Download miễn phí Tinh sạch protein
Kỹthuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mởrộng của kỹthuật sắc ký cột có khảnăng
phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sựphân chia
rõ ràng và nhưthếsẽcó nhiều vịtrí tương tác dẫn đến khảnăng phân tách được tăng lên
đáng kể. Bởi vì cột được làm từvật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột
đểcó được một tốc độchảy thích hợp. Kết quảthực có sựphân giải cao và phân tách
nhanh.
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
Tinh sạch proteinI. Giới thiệu chung
Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định
được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác
nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Hơn thế nữa, việc tinh thể
hóa protein chỉ có thể thực hiện với những protein tinh sạch và từ những tinh thể đó
chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị chức năng của protein thông
qua dữ liệu chiếu xạ tia X.
Vì vậy, quá trình tinh sạch protein không ngừng được cải tiến để đạt được độ tinh sạch
cao nhất nhưng nhìn chung một quá trình tinh sạch protein cũng cần đi qua các bước căn
bản sau:
1. Nhận biết protein mục tiêu
2. Ly trích protein từ tế bào
3. Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích, và liên kết ái lực
4. Phân tách protein bằng điện di trên gel
5. Xác định trọng lượng và khối lượng của protein
II. Nhận biết protein mục tiêu
Kết quả của sự tinh sạch là một mẫu protein chỉ chứa đúng một loại phân tử, ở đây là một
loại protein mà nhà sinh hóa quan tâm. Mẫu protein này chỉ là một phân đoạn chiếm 1%
vật liệu ban đầu, vốn có thể là dịch nuôi cấy tế bào hay một cơ quan riêng biệt lấy của
thực vật hay động vật. Để xác định được protein mục tiêu từ hỗn hợp protein, nhà sinh
hóa cần thực hiện một thử nghiệm dựa vào đặc tính của protein đó. Nếu protein mục tiêu
là một enzyme thì thử nghiệm sẽ được thực hiện dựa trên hoạt tính của enzyme đó. Cụ
thể như với enzyme lactate dehydrogenase, một enzyme có vai trò trong việc sản xuất
năng lượng từ glucose cũng như tổng hợp glucose từ lactate, để xác định enzyme này thì
dựa trên phản ứng của nó trong tế bào
Sau đó, dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng 340nm của Nicotinamide
adenine dinucleotide (NADH), ta có thể đo được lượng ánh sáng được hấp thụ ở bước
sóng 340nm trong một đơn vị thời gian để xác định hoạt tính của enzyme lactate
dehydrogenase. Trên thực tế việc tìm ra một thử nghiệm hiệu quả thường rất khó, nhưng
nếu có được một cách thử nghiệm càng đặc hiệu thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả.
Tuy nhiên, để chắc chắn quá trình tinh sạch hoạt động tốt, chúng ta còn cần một thông số
là lượng protein có trong hỗn hợp được thử nghiệm. Hiện nay có rất nhiều phương pháp
phát hiện nhanh và chính xác nồng độ protein. Dựa vào 2 thông số thực nghiệm là hoạt
tính enzyme và nồng độ protein, ta có thể xác định hoạt tính riêng của enzyme tức là tỉ lệ
hoạt tính enzyme với hàm lượng protein có trong mẫu thử nghiệm. Hoạt tính riêng càng
cao thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả hay nói cách khác, mục tiêu của việc tinh sạch là
làm tăng tối đa hoạt tính riêng.
III. Ly trích protein từ tế bào
Khi đã tìm ra thử nghiệm phù hợp và chọn được nguồn protein, chúng ta cần phân đoạn
dịch tế bào thành nhiều phần và xác định xem phần nào chứa nhiều protein mục tiêu. Quá
trình tìm phân đoạn mục tiêu được phát triển bằng sự mày mò qua từng thí nghiệm. Bước
đầu tiên là phá vỡ màng tế bào, tạo thành hỗn hợp đồng chất. Sau đó phân đoạn hỗn hợp
bằng ly tâm, dịch nổi chứa phân tử có trọng lượng thấp, những phân tử có trọng lượng
cao hơn lắng xuống đáy ống ly tâm. Dịch nổi lại được ly tâm lần nữa với lực mạnh hơn
để tạo cặn và dịch nổi mới. Tiến trình này, được gọi là ly tâm phân đoạn, sẽ tạo được
nhiều phân đoạn khác nhau với tỉ trọng giảm dần, mỗi phân đoạn này chứa hàng trăm
phân tử protein khác nhau, sẽ được tinh sạch sau khi đã qua thử nghiệm hoạt tính. Thông
thường, một phân đoạn có hoạt tính cao sẽ là nguồn vật liệu cho các kỹ thuật tinh sạch
hiệu quả.
IV. Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích, và liên
kết ái lực
Hàng ngàn protein đã được tinh sạch ở dạng có hoạt tính dựa trên những đặc tính căn bản
như độ hòa tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực. Thông thường, một hỗn hợp
protein sẽ trải qua nhiều giai đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên một đặc tính nhất
định, để cuối cùng là một protein tinh sạch. Ở mỗi bước phân tách, thử nghiệm xác định
hoạt tính và xác định nồng độ protein đều được thực hiện. Lượng đáng kể protein tinh
sạch, khoảng vài miligram, có thể giúp ta biết được cấu trúc không gian ba chiều và cơ
chế phản ứng của nó. Vì vậy, sản lượng toàn phần là một điểm quan trọng của quá trình
tinh sạch. Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa bằng muối, màng bán dẫn, sắc ký.
IV.1 Tủa bằng muối
Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính hòa tan, hiện tượng này gọi là tủa
bằng muối (salting out). Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ muối nhất định. Vì
vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được dùng để phân đoạn protein. Ví dụ như
fibrinogen tủa ở nồng độ muối ammonium sulfate 0.8 M trong khi phải đến nồng độ 2.4
M, albumin mới kết tủa. Hiện tượng này được sử dụng để tăng nồng độ của một dung
dịch protein loãng chứa các phân đoạn có hoạt tính của các bước tinh sạch trước. Nếu cần
thiết, lượng muối có thể được loại bỏ bằng sự thẩm tách
IV.2 Sự thẩm tách
Protein có thể được phân tách bằng sự thẩm tách thông qua màng bán dẫn, chẳng hạn
màng cellulose với nhiều lỗ. Những phân tử có cấu trức không gian nhất định lớn hơn
dường kính của lỗ sẽ bị giữ lại bên trong túi thẩm tách, trong khi đó, những phân tử nhỏ
hơn và các ion sẽ đi qua các lỗ đó ra ngoài túi. Kỹ thuật này dùng để loại bỏ muối hay
tách những phân tử nhỏ, nhưng với kỹ thuật này không phân biệt được các loại protein
với nhau.
IV.3 Sắc ký
Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích
hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc
định lượng và định danh.
Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách. Trong đó, tùy vào loại mẫu
cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho pha cố định và pha
di động.
Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là sắc ký lọc gel
dựa vào kích thước của phân tử (size exclusion chromagraphy), sắc ký trao đổi ion dựa
vào điện tích của phân tử (ion exchange chromagraphy), sắc ký ái lực dựa vào ái lực của
phân tử với một loại phân tử khác (affinity chromagraphy) và sắc ký lỏng cao áp dựa vào
kích thước của phân tử nhưng có độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquid
chromagraphy).
IV.3.1 Sắc ký lọc gel
Phương pháp này tốt hơn các phương pháp trên vì nó dựa vào kích thước phân tử. Mẫu sẽ
được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan nhưng có tính
hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay polyacrylamide.
Sephadex, Sepharose, và Bio-gel là những loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn những
hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100µm (0.1mm). Những phân tử nhỏ có thể ở c