Nghiên cứu sản xuất protein FGF-2 tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli

Link tải miễn phí luận án Nghiên cứu sản xuất protein fgt-2 (fibroblast growth factor-2) tái tổ hợp trong vi khuẩn escherichia coli
LỜI MỞ ĐẦU

Nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi FGF-2 (Fibroblast Growth Factor-2) là một
protein đa chức năng, tham gia điều hòa hoạt động của nhiều quá trình trong cơ thể
nhƣ cân bằng nội mô, ngăn chặn quá trình xơ hóa ở phổi, duy trì và tăng sinh tế bào
thần kinh, chữa lành xƣơng bị tổn thƣơng, kích thích hình thành tế bào bạch cầu, kích
thích sự hình thành mạch máu mới từ mạch máu sẵn có, kích thích sự tăng trƣởng của
tế bào cơ mềm, chữa lành vết thƣơng và sửa chữa mô…
Do sự đa dạng về chức năng, FGF-2 đang đƣợc quan tâm nghiên cứu để ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực. Nhờ khả năng kích thích tăng sinh, ức chế biệt hóa, FGF-2
đang đƣợc sử dụng nhƣ là thành phần không thể thiếu trong nuôi cấy tế bào gốc phôi
ngƣời. Trong công nghệ mỹ phẩm, một số nghiên cứu cho thấy FGF-2 có khả năng
làm đen tóc, ngăn ngừa sự lão hóa da nên ngày càng đƣợc các hãng mỹ phẩm tin tƣởng
và bổ sung vào các bộ sản phẩm chăm sóc da, tóc. Bên cạnh đó, trong lĩnh vực y học,
việc sử dụng FGF-2 đã đem lại nhiều kết quả khả quan trong việc điều trị nhiều căn
bệnh nhƣ bệnh thiếu máu tim cục bộ, điều trị bỏng, ngăn ngừa sẹo do phẫu thuật, chữa
bệnh viêm nha chu…
Trƣớc đây, sản phẩm FGF-2 thƣờng đƣợc thu nhận bằng cách tách chiết từ các
dòng tế bào động vật. Việc sản xuất FGF-2 bằng phƣơng pháp này đảm bảo về hoạt
tính của sản phẩm nhƣng sản lƣợng thấp và giá thành cao. Nhằm khắc phục những
nhƣợc điểm trên, ngƣời ta đã tiến đến việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ để sản xuất
nhân tố FGF-2. Do đặc điểm của FGF-2 là không có cấu nối disulfide nội phân tử và
không cần sự biến đổi sau dịch mã cho hoạt tính sinh học nên hệ thống chủng chủ
E.coli có thể đảm nhiệm việc sản xuất FGF-2 có hoạt tính thay cho các dòng tế bào
động vật.
Ở Việt Nam, FGF-2 chủ yếu đƣợc nhập từ các công ty nƣớc ngoài nên giá
thành rất cao (1mg protein FGF-2 ngƣời đƣợc sản xuất nhờ kĩ thuật gen có giá khoảng
1260 USD, ProSpec) gây khó khăn trong việc ứng dụng. Do đó, việc sản xuất FGF-2
trong nƣớc nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng trên diện rộng với giá thành thấp cần đƣợc
quan tâm đầu tƣ.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tui tiến hành đề tài “ Nghiên cứu sản
xuất protein FGF-2 tái tổ hợp trong vi khuẩn Escherichia coli” nhằm tìm ra phƣơng án
sản xuất FGF-2 hiệu quả, kinh tế cho những ứng dụng trong nƣớc. Tuy nhiên, một
trong những hạn chế của việc sử dụng E. coli làm tế bào chủ là protein thƣờng đƣợc
tạo ra dƣới dạng thể vùi không có hoạt tính, cần trải qua quá trình gấp cuộn phức
tạp, tốn kém. Do vậy, luận văn này đƣợc thực hiện với mục đích xây dựng quy trình
sản xuất FGF-2 trong đó sử dụng chủng chủ E. coli để cảm ứng biểu hiện protein dạng
tan trong tế bào chất. Đây là hƣớng chiến lƣợc hiệu quả và triển vọng cho phép sản
xuất FGF-2 có hoạt tính một cách đơn giản với hiệu suất cao, giúp hạ giá thành sản
phẩm.
Với mục tiêu trên, chúng tui thực hiện luận văn với những nội dung sau:
- Tạo dòng E. coli BL21(DE3)/pET-FGF có khả năng biểu hiện vƣợt mức
protein FGF-2 tái tổ hợp.
- Biểu hiện protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E. coli
BL21(DE3)/pET-FGF.
- Bƣớc đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít nhằm thu nhận FGF-
2 tái tổ hợp dạng tan trong tế bào chất E. coli.
- Chứng minh hoạt tính kích thích tăng sinh dòng tế bào 3T3 của FGF-2 tái tổ
hợp.
1.1. NHÂN TỐ TĂNG TRƢỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF-2
1.1.1. Họ nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi FGF
Nhân tố tăng trƣởng nguyên bào sợi đƣợc Amerlin tìm thấy lần đầu tiên trong
dịch chiết tuyến yên vào năm 1973 [4]. Năm 1974, Gospodarowicz công bố tìm thấy
nhân tố tăng trƣởng có tác dụng làm tăng sinh nguyên bào sợi trong dịch chiết não bò.
Sau đó, Gospodarowicz đã tiến hành phân đoạn dịch chiết này trong pH acid và base
[7]. Thí nghiệm này đã cô lập đƣợc hai dạng FGF khác nhau tƣơng ứng với từng phân
đoạn pH. Nhân tố tăng trƣởng thu nhận đƣợc ở pH acid gọi là FGF-1 và nhân tố tăng
trƣởng thu nhận đƣợc ở phân đoạn base gọi là FGF-2. Ngày nay, trên 23 nhân tố tăng
trƣởng đã đƣợc tìm thấy và đƣợc nghiên cứu về chức năng, cấu trúc,… Các nhân tố
này bao gồm:
- FGF1- FGF10 là các nhân tố tăng trƣởng có liên kết với thụ thể FGFR. Trong
đó, FGF-1 (hay aFGF) có kích thƣớc 16kDa là nhân tố tăng trƣởng có tính acid và
FGF-2 (hay bFGF) có kích thƣớc 18kDa là nhân tố tăng trƣởng có tính base.
- FGF11, FGF12, FGF13, FGF14 là các FGF tƣơng đồng và còn có tên gọi
khác là FHF1-FHF4 (FGF homologous factors 1-4), chúng không bám vào FGFR
nhƣng tham gia vào quá trình hoạt hóa nội bào, nên còn đƣợc gọi là iFGF (intracellular
FGF).
- FGF16 đến FGF23 là những protein mới và chƣa biết rõ đặc điểm.
Họ nhân tố tăng trƣởng không những tƣơng đồng cao về trình tự amino acid (13
-71%), cấu trúc gen cũng đƣợc bảo tồn cao giữa các loài động vật có xƣơng sống. Các
protein thuộc họ này có ái lực cao với heparan sulfate proteoglycan. Sự tƣơng tác với
heparan sulfate giúp hoạt hóa một trong bốn receptor của FGF trên bề mặt tế bào [13].
1.1.2. Cấu trúc của FGF-2
FGF-2 đƣợc tìm thấy đầu tiên là dạng protein có 146 amino acid đƣợc phân lập
từ tuyến yên. Khi FGF-2 cDNA đƣợc tạo dòng, codon AUG đƣợc xác định nhƣ codon
mở đầu cho quá trình dịch mã của protein gồm 155 amino acid và không có bất cứ
codon AUG nào khác trong chuỗi polypeptide.

Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải: