vẫn còn khiêm tốn, chỉ chiếm 1% tổng giá trị xuất khẩu cá tra. Tính đến năm
2011, đã có hơn 230 doanh nghiệp xuất khẩu cá tra đến hơn 130 thị trường trên thế giới
bao gồm Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc và Hồng Kông, Australia,
Canada, Mehico, Nga… đạt giá trị 1,8 tỷ USD, tăng gần 26,5% với khối lượng xuất
khẩu trên 600 nghìn tấn, tăng 3% so với năm 2010 [15].9
1.1.2. Bệnh gan thận mủ
Bệnh gan thận mủ hay còn gọi là bệnh đốm trắng nội tạng, bệnh hoại tử gan
thận… là một trong những bệnh truyền nhiễm do tác nhân vi khuẩn gây ra. Động vật
thủy sản bị nhiễm bệnh và những xác động vật thủy sản bị bệnh chết là nguồn gây bệnh
chính. Tác nhân gây bệnh sinh sản rất nhanh làm tăng số lượng và đi vào môi trường
nước bằng nhiều con đường khác nhau như: theo các vết loét của cá để đi ra nước qua
hệ thống cơ quan bài tiết, cơ quan tiêu hóa, cơ quan sinh dục hay qua mang, xoang
miệng, xoang mũi. Ngoài ra, trong nước có nhiều chất mùn bã hữu cơ, nước thải các
nhà máy công nghiệp, nước thải của các trại chăn nuôi gia cầm, gia súc, nước thải sinh
hoạt, phân rác… cũng tạo điều kiện cho bệnh truyền nhiễm phát sinh, phát triển. Bệnh
lại có thể lây truyền theo chiều ngang giữa các cá thể và theo chiều dọc từ thế hệ này
sang thế hệ khác và có thể lây truyền trực tiếp hay gián tiếp. Do đó, khi đã xuất hiện cá
thể bệnh trong ao nuôi mà không phát hiện kịp thời để có hướng điều trị thích hợp thì
sẽ rất dễ bùng phát thành dịch gây tổn thất về kinh tế lớn cho người nuôi.
Ở ĐBSCL, bệnh gan thận mủ xuất hiện lần đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở các
tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau
đó, bệnh lan dần đến các vùng có nuôi cá tra lân cận. Đặc biệt, những năm gần đây
bệnh này cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến
Tre, Sóc Trăng [3]… và hiện nay, hầu hết các tỉnh có hoạt động nuôi trồng cá tra đều
có các báo cáo về việc phát hiện bệnh tại các ao nuôi và tình hình thiệt hại hàng năm.
1.1.2.1. Tác nhân gây bệnh
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri lần đầu tiên được phân lập năm 1976 từ cá da
trơn bị bệnh và đây là tác nhân chính gây nhiễm trùng huyết nội tạng trên cá da trơn,
một bệnh nghiêm trọng ảnh hưởng lớn đến ngành nuôi cá da trơn thương mại. Bệnh
tiến triển nhanh chóng và tỷ lệ tử vong cao làm thiệt hại đáng kể cho người nuôi cá
nheo ở vùng Đông nam nước Mỹ. Kể từ lần đầu tiên mô tả bệnh nhiễm khuẩn huyết
đường ruột trên cá da trơn, vi khuẩn E. ictaluri đã liên tục được phân lập từ các loài cá
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi10
không phải là cá da trơn như cá kiếm xanh, cá hồi … Vi khuẩn có thể được phân lập từ
thận, máu, não trên môi trường giàu dinh dưỡng ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ. Vi
khuẩn phát triển chậm nên việc xác định hình thái khuẩn lạc cũng như các đặc tính sinh
hóa điển hình cần nhiều thời gian. Đến năm 1981, Hawke và cs đã mô tả đầy đủ các
đặc tính của vi khuẩn và xếp vi khuẩn này vào chi Edwardsiella [49].
Trên đối tượng cá da trơn được nuôi trồng với mục đích xuất khẩu ở Việt Nam
như cá tra và cá basa những năm gần đây có dấu hiệu biểu hiện bệnh gan thận mủ hay
còn được gọi là bệnh đốm trắng gan, thận gây thiệt hại lớn cho người nuôi. Cá thường
bị nhiễm bệnh vào các tháng cuối năm khi nhiệt độ nước hạ thấp, khoảng từ tháng 9
đến tháng 1 năm sau. Tuy nhiên, hiện nay bệnh đã trở nên phổ biến trên cá tra và xảy ra
quanh năm. Nguyên nhân chính là do việc tăng diện tích và mức độ thâm canh cũng
như việc sát trùng nguồn nước của những ao nuôi bị nhiễm bệnh trước khi thải ra môi
trường chưa được kiểm soát triệt để. Thời điểm phát triển bệnh và khả năng lây lan của
bệnh khác nhau theo từng năm liên quan tới những biến động về thời tiết và điều kiện
nuôi trồng. Vi khuẩn luôn tồn tại trong môi trường ao nuôi và trong cơ thể cá khỏe
mạnh, khi bị sốc do vận chuyển, thay đổi nhiệt độ, thức ăn cũng có thể dẫn đến bùng
phát bệnh. Trung bình trong một vụ nuôi, bệnh có thể xuất hiện 3-4 lần, hao hụt giống
từ 10-50% chủ yếu ở giai đoạn cá giống từ 300-500 g tùy thuộc vào chế độ chăm sóc
và quản lý [2].
Tác nhân chính gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam vẫn còn là câu hỏi
chưa có câu trả lời chính xác. Bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi ở Đồng Bằng Sông
Cửu Long được phát hiện đầu tiên vào cuối năm 1998 và gọi là bệnh BNP (Bacillary
Necrosis of Pangasius) [43]. Khi cá tra bị bệnh, biểu hiện bên ngoài không có gì đặc
biệt, một số có hiện tượng xuất huyết ở các vây, có khi xuất huyết toàn thân, khi giải
phẫu và quan sát nội tạng thấy có nhiều đốm trắng trên gan, thận và tỳ tạng, trong
xoang bụng có chứa dịch hơi đặc. Theo Từ Thanh Dung và cs (2005) ở khu vực
ĐBSCL bệnh gan, thận mủ ảnh hưởng chủ yếu đến các tỉnh có nghề nuôi cá tra thâm11
canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ, sau đó bệnh lây lan sang
các vùng lân cận và hiện tại bệnh cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nuôi cá
tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng. Các vi khuẩn phân lập từ cá tra bị bệnh gan
thận mủ được định danh là E. ictaluri dựa trên các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh
hoá [36]. Còn ở khu vực Châu Á, Yuasa và cs lần đầu tiên phát hiện cá tra nuôi trong
ao ở Sumatra, Indonexia có dấu hiệu bệnh lý tương tự như bệnh gan thận mủ và xác
định tác nhân gây bệnh là E. ictaluri vào năm 2003 [119]. Tuy nhiên, kết quả nghiên
cứu của Trần Thị Minh Tâm và cs năm 2003 cho rằng tác nhân gây bệnh gan thận mủ
trên cá tra là hai loài vi khuẩn Hafnia alvei và Pleisiomonas shigelloides [11]. Lý Thị
Thanh Loan và cs năm 2007 ghi nhận kết quả nghiên cứu bước đầu tác nhân gây bệnh
gan thận mủ ở cá tra là vi khuẩn Clostridium sp. [7]. Năm 2008, tác giả Đặng Thị
Hoàng Oanh cùng các đồng nghiệp tại khoa Bệnh học thủy sản, Đại học Cần Thơ cũng
xác định vi khuẩn phân lập từ cá tra bị bệnh gan thận mủ được thu từ ao nuôi và từ thí
nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp sinh hoá truyền thống kết hợp với kit API 20 là
vi khuẩn E. ictaluri. Sau đó, sử dụng phương pháp PCR phát hiện vùng đặc hiệu nằm
giữa đoạn gen rADN 16S và 23S của vi khuẩn E. ictaluri để khẳng định kết quả định
danh bằng phương pháp sinh hoá [8]. Năm 2010, Crumlish và cs đã cảm nhiễm cá tra
giống với vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila bằng cả hai phương pháp ngâm và tiêm
đã một lần nữa khẳng định E. ictaluri là tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra
Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage) [34].
Như vậy, cho đến thời điểm này việc xác định chính xác đâu là tác nhân chính
gây bệnh gan thận mủ trên cá tra vẫn chưa có một câu trả lời thỏa đáng, nhưng có thể
khẳng định vi khuẩn E. ictaluri là một trong những đối tượng cần được nghiên cứu kỹ
càng hơn.
1.1.2.2. Đường lây truyền
Vi khuẩn E. ictaluri có thể nhiễm vào cá bằng hai đường khác nhau: Vi khuẩn
trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di chuyển
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi12
vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não [68]. Bệnh lan rộng từ màng não đến sọ
và da. Vi khuẩn E. ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hoá qua niêm mạc
ruột vào máu gây nhiễm trùng máu. Qua đường tiêu hóa, vi khuẩn vào mao mạch trong
biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố của da. Cá da trơn còn nhiễm E. ictaluri qua đường
miệng gây nhiễm khuẩn ruột. Bệnh tiến triển gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận
trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm khuẩn [94].
1.1.2.3. Triệu chứng bệnh
Cá tra Việt Nam mắc bệnh gan thận mủ có những biểu hiện như sau [3]:
- Ở mức độ nhẹ cá ăn ít, gầy yếu, bụng chướng to, mắt hơi lồi, bên ngoài thân cá
bình thường không biểu hiện xuất huyết nhưng khi mổ kiểm tra gan, thận, tỳ tạng xuất
hiện nhiều đốm trắng như đốm mủ, kích thước từ 1-3 mm. Đó là biểu hiện bệnh lý đặc
trưng nhất của bệnh gan thận mủ.
Hình 1.1. Cá tra bị bệnh gan thận mủ với bụng sưng to và nhiều đốm trắng ở nội tạng
- Mức độ nặng: Cá bệnh bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước, nhào lộn và xoay
tròn. Khi bệnh nặng cá không phản ứng với tiếng động. Một số cá xuất huyết tất cả các
vây hay xuất huyết toàn thân. Đó là những biểu hiện đặc trưng nhất của bệnh gan thận
mủ. Trường hợp nặng cá xuất huyết trầm trọng, khi nhấc lên khỏi mặt nước máu sẽ
chảy ra từ da và mang. Một số cá bệnh còn biểu hiện màu sắc nhợt nhạt, có nhiều mảng
nhợt lớn, nhỏ trên da. Số lượng cá chết hàng ngày khá cao và tăng dần [12].13
1.1.2.4. Bệnh tích
Bệnh tích đại thể [43]
Gan, thận cá bệnh sưng rất to, thận có hiện tượng nhũn, tỳ tạng sưng ít hơn.
Trên gan, thận, tỳ tạng xuất hiện nhiều đốm trắng tròn, đường kính khoảng 1- 3 mm
khắp bề mặt và cả bên trong. Những đốm trắng này có chứa dịch hơi đặc. Khi cấy dịch
trong các đốm trắng này lên môi trường thạch sau 24 giờ thấy xuất hiện các khuẩn lạc
thuần nhất.
Các đốm trắng này dễ nhầm lẫn với các đốm trắng do nhóm kí sinh trùng gây ra.
Tuy nhiên, đốm trắng do ký sinh trùng gây ra thường xuất hiện không nhiều, đa số chỉ
xuất hiện trên tỳ tạng và không nổi rõ. Khi quan sát dưới kính hiển vi, nếu bên trong
các đốm trắng có chứa dịch màu trắng như sữa đặc thì đó kí sinh trùng. Còn khi cá bị
bệnh đốm trắng do vi khuẩn thì các đốm trắng nổi rất nhiều, lộ rõ trên bề mặt và xuất
hiện trên cả ba cơ quan là gan, thận và tỳ tạng.
Bệnh tích vi thể
Hình 1.2. Bệnh tích trên gan thận và tỳ tạng (Bùi Quang Tề 2006, Bệnh học thủy sản)
Gan
Quan sát tiêu bản ở gan có đốm trắng cho thấy đây là vùng hoại tử. Các tế bào
gan không còn sát nhau như ở mô thường mà tách rời ra từng tế bào hay thoái hoá
thành một vùng không còn nhận ra được cấu trúc với nhiều mức độ. Giai đoạn đầu có
hiện tượng sung huyết động mạch và tĩnh mạch gan, đặc biệt là hệ thống xoang mao
mạch giữa các dãy tế bào gan làm cho toàn bộ tổ chức gan bị sưng to. Sau đó, do quá
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi14
trình sung huyết kéo dài dẫn đến vỡ mạch máu và giải thoát nhiều enzym (protease,
lipase) làm các tế bào ở vùng viêm bị hủy hoại dẫn đến hoại tử. Quan sát thấy những tế
bào đã tách rời nhau, nhân tế bào co lại và vỡ vụn, cuối cùng những tế bào này bị tiêu
hủy [3].
Khi cá bị bệnh nặng, những tổn thương lan rộng làm gan không còn chức năng
khử độc và lọc máu, làm chất độc tích tụ trong cơ thể kết hợp với những yếu tố khác
làm cá chết. Ngoài ra, do tổ chức gan bị hư hại làm mất khả năng tiết mật của gan. Một
số cá mới chết khi mổ ra thấy túi mật bị vỡ, dịch mật lan tràn khắp nội quan [13]. Điều
này có thể do khi gan bị hoại tử đồng thời cũng hoại tử ống dẫn mật và túi mật làm túi
mật vỡ làm dịch mật thoát ra ngoài .
Thận
Cấu trúc vi thể của thận bị hủy hoại trầm trọng, các phản ứng sưng viêm xảy ra
ở toàn bộ tổ chức. Thận sưng to đồng thời bị nhũn do sung huyết, một phần có thể do
tích tụ nước trong thận mà không đào thải được do hệ thống tiểu cầu thận và ống thận
bị tổn thương. Phản ứng viêm kéo dài gây hoại tử và mất chức năng các đơn vị cấu tạo
nên thận. Mô tạo máu nằm xen kẽ với các tế bào kẽ và các tế bào nội tiết của thận cũng
bị hoại tử làm cho máu trong cơ thể bị giảm sút. Khi thận bị hoại tử, chức năng bài tiết
chất thải trong quá trình trao đổi chất bị ngưng trệ. Trong khi đó quá trình trao đổi chất
lại đặc biệt tăng mạnh do cơ thể cá huy động các tổ chức nhằm đào thải các tác nhân
gây bệnh. Ngoài ra, hai loại hormon tuyến thượng thận là adrenalin và noradrenalin
không được sản xuất khi thận bị hoại tử cũng góp phần làm rối loạn chức năng sinh lý
của cá [13].
Tỳ tạng
Cùng với gan và thận, tỳ tạng cũng là cơ quan bị hủy hoại nặng khi cá bị bệnh.
Những đốm trắng trên tỳ tạng là những vùng mô hoại tử với nhiều mức độ khác nhau.
Đối với cá bệnh nặng, tỳ tạng xuất hiện nhiều vùng hoại tử dạng hạt lan rộng,
phá hủy các tiểu thể hình elip tròn xoay (là vùng chức năng của tỳ tạng, nơi tiêu huỷ15
các vật lạ và vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể). Khi tác nhân gây bệnh xâm nhập quá
nhiều sẽ gây ra tình trạng quá tải đến một lúc nào đó tế bào sẽ mất chức năng và thoái
hoá. Quá trình hoại tử ở tỳ tạng bắt đầu từ quá trình thoái hoá và hoại tử các tiểu thể tỳ
tạng làm mất chức năng tạo hồng cầu mới và phá hủy hồng cầu già cũng như không thể
sản xuất các tế bào lympho và bạch cầu bảo vệ cơ thể, chống các tác nhân gây bệnh.
Cũng như thận, mô tạo máu bị phá hủy nên tỳ tạng mất chức năng cung cấp máu cho
cơ thể [13] [11].
Mang
Quan sát lát cắt ngang của mang cá dưới kính hiển vi cho thấy có những vùng
các sợi mang bị dính lại với nhau. Điều này có thể do khi vi khuẩn tấn công, phản ứng
miễn dịch tự bảo vệ của cơ thể cá làm cho các sợi mang bị sưng lên và khi hai hoặc
nhiều sợi mang ở gần nhau sưng lên cùng lúc sẽ dẫn đến sự tiếp xúc của các sợi mang.
Sợi mang chỉ được bao bọc bởi một lớp tế bào rất mỏng với nhiều mạch máu nhỏ nên
rất dễ bị phình lên dưới tác động của phản ứng viêm hay do vi khuẩn tấn công [12].
Sự kết dính của các sợi mang làm giảm khả năng hô hấp của cá. Do đó, cá bệnh
sẽ có biểu hiện thiếu oxy và thường tập trung ở mặt nước. Bệnh càng trầm trọng hơn
khi cá bị mất máu do hiện tượng xuất huyết và vùng mô tạo máu ở thận và tỳ tạng bị
hủy hoại.
Tim và cơ
Quan sát tiêu bản tim và cơ cá bệnh dưới kính hiển vi không thấy biến đổi lớn
về mô học. Điều này chứng tỏ hai cơ quan này ít bị ảnh hưởng trực tiếp bởi vi khuẩn.
Tóm lại, khi cá bị bệnh gan thận mủ các cơ quan bị huỷ hoại nặng nhất là gan,
thận, tỳ tạng kế đến là mang, cuối cùng bị ảnh hưởng nhẹ nhất là tim và cơ. Nguyên
nhân làm chết cá có thể do gan, thận, tỳ tạng, mang bị hư hại dẫn đến mất chức năng
của các cơ quan này [4].
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi16
1.1.2.5. Khả năng bùng phát bệnh
Tốc độ lây lan của bệnh gan thận mủ rất nhanh. Trong điều kiện thí nghiệm khi
có mầm bệnh xâm nhập, khoảng 3- 4 ngày toàn bộ cá nuôi trong bể đều bị nhiễm bệnh
nếu không có biện pháp chăm sóc và quản lý hệ thống nuôi. Do đó cần áp dụng biện
pháp phòng bệnh tích cực một cách đồng bộ. Xác cá chết phải chôn và xử lý vôi bột để
hạn chế sự lây lan của mầm bệnh. Không dùng cơ quan nội tạng, máu, mỡ và các phụ
phẩm nhà máy chế biến thuỷ sản làm thức ăn trở lại cho cá vì nếu gặp phải nguồn sản
phẩm nhiễm khuẩn, mầm bệnh sẽ tồn tại lâu trong môi trường nước và phát tán vi
khuẩn gây bệnh vào ao bè nuôi, lây sang nhiều khu vực nuôi cá khác gây ra đại dịch.
1.1.2.6. Điều trị bệnh
Khi cá bị bệnh liệu pháp kháng sinh và chất hóa học là ưu tiên hàng đầu trong
điều trị. Tuy nhiên, vi khuẩn E. ictaluri có khả năng đề kháng với một số loại thuốc
kháng sinh Oxytetracylin, Oxolinic axit, Sulphonamid; vi khuẩn E. ictaluri còn kháng
lại: Bactrime (100%), Colistin (97,9%), Amoxicilin (40,4%), Tetracyclin (31,9%),
Doxycyclin (27,7%) và thể hiện tính nhạy với các kháng sinh: Doxycyclin (63,8%),
Amoxicilin (59,6%), Tetracyclin (48,9%), Florfenicol (27,7%), Colistin (2,1%) [46].
Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh làm cho các sản phẩm thủy sản sau đó
thường không được ưa chuộng do sự tích lũy thuốc, hoá chất trong thịt, tạo chủng
kháng thuốc và gây ô nhiễm môi trường nước.
Tại Việt Nam, hiện nay các loại thuốc và hóa chất cấm sử dụng trong nuôi trồng
thủy sản ngày càng tăng trong khi việc phòng và trị bệnh chủ yếu phụ thuộc vào các
loại thuốc kháng sinh và hóa chất đã khiến cho việc xuất khẩu thuỷ sản gặp rất nhiều
khó khăn. Ví dụ cụ thể như việc cấm sử dụng chloramfenicol, flomequine và xanh
malachite đã ảnh hưởng lớn cho nghề xuất khẩu cá tra và cá basa của Việt Nam trong
năm 2005 và 2006. Mỹ là một trong những thị trường nhập khẩu cá tra và cá basa lớn
của Việt Nam nhưng từ năm 2005 đã tăng thuế nhập khẩu đối với mặt hàng này vì thế
Việt Nam cần tìm thị trường mới. Tuy nhiên, việc tìm đầu ra cho các sản phẩm17
của hai đối tượng trên là rất khó khăn do chưa kiểm soát được việc sử dụng các loại
thuốc kháng sinh trong danh mục cấm sử dụng và tồn dư chất kháng sinh trong các sản
phẩm đã chế biến.
Hiện vẫn chưa có một loại vacxin nào được nghiên cứu và sử dụng trong khi thế
giới đang sử dụng chế phẩm Edwardsiella ictaluri bacterin (Escogen J) để điều trị bệnh
hoại tử gan tuỵ cho cá nheo Mỹ. Tuy nhiên, hiệu lực của vacxin còn phụ thuộc vào rất
nhiều yếu tố như di truyền, kích thước cá, mùa vụ, nhiệt độ, chất lượng nước, phương
pháp sử dụng và yếu tố dinh dưỡng, tình trạng sức khoẻ và tình trạng sử dụng kết hợp
với một số loại thuốc khác. Nghiên cứu của Wise và Shoemaker cho thấy việc sử dụng
vacxin sống cải tiến cho cá ở giai đoạn 7 đến 31 ngày tuổi đã nâng tỉ lệ sống sót của cá
lên từ 45,3 đến 79,5% [38]. Điều này chỉ ra rằng việc dùng vacxin để phòng bệnh cho
cá cũng chỉ thu được hiệu quả thấp.
Đứng trước khó khăn là chưa có vacxin phòng bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây
ra cho đối tượng cá tra và cá basa ở Việt Nam một cách hiệu quả, thì việc chẩn đoán
sớm đóng vai trò quan trọng để có phác đồ điều trị kháng sinh thích hợp, giảm thiểu
những thiệt hại về kinh tế cho người dân. Theo các nghiên cứu gần đây vi khuẩn E.
ictaluri gây bệnh gan thận mủ ở cá tra rất nhạy cảm với thuốc kháng sinh florfenicol.
Đây là loại thuốc kháng sinh mới được FDA cấp phép sử dụng để điều trị bệnh cá của
nhiều quốc gia trên thế giới kể cả Mỹ, thị trường xuất khẩu cá tra lớn nhất của Việt
Nam với tên thương mại là Aquaflor [109].
Florfenicol có công thức hóa học là C12H14Cl2FNO4S, là chất kháng sinh thế hệ
mới nhất của fenicol và là dẫn xuất của chloramfenicol có tác dụng ức khuẩn nhưng
cũng có tác dụng diệt khuẩn trong một số trường hợp bệnh truyền nhiễm với những
điều kiện nhất định và nồng độ cao hơn. Thuốc có tác dụng ức chế vi khuẩn ở nồng độ
thấp, hoạt phổ rất rộng, tác dụng trên nhiều loài vi khuẩn Gram âm và Gram dương,
một số vi khuẩn ký sinh nội bào như Risketsia, Chlamydia, vi khuẩn kỵ khí như
Clostridium spp. Tác dụng kháng khuẩn của florfenicol là do khả năng liên kết với tiểu
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi18
đơn vị 50S của riboxom, ngăn cản sự hình thành liên kết peptit giữa các axit amin dẫn
đến ức chế quá trình tổng hợp protein làm cho vi khuẩn này không còn khả năng phát
triển [37].
Bệnh gan thận mủ thường gây thiệt hại nghiêm trọng ở giai đoạn cá tra giống và
giai đoạn cá nhỡ từ 300 – 500 g, nếu không được phát hiện kịp thời ở giai đoạn mới
xuất hiện bệnh thì việc điều trị sẽ không có hiệu quả và gây tổn thất lớn cho người dân.
Mặt khác do chưa có những hiểu biết đúng đắn nên việc sử dụng thuốc kháng sinh còn
tùy tiện, không đúng về liều lượng và liệu trình điều trị, sử dụng thuốc kháng sinh liều
thấp để phòng bệnh trước cho cá… Đây là những nguyên nhân chính dẫn đến hiệu quả
điều trị của thuốc kháng sinh ngày càng giảm theo thời gian sử dụng. Thêm vào đó,
việc sử dụng thuốc không đúng liều lượng đã dẫn đến việc hình thành các chủng vi
khuẩn E. ictaluri kháng thuốc và là trở ngại chính trong việc điều trị và khống chế tác
hại của bệnh.
1.2. VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri
1.2.1. Đặc điểm sinh học
Edwardsiella là một trong những chi mới của họ Enterobacteriaceae được đặt
tên theo tên nhà bác học người Mỹ P.R. Edwards (1901–1966) - người đầu tiên đã phân
lập và phân loại được vi khuẩn này. Chi Edwardsiella gồm 3 loài: Edwardsiella tarda,
Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella hoshinae trong đó E. tarda và E. ictaluri được
xem là những đối tượng gây bệnh chủ yếu trên cá da trơn [46].
E. ictaluri là loài có tên trong hệ thống phân loại muộn nhất. Vi khuẩn này lần
đầu tiên được đặt tên bởi Hawke, 1981 khi ông phân lập được vi khuẩn từ cá nheo Mỹ
Ictalurus sp. bị bệnh nhiễm trùng huyết [49]. Các đặc điểm sinh hóa của loài này có sai
khác với E. tarda ở một số đặc tính như không sinh H2S, không sinh indol, di động ở
25oC và không di động ở 37oC. Khác với E. tarda có khả năng gây bệnh cả trên động
vật và người thì vi khuẩn E. ictaluri chỉ tìm thấy trên các loài động vật máu lạnh đặc
biệt là trong môi trường nước ngọt [46].19
Các vi khuẩn thuộc chi Edwardsiella mang đặc điểm điển hình của vi khuẩn
thuộc họ Enterobacteriaceae: Gram âm, hình que thẳng, nhỏ, kích thước 1×2-3 µm,
không hình thành bào tử và di động bằng tiên mao hay không di động. Kích thước
khuẩn lạc trên môi trường cơ sở sau 24 giờ nuôi cấy rất nhỏ (0,5-1 mm) [108].
Hình 1.3. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri soi dưới kính hiển vi điện tử (A) và nhuộm Gram (B) [125]
Trong phòng thí nghiệm, nhiệt độ tối ưu cho tăng trưởng của E. ictaluri khi nuôi
cấy trong ống nghiệm là từ 25 - 30oC và nhiệt độ môi trường thích hợp cho vi khuẩn
bùng phát thành bệnh là khoảng 22 - 28oC phản ánh sự thích ứng của chúng trong vật
chủ biến nhiệt. Trong khi đó E. tarda và E. hoshinae sinh trưởng và phát triển ở nhiệt
độ cao hơn, khoảng 37oC. Một khác biệt nữa so với hai vi khuẩn còn lại là E. ictaluri
sinh trưởng rất chậm trên môi trường thạch, thông thường sau 2-3 ngày nuôi cấy ở
300C mới tạo thành khuẩn lạc kích thước 1 mm. Về mặt sinh hóa, E. ictaluri cũng ít
hoạt tính hơn so với các loài Edwardsiella khác. E. ictaluri có khả năng di động yếu
khi nuôi cấy tại 25 - 30oC và hoàn toàn không di động khi nuôi cấy ở nhiệt độ cao. Khả
năng di động này có thể thay đổi phụ thuộc vào các điều kiện sinh trưởng khác nhau
[46, 108].
Vi khuẩn E. ictaluri mang những đặc điểm điển hình của họ Enterobacteriaceae
như kị khí không bắt buộc, hoạt tính catalase dương tính, hoạt tính oxidase âm tính, lên
men đường và nhiều loại carbohydrate khác do đó liên quan đến sản xuất axít và khí.
A B
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phi20
Khác với E. tarda, vi khuẩn E. ictaluri không sinh H2S và không sinh indol. Do hai
loài này có hình dạng rất giống nhau và cùng là tác nhân gây bệnh trên cá tra nên sự
khác nhau về các hoạt tính sinh hóa là đặc điểm quan trọng để phân biệt và xác định
được chính xác tác nhân gây trên cùng một vật chủ [82]. E.ictaluri hầu như không có
khả năng sinh các enzym như lipase, protease, pectinase, collagenase, chitinase,
hyaluronidase và hầu hết các enzym ngoại bào khác. Tuy nhiên, đặc điểm sinh hóa điển
hình của E. ictaluri là khả năng sinh enzym phân giải chondroitin – một thành phần
chính của sụn [108]. Khả năng này liên quan trực tiếp tới việc truyền bệnh qua sọ của
cá đặc biệt đối với cá giống có tỷ lệ sụn cao. Khả năng gây tan huyết cũng là một trong
những hoạt tính quan trọng liên quan tới độc tính của vi khuẩn. Do là loài ưa huyết nên
vi khuẩn gây bệnh thường chỉ phân lập được ở những cơ quan nhiều máu như gan,
thận, tỳ tạng, rất hiếm khi phân lập được vi khuẩn từ mô não cá bệnh.
Trước đây, hầu hết các nghiên cứu về Edwarsiella tập trung vào E. tarda, ít có
thông tin về các loài khác. Theo Aoki và Holland, thành phần màng ngoài của E. tarda
gồm một số protein với kích thước 27, 35 và 46 kDa và một số có protein có kích
thước từ 52-56 kDa [22]. Những nghiên cứu về lipopolysaccharide của ba loài thuộc
chi Edwarsiella chỉ ra rằng mỗi loài có thể được chia ra làm nhiều dạng khác nhau.
Một vài chủng của E. tarda cần nicotinamide và các axit amin như cysteine,
methionine để sinh trưởng, các loài khác của chi có thể có các nhu cầu tương tự. Các
loài thuộc chi Edwarsiella phát triển cần ít chất bổ sung vào hơn là các thành viên khác
thuộc họ Enterobacteriaceae và hình thái khuẩn lạc đơn cũng nhỏ hơn sau khi được
nuôi cấy trên môi trường thạch trong vòng 24 giờ ở 37oC. Ngược lại với hai loài
Edwardsiella còn lại, nhiệt độ tăng trưởng tối ưu của E. ictaluri nằm trong khoảng 25-
30oC và phát triển rất chậm khi nuôi trên đĩa thạch, thường từ 2-3 ngày ở 30oC tạo ra
khuẩn lạc có đường kính 1 mm [46].
Vi khuẩn E. tarda có thể gây ra sự bùng phát bệnh xuất huyết trong ao nuôi cá
chình [50] [107] hay bệnh thối rữa khí thũng ở cá da trơn và nhiễm trùng cơ hội ở21
khuếch đại thông thường khác như PCR hay RT-PCR nên dấu hiệu chuyển màu rất rõ
ràng. Nếu phản ứng dương tính, dung dịch phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh sáng,
ngược lại vẫn giữ nguyên màu cam. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là với hàm lượng ADN
lớn được khuếch đại sau phản ứng thì việc lây nhiễm là điều có thể xảy ra với bất cứ
phòng thí nghiệm nào. Do đó, để tránh việc lây nhiễm và thuận lợi trong việc ứng dụng
ngoài thực tế, có giá trị về mặt kinh tế thì Calcein đáp ứng được các tiêu trí trên hơn là
SYBR Green I.
3.5.2.7. Ngưỡng phát hiện gen eip18 của phản ứng LAMP sử dụng chỉ thị Calcein
Để xác định giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP khuếch đại gen eip18 của
vi khuẩn E. ictaluri, phản ứng được tiến hành với nồng độ ADN khuôn giảm đi 10 lần
cho mỗi thí nghiệm. Nồng độ ADN genom ban đầu được xác định thông qua độ hấp
thụ quang ở bước sóng 260 nm là 94 ng/l. Các thí nghiệm được tiến hành với ADN
khuôn ban đầu là 94 ng/l giảm dần nồng độ theo cấp số 10 từ 94 ng đến 94 at (Bảng
3.7).
Bảng 3.7. So sánh giới hạn phát hiện của phương pháp LAMP và PCR
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator: