lehieu_2111
New Member
Download miễn phí Luận văn Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điều khiển D-Loop DNA ty thể gà ri, gà ác, gà tre
MỤC LỤC
Lơ ̀ i cam đoan
Lơ ̀ i ca ̉ m ơn
Danh mu ̣ c ca ́ c ba ̉ ng
Danh mu ̣ c ca ́ c hi ̀ nh
Mở đầu . 1
1.Đặt vấn đề . 1
2. Mục tiêu nghiên cứu . 2
3. Nội dung nghiên cứu . 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Nguồn gốc gia cầm . 3
1.1.1 Gà Á . 4
1.1.2 Gà Ri. 5
1.1.3 Gà Tre. . 6
1.2 Cholesterol . 6
1.2.1 Tính trạng chất lượng cholesterol của trứng gà . 6
1.2.2 Nhu cầu cholesterol ở người . 7
1.2.3 Vai trò cholesterol trong cơ thể . 7
1.2.4 Tác hại cholesterol trong cơ thể khi vượt quá mức bình thường. . 8
1.3 Đặc điểm DNA ty thể . 10
1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự của DNA ty thể . 10
1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá của DNA ty thể . 11
1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà . 12
1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới và ở Việt Nam . 14
1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới . 14
1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam . 16
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu . 18
2.1.1 Nguồn gốc mẫu . 18
2.1.2 Đi ̣ a điểm thí nghiệm . 18
2.2 Hoá chất và thiết bị . 18
2.2.1 Hóa chất . 18
2.2.2 Thiết bị sử dụng . . . 18
2.3 Phương pháp nghiên cứu. 19
2.3.1 Phương pháp hoá sinh xác định hàm lượng cholesterol . 19
2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử . 22
2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật . 22
2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose . 25
2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop bằng kỹ thuật PCR . 26
2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR . 29
2.3.2.5 Phương pháp xác định trình tự DNA. . 31
2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu . 31
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu . 33
3.2 Xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng
di truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu . 35
3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà . 35
3.2.2 Nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể . 36
3.2.3 Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể . 37
KÊ ́ T LUÂ ̣ N VA ̀ ĐÊ ̀ NGHI ̣
1. Kết luận . 48
2. Đề nghị . 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 50
PHỤ LỤC . 54
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
c cây phát sinh và kết quả cho thấy 3 chủngNaganakidori có nguồn gốc từ gà chọi Shamo. Các kết quả này đã gợi ý rằng
3 mẫu gà cảnh đuôi dài đều có chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình thái
bên ngoài rất khác nhau. Hơn thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từ
các con gà chọi Okinawa vốn có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốc
và Đông Nam Á hơn so với Honshu/Kyushu Nhật Bản. Điều này dẫn đến giả
thiết rằng gà đuôi dài Nhật Bản đầu tiên được đưa đến Nhật Bản là gà chọi
các vùng lân cận của vùng Nam Trung Quốc hay Đông Nam Á. Như vậy có
thể thấy trình tự nucleotide của vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu để
đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài cũng như giữa
các quần thể địa lý.
1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam
Cho đến nay, ở Việt Nam việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử
trên đối tượng gà mới chỉ bắt đầu. Năm 1999, Kim Thị Phương Oanh và cộng
sự [11] đã tiến hành phân tích vị trí nhận biết của một số enzyme giới hạn trên
vùng điều khiển D-loop của 3 loài gà Lôi Việt Nam gồm: gà Lôi lam đuôi
trắng (L. hatinhensis), Trĩ bạc (L. nycthemera) và gà Lôi hông tía (L. diardi).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
16
Từ đó xác định bước đầu được sự khác biệt trên vùng điều khiển D-loop của
mtDNA của 3 loài gà Lôi. Tuy nhiên, để có những kết luận chính xác về vấn
đề này cần phải xác định trình tự vùng điều khiển của 3 dòng gà Lôi nói trên.
Năm 2000, Nguyễn Hải Hà và cộng sự [3] đã tạo dòng phân tử đoạn
gen điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam trong vector
pBluescript KS(-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide
vùng D-loop.
Năm 2006, Địch Thị Kim Hương và cộng sự [5] đã xác định được trình
tự vùng D-loop gồm 1227 nucleotide của 2 mẫu gà Ác Tiềm và Lương
Phượng, đã phát hiện được 22 vị trí khác biệt về nucleotide giữa 2 đại diện
trên.
Năm 2007, Lê Đức Long và cộng sự [6] đã giải trình tự và so sánh trình
tự nucleotide vùng D-loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện
Biên, Hà Giang và Yên Bái được nuôi tại trại gà Nông Lâm Thái Nguyên theo
dự án gà sạch. Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loop gồm
1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 10 vị trí khác
biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này.
Năm 2008, Bùi Thị Kiều Vân và cộng sự [14] đã giải trình tự và so
sánh trình tự nucleotide vùng D-loop của 3 giống gà Ri, gà Mông, gà Sao
nuôi tại Thái Nguyên. Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loop
gồm 1220 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 16 vị trí
khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
17
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
2.1.1 Nguồn gốc mẫu
Các mẫu trứng, máu được lấy từ các giống gà Ri, gà Ác, gà Tre được
nuôi tại gia đình ông Nguyễn Văn Vân , thôn Đình Giã , Cao Thượng , Tân
Yên, Bắc Giang.
2.1.2 Địa điểm thí nghiệm
Các nghiên cứu về cholesterol được tiến hành tại phòng thí nghiệm của
Khoa Hóa an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam.
Các thí nghiệm sinh học phân tử tiến hành tại phòng thí nghiệm công
nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
2.2 Hoá chất và thiết bị
2.2.1 Hóa chất
Các hoá chất tinh khiết sử dụng có nguồn gốc từ các nước Anh , Mỹ,
Trung Quốc , Thụy Điển, Nga… như Phosphate buffer saline (PBS), protein
K (20mg/ml), SDS, Tris HCl, EDTA, NaCl, CH3COONa, phenol:
chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1), chloroform: isoamyl alcohol (24:1),
agarose 0,8%...
2.2.2 Thiết bị sử dụng
Máy li tâm lạnh của hãng Hettich (Đức), tủ sấy của hãng Carbolite
(Anh), cân điện tử (Thuỵ Sỹ, Anh), máy Gerhardht, tủ lạnh sâu – 20oC
Sanyo (Nhật), lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc), máy PCR MJ Reseach, Inc
(Mỹ), máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Genetic Analyser
(Applied Biosystems, Mỹ), bể ổn nhiệt (Tempette Junior Tech), hệ thống
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18
sắc ký Alliance (hãng Waters, Mỹ), máy hút chân không Speed Vac Sc
110A- Savant (Mỹ), pipetman và một số máy móc thiết bị khác.
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Phƣơng pháp hoá sinh xác định hàm lƣợng cholesterol
* Cơ sở của phương pháp: chất béo trong thực phẩm (gồm cả cholesterol)
được chiết bằng chloroform. Sau khi thủy phân lipit bằng KOH trong cồn,
cholesterol được chiết lại bằng petroleum ether. Dịch chiết được cô cạn bằng
máy cất quay chân không, sau đó được hòa tan lại bằng methanol. Cholesterol
trong dịch chiết methanol được định lượng trên sắc ký lỏng (HPLC) bằng
cách so sánh diện tích (hay chiều cao) của pic cholesterol trong mẫu với diện
tích (hay chiều cao) của pic cholesterol chuẩn (John Wiley and Sons, 2005)
[22].
* Xác định hàm lượng cholesterol theo quy trình sau: Lấy ngẫu nhiên trứng
ở các giống gà thí nghiệm ở các lứa đẻ khác nhau và ở các con gà mái khác
nhau trong cùng một giống. Sau khi lấy được mẫu, ở mỗi mẫu: đập 5 quả
trứng vào cốc thủy tinh. Sau đó đồng nhất lòng đỏ và lòng trắng. Tiếp theo là
các bước:
+ Cân 0,5 g mẫu vào ống ly tâm 25 ml.
+ Thêm 5 ml methanol, vortex 5 phút.
+ Thêm 10 ml chloroform, vortex 3 phút.
+ Ly tâm, gạn lấy dịch trong bình gạn 250 ml.
+ Chiết lại mẫu bằng 5 ml methanol và 10 ml chloroform trong 3 phút.
+ Gộp dịch chiết vào bình gạn.
+ Thêm 7 ml KCl 0,88%, lắc nhẹ và để tách lớp.
+ Lọc lớp chloroform qua phễu chứa Na2SO4 khan vào bình cô quay.
+ Cô quay đến khô ở 300C.
+ Thêm 20 ml KOH 0,5M trong ethanol.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
+ Đun hồi lưu 30 phút trong cách thủy ở 600C.
+ Thêm 10ml n- heptane, đun hồi lưu thêm 2-3 phút, để nguội đến nhiệt
độ phòng.
+ Chuyển toàn bộ dịch chiết sang một bình gạn, thêm 5 ml NaCL bão
hòa, 10 ml nước.
+ Chiết 2 lần cùng với 10 ml petroleum ether.
+ Gộp dịch chiết và rửa 2 lần với 20 ml nước cất.
+ Loại nước bằng Na2SO4 khan, cô quay ở 30
0C đến khô.
+ Hòa tan và định mức 10 ml bằng methanol.
+ Lọc qua màng lọc 0,45 m và bơm vào sắc kí lỏng.
Cột sắc ký LunaC18 với nhiệt độ cột là 300C, tốc độ dòng là 1 ml/ phút,
lượng mẫu bơm 10 l. Bộ phận phát hiện (detector) đo độ hấp thụ tia UV ở
bước sóng 208 nm của cholesterol chuyển thành tín hiệu ra máy tính đó là các
peak, mỗi peak có độ cao và diện tích khác nhau, từ đó tính được hàm lượng
cholesterol của mỗi mẫu [22].
Công thức tính hàm lượng cholesterol của mẫu nghiên cứu như sau :
X =
m
D
A
CA
s
sm 100
Trong đó:
X: Hàm lượng cholesterol (mg/ 100 g)
Am: Diện tích pic mẫu
As: Diện tích pic chuẩn
Cs: Nồng độ chuẩn
...