khicodonemnhoai_vip87
New Member
Download miễn phí Giải trình tự gen HP1125 mã hoá cho protein màng ngoài của Helicobacter Pylori
Trình tự của toàn bộ gen HP1125 vừa được giải mã được so
sánh với gen tương ứng của các chủng nước ngoài bằng
chương trình Blast. Nhìn chung, gen của Việt nam có sự
tương đồng khá cao với gen tương ứng của một số chủng
của nước ngoài (bảng 1)
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
GIẢI TRÌNH TỰ GEN HP1125 MÃ HOÁ CHOPROTEIN MÀNG NGOÀI CỦA Helicobacter pylori
Nguyễn Thị Nguyệt & Nguyễn Thị Hồng Hạnh
Viện Công nghệ Sinh Học
MỞ ĐẦU
Vi khuẩn Gram âm Helicobacter pylori là căn nguyên của
các bệnh về tiêu hoá như viêm và loét dạ dày... Vi khuẩn
cũng gắn liền với nguy cơ ung thư dạ dày ở những người
bệnh nhiễm khuẩn [1, 2]. Ở trên thế giới cũng như ở Việt
Nam, có khoảng hơn nửa dân số bị nhiễm Helicobacter
pylori.
Hiện nay, trong quá trình điều trị, bên cạnh một số biệt
dược, các bạn sĩ thường chỉ định sử dùng kháng sinh cho
các bệnh nhân. Việc chữa chạy thường gặp thất bại, do rất
nhanh chóng, Helicobacter pylori trở nên kháng thuốc [3].
Hai trong những giải pháp tốt nhất để chống vi khuẩn dạ
dày mà các nhà khoa học hướng tới là i) tìm ra vacin để
phòng ngừa bệnh ii) sử dụng các thuốc ức chế sự phát triển
của vi khuẩn trong dạ dày của bệnh nhân.
Để có thể là vaccine chống nhiểm khuẩn Helicobacter
pylori, một protein được sử dụng làm kháng nguyên cần
phải có thành phần hoá học và cấu trúc ổn định. Các
protein màng ngoài của vi khuẩn dường như đáp ứng được
yêu cầu như trên.
Helicobacter pylori có thể có đến 32 protein màng ngoài
[4]. Các protein có thể đóng các vai trò khác nhau, trong đó
có vận chuyển các chất vào bên trong tế bào vi khuẩn cũng
như tương tác với môi trường xung quanh. Một trong 32
protein màng ngoài nói trên đang được nghiên cứu là
protein HP1125. Gen mã hoá cho protein đã được tạo dòng
và phân tích lần đầu tiên bởi các nhà khoa học Nam Triều
Tiên [5]. Muộn hơn, đầu 5’ của gen của 20 chủng cũng
được tạo dòng và phân tích ở Viện Công nghệ Sinh học,
Việt Nam [in press].
Các phân tích trên một số trình tự của gen HP1125 đã được
công bố cho thấy, cả gen HP1125 và protein HP1125 đều
bảo thủ. Tuy nhiên, với một đối tượng siêu đột biến như vi
khuẩn dạ dày, các trường hợp bất ngờ dường như có thể
xẩy ra. Trong bài báo này, chúng tôii công bố toàn bộ trình
tự gen HP1125 của Helicobacter pylori trong sinh thiết một
bệnh nhân Việt Nam bị loét dạ dày. Loại trừ một vài đột
biến nhỏ, gen HP1125 của vi khuẩn Việt Nam đã bị mất 2
nucleotide ở đầu 3’, dẫn đến sự xuất hiên của một protein
với thành phần khác biệt ở đầu C.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Bệnh nhân và sinh thiết: Mẫu sinh thiết dạ dày được lấy
bằng phương pháp nội soi từ một bệnh nhân bị loét dạ dày
Việt nam chưa được điều trị kháng sinh ở bệnh Viện Hữu
Nghị ( Hà Nội).
Tách chiết ADN từ sinh thiết dạ dày: ADN của sinh thiết
loét dạ dày được tách chiết theo phương pháp như đã miêu
tả [6].
Khuếch đại gen HP1125 bằng phương pháp PCR: 10 ng
ADN tách chiết từ sinh thiết được dùng làm khuôn mẫu cho
phản ứng PCR trong một thể tích 25 l. Các mồi thiết kế có
trình tự như sau:
F1: ACTTGAATTCCTTGATCGGATTCTTTGATTTC.
F2:
TTTAGGATCCCCATGGATAATAAGACTGTGGCC.
Chương trình nhiệt của phản ứng PCR: 94oC : 1 phút., 55oC
: 50 s., 72oC: 50 s Chu kỳ 35 vòng. Sản phẩm PCR được
kiểm tra trên gel agarose 1. 2%. Đệm 1 x TAE được sử
dụng trong điện di.
Giải trình tự gel: Sản phảm PCR của gen HP1125 được
phân giải trên gel agarose 0.8% và được làm sạch khỏi các
mồi còn thừa sau phản ứng bằng Gene clean Kit. ADN với
nồng độ 10 ng/l được sử dụng để giải trình tự tại ADN
Core, trường đại học tổng hợp Michigan (Mỹ) theo phương
pháp giải trình của Hultman (6a)
Phân tích trình tự đoạn ADN: Chương trình Blast trên trang
Web được sử dụng để phân tích trình tự cũng như protein
cuar gen.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khuếch đại gen HP1125 bằng phương pháp PCR
Toàn bộ gen HP1125 được khuyếch đại bằng phương pháp
PCR. Sản phẩm PCR là một băng ADN duy nhất có phân
tử lượng 540 cặp bazơ ( hình 1).
Hình 1. Khuyếch đại gen HP1125 bằng phương pháp PCR
M. Thang chuẩn ADN 100 cặp bazơ
1. Sản phẩm PCR có kích thướckhoảng 540 cặp bazo được
kiểm tra bằng phương pháp điện di
Kết quả giải trình tự
Sản phẩm PCR, sau khi làm sạch được giải trình tự trực
tiếp không qua giai đoạn tạo dòng phân tử. Kết quả được
trình bầy ở hình 2 A và B. Gen HP1125 của Việt Nam đã
được đệ trình vào quĩ gen và có số mã là AY513613.
Hình 2. Trình tự nucleotide gen HP1125(A) và thành phần
của protein tương ứng (B)
18 acid amine có gạch chân dưới làm thành peptide tín
hiệu.
Phân tích gen ở mức độ ADN và protein
A) Ở mức độ ADN
Trình tự của toàn bộ gen HP1125 vừa được giải mã được so
sánh với gen tương ứng của các chủng nước ngoài bằng
chương trình Blast. Nhìn chung, gen của Việt nam có sự
tương đồng khá cao với gen tương ứng của một số chủng
của nước ngoài (bảng 1)
Tuy nhiên, nếu nghiên cứu kỹ hơn trình tự, có thể thấy sự
khác nhau chủ yếu do các đột biến điểm. Đặc biệt, gen
HP1125 của Việt Nam bị mất hai cặp bazo tg ở đầu 3'. Vì
vậy, nó đã làm stop codon ở cách đó không xa biến mất.
Một trong các kết quả so sánh bằng Blast với Omp22 của
chủng Hàn Quốc được trích dẫn ở dưới.
B) ở mức độ protein
Protein của gen vừa được giải mã được so sánh với protein
Omp22 của chủng Helicobacter pylori của Hàn Quốc. Có
thể dễ dàng nhận thấy, có hai acid amin ở vị trí 46 (I46T)
và 167 (K167R) của protein đã bị thay đổi. Đặc biệt, do quá
trình đột biến đứt đoạn của hai cặp bazo ở cuối gen, nên đã
xảy ra qua trình xê khung dịch mã ở gen của chủng Viêt
Nam. Stop codon của gen đã bị đảy lùi về phía sau, làm
phần cấu trúc của gen trở nên dài hơn.
Những sự thay đổi nói trên đã dẫn tới những sự thay đổi
thành thần của protein ở đầu 5’. Protein giả định HP1125 sẽ
có ít nhất 5 acid amine mới là QISEV
Hình 3: So sánh thành phần của protein HP1125 và
Omp22.
Trình tự của protein HP1125 và protein màng ngoài của các
vi khuẩn nứơc ngoài được so sánh và trình bầy ở dưới. Có
thể thấy: đầu N’ của protein có thể khác nhau về một vài
acid amine, trong khi đó đầu C của chúng dường như bảo
thủ hơn. Nếu như không xét đến chủng Việt nam, thì phần
C’ của protein của vi khuẩn Helicobacter pylori thường có
một môtip giống nhau là vklvk hay vklmk. Protein
HP1125 chủng của Việt Nam, do một đôt biến đứt đoạn của
hai cặp bazo, có thành phần acid amine đặc biệt với ít nhất
là 5 acid amine mới qisev ở đầu C’. Đó có thể là một
epitope thẳng với những khả năng gây đáp ứng miễn dịch
mới đối với con người .
HP1125 là một protein màng ngoài của vi khuẩn
Helicobacter pylori. Các biến thể riêng rẽ của protein
HP1125 có thể gắn liền với một kiểu tương tác với tế bào
dạ dày. Những nghiên cứu tiếp theo bao gồm việc xác định
mối tương quan của các biến thể gen HP1125 của
Helicobacter pylori với các đáp ứng miễn dịch ở người
bệnh sẽ được tiến hành cùng với các nghiên cứu ảnh hưởng
của các biến thể HP1125 lên tế bào ung thư dạ dày.
Hình 4 - So sánh các protein của các chủng Helicobacter
pylori 1) Omp22 2) HP1125
3) Omp 18 và 4) J99.
KẾT LUẬN
Gen HP1125 mã hoá cho protein màng ngoài của
Helicobacter pylori đã được giải toàn bộ trình tự. Đó là một
biến thể không giống các gen cùng một họ đ...
Tags: bài tập về điện di gen