Download miễn phí Khóa luận Khảo sát quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm trichoderma reesei
MỤC LỤC
Danh sách các từ viết tắt v
Danh sách các bảng vi
Danh sách các hình vii
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu của đề tài 2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3
2.1. Sàng lọc các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase ngoại bào 3
2.2. Giới thiệu về Trichoderma Reesei 4
2.2.1. Lịch sử nguyên cứu Trichoderma 4
2.2.2. Nuôi cấy Trichoderma Reesei trên môi trường bã mía kết hợp cám mì 5
2.2.3. Hình thái của Trichoderma Reesei 5
2.2.4. Đặc điểm 6
2.2.5. Ứng dụng 8
2.2.5.1. Lương thực và nghành dệt 8
2.2.5.2. Chất kiểm soát sinh học 8
2.2.5.3. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng 8
2.2.5.4. Nguồn gen sử dụng trong chuyển gel 8
2.2.5.5. Biện pháp canh tác hữu cơ 9
2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme 10
2.4. Giới thiệu sơ lược về protease 12
2.4.1. Ứng dụng của protease 13
2.5. Sơ lược về enzyme cellulase thu nhận từ Trichoderma Reesei 15
2.5.1. Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase 16
2.5.2. Tính chất hóa lý của enzyme cellulase 18
2.5.3. Ứng dụng của enzyme cellulase 19
2.5.4. Các kémồn thu nhận enzyme 19
2.6. Kỹ thuật cơ bản chuẩn bị dịch protein thô 19
2.7. Cố định enzyme 20
2.7.1. Định nghĩa cố định enzyme 20
2.7.2. Ưu nhược điểm của cố định enzyme 20
2.7.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cố định 21
2.7.4. Phương pháp cố định enzyme 21
2.7.5. Ứng dụng của enzyme cố định 22
2.7.5.1. Trong công nghiệp 22
2.7.5.2. Trong y học 22
2.7.5.3. Trong nghiên cứu khoa học 23
2.7.5.4. Trong bảo vệ môi trường 23
2.7.6. Tình hình nguyên cứu trong và ngoài nước 24
2.7.6.1. Tình hình nguyên cứu trong nước 24
2.7.6.2. Tình hình nguyên cứu ngoài nước 24
CHƯƠNG 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY 26
3.1. Thiết bị và hóa chất 26
3.1.1. Thiết bị 26
3.1.2. Hóa chất 28
3.2. Quy trình thu nhận dịch chiết enzyme thô 28
3.2.1. Thuyết minh quy trình 29
3.3. Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase 31
3.3.1. Xác định hàm lượng enzyme cellulase theo phương pháp Baradford 31
3.3.2. Xác định hoạt tính enzyme cellulase 33
3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường, độ ẩm, thời gian, nhiệt độ tối ưu, độ pH tối thích đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 35
3.4.1. Nghiên cứu thành phần môi trường đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 35
3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 36
3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 37
3.4.4. Xác định độ pH tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase 37
3.4.5. Xác định nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp enzymecellulase 38
3.5. Khảo sát tác nhân trợ tủa 38
3.5.1. Tủa protein-enzyme bằng muối, dung môi hữu cơ hay polymer 38
3.5.2. Tủa enzyme bằng muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau 39
3.5.3. Tủa protein-enzyme bằng phức hợp nước và dung môi hữu cơ 39
3.5.4. Tủa protein-enzyme bằng các polymer trung tính 39
3.5.5. Tủa protein-enzyme bằng điểm đẳng điện 40
3.6. Cố định enzyme cellulase trên chất mang Natriaginatel 40
3.7. Tinh sạch enzyme 41
3.7.1. Chuẩn bị hóa chất và công cụ 41
3.7.1.1. công cụ và thiết bị 41
3.7.1.2. Hóa chất 41
3.7.1.3 Tinh sạch enzyme 41
3.8. Xác định trọng lượng phân tử bằng điện di trên gel Polyacrylamide 43
3.8.1. Giới thiệu về gel Polycrylamide 43
3.8.2. Vật liệu 44
3.8.2.1. công cụ và thiết bị 44
3.8.2.2. Hóa chất 45
3.8.3. Phương pháp 46
3.8.3.1. Đổ gel 46
3.8.3.2. Chuẩn bị mẫu và chạy điện di 48
3.8.3.3. Xác định trọng lượng phân tử của protein 48
3.9. Khảo sát số lần tái dùng enzyme cellulase trên Natrialginate 49
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51
4.1. Kết Luận 51
4.2. Đề Nghị 51
Tài Liệu Tham Khảo 52
Phụ lục 54
Enzyme L-asparaginase có khả năng ức chế sự phát triển của u ác tính, nếu đưa trực tiếp enzyme này vào cơ thể sẽ bị đưa ra ngoài nhanh chóng và gây nên hiện tượng dị ứng, nhưng nếu đưa các vi tiểu cầu có gắn enzyme vào cơ thể sẽ có hiệu quả cao hơn.
2.7.5.3. Trong nghiên cứu khoa học
Năm 1967, điện cực enzyme vừa được chế tạo để xác định nồng độ glucose nhờ glucoxydase cố định. Điện cực enzyme là điện cực oxy trên bề mặt gel polyacryamide. Nhúng điện cực vào dung dịch glucose , cơ chất và oxy sẽ khuếch tán vào gel chứa enzyme. Như vậy sự biến đổi dòng điện trong hệ thống điện cực phụ thuộc vào tốc độ phản ứng và nồng độ glucose.
Kaetsu dùng điện cực urease trong máu, dùng cholesterol oxydase đo nồng độ cholesterol.
Clark dùng điện cực alcohol oxyreductase để xác định nồng độ cồn.
Ngoài ra enzyme cố định còn có thể được dùng vào nhiều mục đích khác nhau như: hoạt hóa enzyme zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein, dùng trong phương pháp sắc kí ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc biệt với enzyme. Ngày nay có nhiều quy trình dùng tế bào cố định để xử lí nước thải đạt hiệu quả cao.
2.7.5.4. Trong bảo vệ môi trường
Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, rượu, bia, chế biến đường…chất thải, phế phụ liệu của những nhà máy này là nguồn ô nhiễm nặng do giàu chất hữu cơ. Do đó có thể dùng enzyme cố định để xử lí nước thải sinh học nhằm làm giảm thiểu hàm lượng hữu cơ trước khi đưa ra ngoài môi trường bên ngoài.
2.7.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.7.6.1. Tình hình nguyên cứu trong nước
Nghiên cứu cố định enzyme chỉ mới bắt đầu ở Việt Nam trong vài năm gần đây, kết quả thu được cũng còn nhiều hạn chế.
Năm 1994 -1995, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh nghiên cứu enzyme glucoisomerase trên các hạt Silochrom B2 hoạt hóa bằng glutaraldehyde.
Lê Văn Hiệp (1995), cố định vi khuẩn tả (Vibrio cholerea) lên giá thể PHEMA bằng kĩ thuật bức xạ, Nguyễn Quốc Hiến (1996) vừa nghiên cứu chế tạo chế phẩm hormone progesterone thải chậm bằng kĩ thuật bức xạ.
Lê Quang Luân (1997) vừa cố định vi khuẩn Pseudomonas mastophlla để xử lí chất hữu cơ nước.
Nguyễn Quang Tâm (2002) vừa nghiên cứu cố định pectinase thu thập từ các chủng nấm mốc, Nguyễn Quyết (2004) vừa nghiên cứu cố định α – amylase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis…
2.7.6.2. Tình hình nguyên cứu ngoài nước
Cho đến năm 1979, người ta còn rất hy vọng có thể áp dụng công nghệ này cho tất cả các loại enzyme. Tuy nhiên đánh giá thực sự cho thấy hiện mới chỉ có 2 công nghệ sử dụng glucose isomerase và penicillin amidase cố định là có hiệu quả. Hiện tại enzyme amino acid acyclase, aspartase, fumarase cũng đã bắt đầu được ứng dụng thực
tiễn (chủ yếu là ở Nhật).
Bảng 2.2 Một số enzyme cố định đang được sử dụng trong sản xuất
Enzyme cố định
Sản lượng (tấn/năm)
Phương pháp cố định
Hãng sản xuất
Aminoacid acylase
1000 t
DEAE sepharose Reactor màng Eupergit
Tanabe
Degussa
Rohm
Aminoglucosidase
5000 t sirô glucose
Than hoạt tính
Tate % Lyle
Aspartate
1000 t
Nhốt tế bào trong carrageeman
Tanabe
Furmarase
Malic acid
Nhốt tế bào trong carrageeman
Tanabe
Glucose Isomerase
6-7 triệu tấn
Lactase
< 1000 t sirô lactose
Hạt ceramic, trao đổi ion, sợi nylon
Corning Sumomoto
Lipatse
Chuyển ester, thủy phân
Trao đổi ion celite
Novo Unillever
Nitrilase
6000 t acrylamide
Nhốt tế bào trong polyacrylamide
Nitto
RNAase
>500 t RNA
Thủy tinh, cellulose hoạt hóa, Eugergit
VR China, Japan Rohm
Penicillin G amidase
4500 t 6-amino-penicillanic
Eupergit
Rohm
Beecham
Penicillin
V amidase
500 t
Polyacrylamide, sợi nylon
Toyo Jozo
Boehringer
Novo
Tế bào nấm men
Sản xuất cồn
Na-alginate
KyowaHakko
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY
3.1. Thiết bị và hóa chất
3.1.1. Thiết bị
Bể ổn nhiệt
Cân phân tích
Máy ly tâm
Máy quang phổ UV
Máy lắc nuôi cấy
Nồi khử trùng
Máy đo pH
Tủ sấy
Ống nghiệm
Bình tam giác
Phễu lọc, giấy lọc
Đũa khuấy
Pipet man các loại
Cốc thủy tinh: 100ml, 250ml, 500ml
Gía đựng ống nghiệm
Ống đong 100ml, 250ml
Xi lanh
Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-rad, Mỹ
Các công cụ chạy điện di
Tủ lạnh
Hình 3.1 Máy đo pH Hình 3.2 Cân phân tích
Hình 3.3 Máy đo quang UV Hình 3.4 Máy ly tâm
Hình 3.5 Bể ổn nhiệt
3.1.2. Hóa chất
Triton X-100
Tween-20
Tweeen-80
Sodium carboxymethyl cellulose
Coomassie Brilliant Blue
Hóa chất để tủa enzyme: Cồn 960, muối ammonium sulphate, acetone
Dung dịch đệm phosphate: NaH2PO4.12H2O, NaH2PO4
Hóa chất xác định hàm lượng protein: Thuốc thử Bradfosd
CaCl2 0,02M
Acid acetic 1%
Chế phẩm
3.2. Quy trình thu nhận dịch chiết enzyme thô (quy mô công nghiệp)
Dịch
↓ (Trộn tỷ lệ nước)
↓
Khuấy
↓
Lọc
↓
Thu Dịch
↓
Ly tâm (8000 vòng/p)
↓
Dịch
↓
Tủa (bằng : cồn, aceton, muối amoni sunfat)
Ly tâm
↓
Enzyme thô
↓
Tinh sạch
↓
3.2.1. Thuyết minh quy trình
Chủng nấm Trichoderma Reesei được nuôi cấy trên môi trường BM:CM (bã mía:cám mì), sau quá trình nuôi cấy ta thu được chế phẩm enzyme thô từ môi trường.
Cân 5 g chế phẩm enzyme thô cho vào cốc thủy tinh, thêm vào 20 ml nước cất.
Khuấy đều dịch enzyme trong khoảng thời gian 30 phút (có thể khuấy trong khoảng thời gian 40, 50 phút, nhưng khoảng thời gian khuấy 30 phút là phù hợp nhất).
Lọc lấy dịch chiết được thể tích khoảng 17,5 ml.
Đem dịch lọc được đi ly tâm.
Thu dịch ly tâm.
Tủa dịch ly tâm (bằng cồn, acetone, hay muối amoni sulphate), trong trường hợp này ta tủa dịch ly tâm bằng cồn 960, với tỷ lệ 1:3, tức là: 17,5 ml dịch chiết enzyme thô với 52,5 ml cồn 960.
Tách lấy phần tủa ở dưới đem đi ly tâm.
Thu dịch ly tâm đem cân phân tích thu được khoảng 20,1g enzyme thô. Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyme cellulase ở 400 C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương).
Sau đó ta đem enzyme thô đi tinh sạch bằng quá trình lọc gel hay dùng phương pháp cố định enzyme để thu được enzyme cellulase thành phẩm.
Hình 3.6 Dịch chiết enzyme thô sau khi ly tâm
3.3. Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase
3.3.1. Xác định hàm lượng enzyme cellulase theo phương pháp Bradford
Các Protein khi phản ứng xanh với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue-CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
Hóa chất, thiết bị:
Dung dịch m...
LInk download cho anh em:
MỤC LỤC
Danh sách các từ viết tắt v
Danh sách các bảng vi
Danh sách các hình vii
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu của đề tài 2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3
2.1. Sàng lọc các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase ngoại bào 3
2.2. Giới thiệu về Trichoderma Reesei 4
2.2.1. Lịch sử nguyên cứu Trichoderma 4
2.2.2. Nuôi cấy Trichoderma Reesei trên môi trường bã mía kết hợp cám mì 5
2.2.3. Hình thái của Trichoderma Reesei 5
2.2.4. Đặc điểm 6
2.2.5. Ứng dụng 8
2.2.5.1. Lương thực và nghành dệt 8
2.2.5.2. Chất kiểm soát sinh học 8
2.2.5.3. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng 8
2.2.5.4. Nguồn gen sử dụng trong chuyển gel 8
2.2.5.5. Biện pháp canh tác hữu cơ 9
2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme 10
2.4. Giới thiệu sơ lược về protease 12
2.4.1. Ứng dụng của protease 13
2.5. Sơ lược về enzyme cellulase thu nhận từ Trichoderma Reesei 15
2.5.1. Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase 16
2.5.2. Tính chất hóa lý của enzyme cellulase 18
2.5.3. Ứng dụng của enzyme cellulase 19
2.5.4. Các kémồn thu nhận enzyme 19
2.6. Kỹ thuật cơ bản chuẩn bị dịch protein thô 19
2.7. Cố định enzyme 20
2.7.1. Định nghĩa cố định enzyme 20
2.7.2. Ưu nhược điểm của cố định enzyme 20
2.7.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cố định 21
2.7.4. Phương pháp cố định enzyme 21
2.7.5. Ứng dụng của enzyme cố định 22
2.7.5.1. Trong công nghiệp 22
2.7.5.2. Trong y học 22
2.7.5.3. Trong nghiên cứu khoa học 23
2.7.5.4. Trong bảo vệ môi trường 23
2.7.6. Tình hình nguyên cứu trong và ngoài nước 24
2.7.6.1. Tình hình nguyên cứu trong nước 24
2.7.6.2. Tình hình nguyên cứu ngoài nước 24
CHƯƠNG 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY 26
3.1. Thiết bị và hóa chất 26
3.1.1. Thiết bị 26
3.1.2. Hóa chất 28
3.2. Quy trình thu nhận dịch chiết enzyme thô 28
3.2.1. Thuyết minh quy trình 29
3.3. Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase 31
3.3.1. Xác định hàm lượng enzyme cellulase theo phương pháp Baradford 31
3.3.2. Xác định hoạt tính enzyme cellulase 33
3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường, độ ẩm, thời gian, nhiệt độ tối ưu, độ pH tối thích đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 35
3.4.1. Nghiên cứu thành phần môi trường đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 35
3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 36
3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 37
3.4.4. Xác định độ pH tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase 37
3.4.5. Xác định nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp enzymecellulase 38
3.5. Khảo sát tác nhân trợ tủa 38
3.5.1. Tủa protein-enzyme bằng muối, dung môi hữu cơ hay polymer 38
3.5.2. Tủa enzyme bằng muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau 39
3.5.3. Tủa protein-enzyme bằng phức hợp nước và dung môi hữu cơ 39
3.5.4. Tủa protein-enzyme bằng các polymer trung tính 39
3.5.5. Tủa protein-enzyme bằng điểm đẳng điện 40
3.6. Cố định enzyme cellulase trên chất mang Natriaginatel 40
3.7. Tinh sạch enzyme 41
3.7.1. Chuẩn bị hóa chất và công cụ 41
3.7.1.1. công cụ và thiết bị 41
3.7.1.2. Hóa chất 41
3.7.1.3 Tinh sạch enzyme 41
3.8. Xác định trọng lượng phân tử bằng điện di trên gel Polyacrylamide 43
3.8.1. Giới thiệu về gel Polycrylamide 43
3.8.2. Vật liệu 44
3.8.2.1. công cụ và thiết bị 44
3.8.2.2. Hóa chất 45
3.8.3. Phương pháp 46
3.8.3.1. Đổ gel 46
3.8.3.2. Chuẩn bị mẫu và chạy điện di 48
3.8.3.3. Xác định trọng lượng phân tử của protein 48
3.9. Khảo sát số lần tái dùng enzyme cellulase trên Natrialginate 49
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51
4.1. Kết Luận 51
4.2. Đề Nghị 51
Tài Liệu Tham Khảo 52
Phụ lục 54
Enzyme L-asparaginase có khả năng ức chế sự phát triển của u ác tính, nếu đưa trực tiếp enzyme này vào cơ thể sẽ bị đưa ra ngoài nhanh chóng và gây nên hiện tượng dị ứng, nhưng nếu đưa các vi tiểu cầu có gắn enzyme vào cơ thể sẽ có hiệu quả cao hơn.
2.7.5.3. Trong nghiên cứu khoa học
Năm 1967, điện cực enzyme vừa được chế tạo để xác định nồng độ glucose nhờ glucoxydase cố định. Điện cực enzyme là điện cực oxy trên bề mặt gel polyacryamide. Nhúng điện cực vào dung dịch glucose , cơ chất và oxy sẽ khuếch tán vào gel chứa enzyme. Như vậy sự biến đổi dòng điện trong hệ thống điện cực phụ thuộc vào tốc độ phản ứng và nồng độ glucose.
Kaetsu dùng điện cực urease trong máu, dùng cholesterol oxydase đo nồng độ cholesterol.
Clark dùng điện cực alcohol oxyreductase để xác định nồng độ cồn.
Ngoài ra enzyme cố định còn có thể được dùng vào nhiều mục đích khác nhau như: hoạt hóa enzyme zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein, dùng trong phương pháp sắc kí ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc biệt với enzyme. Ngày nay có nhiều quy trình dùng tế bào cố định để xử lí nước thải đạt hiệu quả cao.
2.7.5.4. Trong bảo vệ môi trường
Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, rượu, bia, chế biến đường…chất thải, phế phụ liệu của những nhà máy này là nguồn ô nhiễm nặng do giàu chất hữu cơ. Do đó có thể dùng enzyme cố định để xử lí nước thải sinh học nhằm làm giảm thiểu hàm lượng hữu cơ trước khi đưa ra ngoài môi trường bên ngoài.
2.7.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.7.6.1. Tình hình nguyên cứu trong nước
Nghiên cứu cố định enzyme chỉ mới bắt đầu ở Việt Nam trong vài năm gần đây, kết quả thu được cũng còn nhiều hạn chế.
Năm 1994 -1995, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh nghiên cứu enzyme glucoisomerase trên các hạt Silochrom B2 hoạt hóa bằng glutaraldehyde.
Lê Văn Hiệp (1995), cố định vi khuẩn tả (Vibrio cholerea) lên giá thể PHEMA bằng kĩ thuật bức xạ, Nguyễn Quốc Hiến (1996) vừa nghiên cứu chế tạo chế phẩm hormone progesterone thải chậm bằng kĩ thuật bức xạ.
Lê Quang Luân (1997) vừa cố định vi khuẩn Pseudomonas mastophlla để xử lí chất hữu cơ nước.
Nguyễn Quang Tâm (2002) vừa nghiên cứu cố định pectinase thu thập từ các chủng nấm mốc, Nguyễn Quyết (2004) vừa nghiên cứu cố định α – amylase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis…
2.7.6.2. Tình hình nguyên cứu ngoài nước
Cho đến năm 1979, người ta còn rất hy vọng có thể áp dụng công nghệ này cho tất cả các loại enzyme. Tuy nhiên đánh giá thực sự cho thấy hiện mới chỉ có 2 công nghệ sử dụng glucose isomerase và penicillin amidase cố định là có hiệu quả. Hiện tại enzyme amino acid acyclase, aspartase, fumarase cũng đã bắt đầu được ứng dụng thực
tiễn (chủ yếu là ở Nhật).
Bảng 2.2 Một số enzyme cố định đang được sử dụng trong sản xuất
Enzyme cố định
Sản lượng (tấn/năm)
Phương pháp cố định
Hãng sản xuất
Aminoacid acylase
1000 t
DEAE sepharose Reactor màng Eupergit
Tanabe
Degussa
Rohm
Aminoglucosidase
5000 t sirô glucose
Than hoạt tính
Tate % Lyle
Aspartate
1000 t
Nhốt tế bào trong carrageeman
Tanabe
Furmarase
Malic acid
Nhốt tế bào trong carrageeman
Tanabe
Glucose Isomerase
6-7 triệu tấn
Lactase
< 1000 t sirô lactose
Hạt ceramic, trao đổi ion, sợi nylon
Corning Sumomoto
Lipatse
Chuyển ester, thủy phân
Trao đổi ion celite
Novo Unillever
Nitrilase
6000 t acrylamide
Nhốt tế bào trong polyacrylamide
Nitto
RNAase
>500 t RNA
Thủy tinh, cellulose hoạt hóa, Eugergit
VR China, Japan Rohm
Penicillin G amidase
4500 t 6-amino-penicillanic
Eupergit
Rohm
Beecham
Penicillin
V amidase
500 t
Polyacrylamide, sợi nylon
Toyo Jozo
Boehringer
Novo
Tế bào nấm men
Sản xuất cồn
Na-alginate
KyowaHakko
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY
3.1. Thiết bị và hóa chất
3.1.1. Thiết bị
Bể ổn nhiệt
Cân phân tích
Máy ly tâm
Máy quang phổ UV
Máy lắc nuôi cấy
Nồi khử trùng
Máy đo pH
Tủ sấy
Ống nghiệm
Bình tam giác
Phễu lọc, giấy lọc
Đũa khuấy
Pipet man các loại
Cốc thủy tinh: 100ml, 250ml, 500ml
Gía đựng ống nghiệm
Ống đong 100ml, 250ml
Xi lanh
Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-rad, Mỹ
Các công cụ chạy điện di
Tủ lạnh
Hình 3.1 Máy đo pH Hình 3.2 Cân phân tích
Hình 3.3 Máy đo quang UV Hình 3.4 Máy ly tâm
Hình 3.5 Bể ổn nhiệt
3.1.2. Hóa chất
Triton X-100
Tween-20
Tweeen-80
Sodium carboxymethyl cellulose
Coomassie Brilliant Blue
Hóa chất để tủa enzyme: Cồn 960, muối ammonium sulphate, acetone
Dung dịch đệm phosphate: NaH2PO4.12H2O, NaH2PO4
Hóa chất xác định hàm lượng protein: Thuốc thử Bradfosd
CaCl2 0,02M
Acid acetic 1%
Chế phẩm
3.2. Quy trình thu nhận dịch chiết enzyme thô (quy mô công nghiệp)
Dịch
↓ (Trộn tỷ lệ nước)
↓
Khuấy
↓
Lọc
↓
Thu Dịch
↓
Ly tâm (8000 vòng/p)
↓
Dịch
↓
Tủa (bằng : cồn, aceton, muối amoni sunfat)
Ly tâm
↓
Enzyme thô
↓
Tinh sạch
↓
3.2.1. Thuyết minh quy trình
Chủng nấm Trichoderma Reesei được nuôi cấy trên môi trường BM:CM (bã mía:cám mì), sau quá trình nuôi cấy ta thu được chế phẩm enzyme thô từ môi trường.
Cân 5 g chế phẩm enzyme thô cho vào cốc thủy tinh, thêm vào 20 ml nước cất.
Khuấy đều dịch enzyme trong khoảng thời gian 30 phút (có thể khuấy trong khoảng thời gian 40, 50 phút, nhưng khoảng thời gian khuấy 30 phút là phù hợp nhất).
Lọc lấy dịch chiết được thể tích khoảng 17,5 ml.
Đem dịch lọc được đi ly tâm.
Thu dịch ly tâm.
Tủa dịch ly tâm (bằng cồn, acetone, hay muối amoni sulphate), trong trường hợp này ta tủa dịch ly tâm bằng cồn 960, với tỷ lệ 1:3, tức là: 17,5 ml dịch chiết enzyme thô với 52,5 ml cồn 960.
Tách lấy phần tủa ở dưới đem đi ly tâm.
Thu dịch ly tâm đem cân phân tích thu được khoảng 20,1g enzyme thô. Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyme cellulase ở 400 C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương).
Sau đó ta đem enzyme thô đi tinh sạch bằng quá trình lọc gel hay dùng phương pháp cố định enzyme để thu được enzyme cellulase thành phẩm.
Hình 3.6 Dịch chiết enzyme thô sau khi ly tâm
3.3. Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase
3.3.1. Xác định hàm lượng enzyme cellulase theo phương pháp Bradford
Các Protein khi phản ứng xanh với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue-CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.
Hóa chất, thiết bị:
Dung dịch m...
LInk download cho anh em:
You must be registered for see links