boutique_84
New Member
Download Luận văn Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A
MỤC LỤC
Lời cam đoan
Lời Thank
Mục lục
Danh mục các chữviết tắt
Danh mục bảng .
Danh mục hình
1. MỞ đẦU 1
1.1 đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích và yêu cầu 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu chung vềcây thuốc lá 3
2.1.1 Lịch sửhình thành - phát triển thuốc lá 4
2.1.2 Các đặc điểm thực vật học cây thuốc lá 5
2.1.3 Tình hình sâu bệnh hại 6
2.1.5 Giá trịcủa cây thuốc lá 7
2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu 7
2.2. Chuyển gen ởthực vật - cơsở khoa học của dề tài 9
2.2.1 Khái niệm chuyển gen 9
2.2.2 Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng 10
2.3 Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis (Bt)19
2.3.1 Lịch sửphát hiện độc tốBt 19
2.3.2 Các loại protein độc tốcủa Bt 20
2.4 Một sốthành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thếgiới 22
2.5 Tình hình nghiên cứu vềcây thuốc lá chuyển gen trong nước 23
3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị 25
3.1.1 Vật liệu 25
3.1.2 Hoá chất, thiết bị 25
3.2 địa điểm và thời gian: 26
3.3 Phương pháp nghiên cứu 26
3.3.1 Phương pháp thiết kếvector chuyển gen 26
3.3.2 Phương pháp chuyển vector tái tổhợp vào tếbào A. tumefaciensbằng xung điện 31
3.3.3 Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens(theo Topping, 1998 ) 31
3.3.4 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹthuật PCR 33
3.4 Các chỉtiêu theo dõi: 36
4. KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN 37
4.1 Thiết kếvector pBI121 mang gen vip3A 37
4.1.1 Thiết kếmồi 38
4.1.2 PCR nhân đoạn gen vip3A và tinh sạch sản phẩm PCR 39
4.1.3 Ghép nối đoạn gen vip3A vào vector tách dòng 40
4.1.4 Biến nạp plasmit tái tổhợp vào tếbào khảbiến E.coliDH5α40
4.1.5 Chọn lọc plasmit tái tổhợp 41
4.1.6 Tạo vector chuyển gen mang gen vip3A 42
4.2 Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá 45
4.2.1 Biến nạp vector mang gen vip3A vào tếbào A. tumerfaciensbằng xung điện 45
4.2.2 Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens 46
4.3 Kiểm tra và theo dõi kết quảchuyển gen 53
5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ57
5.1 Kết luận 57
5.2 Kiến nghị 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58
PHỤ LỤC 64
Để tải bản DOC Đầy Đủ xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
hoá protein 70 kDa ñặc hiệu với ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea) và hai cánh
(Diptera). Các gen cryIII mã hoá protein nặng 70 kDa ñặc hiệu với ấu trùng
cánh cứng (Coleoptera). Các gen cryIV ñặc hiệu với ấu trùng bộ hai cánh
(Diptera). Sau ñó có thêm nhóm cryV mã hoá các protein ấu trùng cánh cứng
(Coleoptera) và ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea) (Tailor và cs, 1992)
Ngày nay các gen mã hoá cho protein nội ñộc tố (gồm 140 gen ñã
ñược công bố) ñược xếp chung vào nhóm có khả năng diệt ấu trùng các bộ
cánh vảy (Lepidoptea), hai cánh (Diptera) và cánh cứng (Coleoptera).
+ Cơ chế tác ñộng của nội ñộc tố Bt
Các protein dạng tinh thể sẽ hoà tan trong ruột của côn trùng có pH cao
(môi trường kiềm), giải phóng ra các protein gọi là nội ñộc tố δ (Hoftey, H. và
Whiteley, H.R, 1989) [33].
Mục tiêu chính của ñộc tố Bt là ruột giữa của côn trùng (Knowels,
1994) [34], [35]. Các tiền ñộc tố không hoạt ñộng cho ñến khi chúng bị hoà
tan bởi các enzyme phân giải protein trong ruột côn trùng (Tojo và Aijawa,
1983; Gill và cs, 1992; Lee và cs, 1992; Milne và Kaplan, 1993) [29], [37],
[39], [46]. Các ñộc tố gắn vào chất nhận ñặc hiệu ở trong màng của tế bào
biểu mô trụ. Sau khi gắn vào chất nhận, ñộc tố sẽ chèn vào màng nguyên sinh
của tế bào ñể gây tổn thương cho côn trùng. Sau khi gắn với tế bào biểu mô
ruột giữa, chuỗi xoắn kép có thể xâm nhập vào màng và hình thành kênh trao
ñổi ion (Knowels và Dow, 1993) [34]. Sự hình thành ñộc tố sẽ tạo thành các
lỗ thủng trên màng tế bào biểu mô và làm mất cân bằng trao ñổi ion nhanh
chóng. Sự hình thành các kênh ion này phá huỷ thế màng (English và Slatin,
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………22
1992) [23], làm hoại tử ruột giữa, thoái hoá màng và biểu mô, cuối cùng là
nhiễm trùng vi khuẩn sau khi côn trùng chết. Theo Knowles và Dow (1993)
[34] ñộc tố Bt làm ngừng các kênh bơm ion K+ khiến các tế bào trụ bị trương
lên và phá huỷ tính thẩm thấu. Sự ngắt quãng của toàn bộ ruột ñã làm côn
trùng chết ñói hay nhiễm trùng ñường tiêu hoá.
2.3.2.2. ðộc tố sinh dưỡng diệt côn trùng (VIP) và cơ chế tác ñộng
+ Phân loại:
Theo Estruch và cs 1996; Warren 1997; Chen và cs 2003 [19], [24], [25],
[26], [49] thì các protein sinh dưỡng diệt côn trùng ñược chia thành 2 nhóm
chính:
Nhóm liên hợp vip1 và vip2 ñặc hiệu với côn trùng bộ cánh cứng
Nhóm vip3 ñặc hiệu với côn trùng bộ cánh vảy
+ Cơ chế tác ñộng của VIP
Theo Wu và cs, 1997 [50] thì protein Vip cũng hoạt ñộng trong ruột giữa
của côn trùng. Chúng gắn với chất nhận ñặc hiệu và chèn vào màng ruột giữa
của côn trùng và tạo thành các kênh ion, làm mất cân bằng sự trao ñổi chất và
gây tê liệt bộ máy tiêu hóa của côn trùng (Crickmore và cs, 1998) [21].
2.4 Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới
Cây thuốc lá chuyển gen kháng chất diệt cỏ ñược tiến hành tại Mỹ và
Pháp năm 1986. Cây thuốc lá là ñối tượng ñược chuyển gen kháng sâu ñầu tiên
vào năm 1987 (Barton và cs, 1987; Fischoff và cs, 1987; Vaeck và cs, 1987)
[28]. Trung Quốc là quốc gia ñã thương mại hóa cây thuốc lá chuyển gen kháng
bệnh (kháng virus khảm lá thuốc lá), kháng sâu (Zhao Rong min, Yang Ying
Chang và cs, 1993). Wong và cs (1992) cũng ñã tạo ñược cây thuốc lá chuyển
gen cry1A(c) mRNA có ñộc tố cao gấp 10 - 20 lần so với cây thuốc lá chuyển
gen dùng CaMV35S promoter, hàm lượng protein ñộc tố thu ñược chiếm gần
1% lượng protein hoà tan tổng số trong lá. Gen cryIII cũng ñược chuyển vào cây
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………23
thuốc lá và cây khoai tây ñể kháng sâu Colorado potato beetle (Leptinotarsa
decemlineata) (Perlak và cs, 1993) [40]. Gen cry1A(b) và cry1A(c) cũng ñược
chuyển vào cây ñể phòng trừ côn trùng cánh vảy (Van der Salm và CS, 1994).
100% sâu xanh (H. virescens, H. zea và S. exigua) chết khi ăn lá của cây thuốc lá
thuốc lá ñược chuyển gen cry2Aa2 (Kota và cs, 1999) [36]. Selvapandian và cs
(1998) chuyển gen cry1Ia5 vào thuốc lá và cũng thể hiện tính kháng sâu xanh
(H. armigera ) tương ñương với gen cry1A(b) hay cry1A(c).
Tuy nhiên do một số yếu tố khách quan mà sản phẩm nguyên liệu
thuốc lá biến ñổi gen bị hạn chế trên thế giới nên nhiều thông tin về thuốc lá
chuyển gen chưa ñược ñánh giá khách quan
2.5 Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước
Chủ trương của Việt Nam là cho phép trồng cây biến ñổi gen và ñẩy
mạnh việc phát triển loại thực vật, ñộng vật này [53]. Mới ñây nhất, Thủ
tướng chính phủ ñã ký quyết ñịnh ñồng ý về Chương trình trọng ñiểm và ứng
dụng CNSH trong lĩnh vực NN - PTNT ñến năm 2020.
Do hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương ñối ñơn giản và thời gian phân
hóa từ mô ñến cây hoàn chỉnh khá ngắn nên trong những nghiên cứu về chuyển
gen các nhà khoa học thường chọn cây thuốc lá là cây mô hình. vì vậy những
nghiên cứu về chuyển gen trên cây thuốc lá ñã ñược tiến hành từ khá sớm.
Nguyên Liên Chi và cs (1989) [6] ñã chuyển thành công gen kháng
kanamycin vào mô thuốc lá (N.tabacum) bằng vi khuẩn A.tumefaciens. Trần
Phương Liên và cs (1994) [10] cũng công bố kết quả nghiên cứu biến nạp
một số gen chọn lọc vào các dòng thuốc lá bằng cách sử dụng Ti-plasmit
vector. Nguyễn ðức Thành và cs (1994) [11] ñã tiến hành nghiên cứu chuyển
gen lục lạp thuốc lá. Trần ðăng Kiên và cs (1999) [8] ñã nghiên cứu phương
pháp biến nạp gen tạo giống thuốc lá có khả năng kháng sâu bệnh, trong ñó ñã
xác ñịnh ñược mô lá là bộ phận tốt nhất biến nạp, nồng ñộ kanamycine (kan)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………24
30 - 50 mg/l là tốt nhất cho quá trình sàng lọc mẫu sau biến nạp, ñã tạo ra
vector chứa gen Bt là Ti-plasmit/cry IA(c)/NOS, ñã tạo ñược chủng A.
tumefacciens chứa plasmit vector pCAMBIA 1300:UBI - cry IA(c) NOS. Vũ
Thị Bản và cs (2007) [2] ñã tiến hành nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá
vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá) và ñã chuyển ñược gen CP
mã hóa vỏ virus gây bệnh khảm lá thuốc lá vào giống thuốc lá K326 và giống
C 9-1, thể hiện tính kháng bệnh TMV ở thế hệ T0.
Cho ñến nay chưa có công bố chính thức nào về những nghiên cứu
chuyển gen kháng sâu vip3A vào cây thuốc lá ở Việt Nam. Chính vì vậy
chúng tui tiến hành nghiên cứu tạo cây thuốc lá mang gen kháng sâu vip3A.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………25
3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị
3.1.1 Vật liệu
- Vật liệu thực vật: Giống thuốc lá K326 là giống thuốc lá nhập nội và
ñã ñược công nhận giống quốc gia, có một số ñặc ñiểm chính như sau:
Chiều cao trung bình: 160 - 175cm; thời gian sinh trưởng: 120 ngày;
thời gian ra nụ 10%: 53 ngày; năng suất khô: 1,8 - 2,3 tấn/ha; chất lượng tốt.
Hiện nay diện tích thuốc lá giống K326 chiếm khoảng 40% diện tích cây
trồng thuốc lá trên cả nước.
- Các vật liệu khác:
+ Các plasmit
Plasmit Kích thước (bp) ðặc tính Nơi cung cấp
pCR@ 2.1-TOPO 3900 Ampiciline
Kanamycine
hãng In...
Download miễn phí Luận văn Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A
MỤC LỤC
Lời cam đoan
Lời Thank
Mục lục
Danh mục các chữviết tắt
Danh mục bảng .
Danh mục hình
1. MỞ đẦU 1
1.1 đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích và yêu cầu 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu chung vềcây thuốc lá 3
2.1.1 Lịch sửhình thành - phát triển thuốc lá 4
2.1.2 Các đặc điểm thực vật học cây thuốc lá 5
2.1.3 Tình hình sâu bệnh hại 6
2.1.5 Giá trịcủa cây thuốc lá 7
2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu 7
2.2. Chuyển gen ởthực vật - cơsở khoa học của dề tài 9
2.2.1 Khái niệm chuyển gen 9
2.2.2 Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng 10
2.3 Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis (Bt)19
2.3.1 Lịch sửphát hiện độc tốBt 19
2.3.2 Các loại protein độc tốcủa Bt 20
2.4 Một sốthành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thếgiới 22
2.5 Tình hình nghiên cứu vềcây thuốc lá chuyển gen trong nước 23
3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị 25
3.1.1 Vật liệu 25
3.1.2 Hoá chất, thiết bị 25
3.2 địa điểm và thời gian: 26
3.3 Phương pháp nghiên cứu 26
3.3.1 Phương pháp thiết kếvector chuyển gen 26
3.3.2 Phương pháp chuyển vector tái tổhợp vào tếbào A. tumefaciensbằng xung điện 31
3.3.3 Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens(theo Topping, 1998 ) 31
3.3.4 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹthuật PCR 33
3.4 Các chỉtiêu theo dõi: 36
4. KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN 37
4.1 Thiết kếvector pBI121 mang gen vip3A 37
4.1.1 Thiết kếmồi 38
4.1.2 PCR nhân đoạn gen vip3A và tinh sạch sản phẩm PCR 39
4.1.3 Ghép nối đoạn gen vip3A vào vector tách dòng 40
4.1.4 Biến nạp plasmit tái tổhợp vào tếbào khảbiến E.coliDH5α40
4.1.5 Chọn lọc plasmit tái tổhợp 41
4.1.6 Tạo vector chuyển gen mang gen vip3A 42
4.2 Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá 45
4.2.1 Biến nạp vector mang gen vip3A vào tếbào A. tumerfaciensbằng xung điện 45
4.2.2 Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens 46
4.3 Kiểm tra và theo dõi kết quảchuyển gen 53
5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ57
5.1 Kết luận 57
5.2 Kiến nghị 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58
PHỤ LỤC 64
Để tải bản DOC Đầy Đủ xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung:
mãhoá protein 70 kDa ñặc hiệu với ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea) và hai cánh
(Diptera). Các gen cryIII mã hoá protein nặng 70 kDa ñặc hiệu với ấu trùng
cánh cứng (Coleoptera). Các gen cryIV ñặc hiệu với ấu trùng bộ hai cánh
(Diptera). Sau ñó có thêm nhóm cryV mã hoá các protein ấu trùng cánh cứng
(Coleoptera) và ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea) (Tailor và cs, 1992)
Ngày nay các gen mã hoá cho protein nội ñộc tố (gồm 140 gen ñã
ñược công bố) ñược xếp chung vào nhóm có khả năng diệt ấu trùng các bộ
cánh vảy (Lepidoptea), hai cánh (Diptera) và cánh cứng (Coleoptera).
+ Cơ chế tác ñộng của nội ñộc tố Bt
Các protein dạng tinh thể sẽ hoà tan trong ruột của côn trùng có pH cao
(môi trường kiềm), giải phóng ra các protein gọi là nội ñộc tố δ (Hoftey, H. và
Whiteley, H.R, 1989) [33].
Mục tiêu chính của ñộc tố Bt là ruột giữa của côn trùng (Knowels,
1994) [34], [35]. Các tiền ñộc tố không hoạt ñộng cho ñến khi chúng bị hoà
tan bởi các enzyme phân giải protein trong ruột côn trùng (Tojo và Aijawa,
1983; Gill và cs, 1992; Lee và cs, 1992; Milne và Kaplan, 1993) [29], [37],
[39], [46]. Các ñộc tố gắn vào chất nhận ñặc hiệu ở trong màng của tế bào
biểu mô trụ. Sau khi gắn vào chất nhận, ñộc tố sẽ chèn vào màng nguyên sinh
của tế bào ñể gây tổn thương cho côn trùng. Sau khi gắn với tế bào biểu mô
ruột giữa, chuỗi xoắn kép có thể xâm nhập vào màng và hình thành kênh trao
ñổi ion (Knowels và Dow, 1993) [34]. Sự hình thành ñộc tố sẽ tạo thành các
lỗ thủng trên màng tế bào biểu mô và làm mất cân bằng trao ñổi ion nhanh
chóng. Sự hình thành các kênh ion này phá huỷ thế màng (English và Slatin,
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………22
1992) [23], làm hoại tử ruột giữa, thoái hoá màng và biểu mô, cuối cùng là
nhiễm trùng vi khuẩn sau khi côn trùng chết. Theo Knowles và Dow (1993)
[34] ñộc tố Bt làm ngừng các kênh bơm ion K+ khiến các tế bào trụ bị trương
lên và phá huỷ tính thẩm thấu. Sự ngắt quãng của toàn bộ ruột ñã làm côn
trùng chết ñói hay nhiễm trùng ñường tiêu hoá.
2.3.2.2. ðộc tố sinh dưỡng diệt côn trùng (VIP) và cơ chế tác ñộng
+ Phân loại:
Theo Estruch và cs 1996; Warren 1997; Chen và cs 2003 [19], [24], [25],
[26], [49] thì các protein sinh dưỡng diệt côn trùng ñược chia thành 2 nhóm
chính:
Nhóm liên hợp vip1 và vip2 ñặc hiệu với côn trùng bộ cánh cứng
Nhóm vip3 ñặc hiệu với côn trùng bộ cánh vảy
+ Cơ chế tác ñộng của VIP
Theo Wu và cs, 1997 [50] thì protein Vip cũng hoạt ñộng trong ruột giữa
của côn trùng. Chúng gắn với chất nhận ñặc hiệu và chèn vào màng ruột giữa
của côn trùng và tạo thành các kênh ion, làm mất cân bằng sự trao ñổi chất và
gây tê liệt bộ máy tiêu hóa của côn trùng (Crickmore và cs, 1998) [21].
2.4 Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới
Cây thuốc lá chuyển gen kháng chất diệt cỏ ñược tiến hành tại Mỹ và
Pháp năm 1986. Cây thuốc lá là ñối tượng ñược chuyển gen kháng sâu ñầu tiên
vào năm 1987 (Barton và cs, 1987; Fischoff và cs, 1987; Vaeck và cs, 1987)
[28]. Trung Quốc là quốc gia ñã thương mại hóa cây thuốc lá chuyển gen kháng
bệnh (kháng virus khảm lá thuốc lá), kháng sâu (Zhao Rong min, Yang Ying
Chang và cs, 1993). Wong và cs (1992) cũng ñã tạo ñược cây thuốc lá chuyển
gen cry1A(c) mRNA có ñộc tố cao gấp 10 - 20 lần so với cây thuốc lá chuyển
gen dùng CaMV35S promoter, hàm lượng protein ñộc tố thu ñược chiếm gần
1% lượng protein hoà tan tổng số trong lá. Gen cryIII cũng ñược chuyển vào cây
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………23
thuốc lá và cây khoai tây ñể kháng sâu Colorado potato beetle (Leptinotarsa
decemlineata) (Perlak và cs, 1993) [40]. Gen cry1A(b) và cry1A(c) cũng ñược
chuyển vào cây ñể phòng trừ côn trùng cánh vảy (Van der Salm và CS, 1994).
100% sâu xanh (H. virescens, H. zea và S. exigua) chết khi ăn lá của cây thuốc lá
thuốc lá ñược chuyển gen cry2Aa2 (Kota và cs, 1999) [36]. Selvapandian và cs
(1998) chuyển gen cry1Ia5 vào thuốc lá và cũng thể hiện tính kháng sâu xanh
(H. armigera ) tương ñương với gen cry1A(b) hay cry1A(c).
Tuy nhiên do một số yếu tố khách quan mà sản phẩm nguyên liệu
thuốc lá biến ñổi gen bị hạn chế trên thế giới nên nhiều thông tin về thuốc lá
chuyển gen chưa ñược ñánh giá khách quan
2.5 Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước
Chủ trương của Việt Nam là cho phép trồng cây biến ñổi gen và ñẩy
mạnh việc phát triển loại thực vật, ñộng vật này [53]. Mới ñây nhất, Thủ
tướng chính phủ ñã ký quyết ñịnh ñồng ý về Chương trình trọng ñiểm và ứng
dụng CNSH trong lĩnh vực NN - PTNT ñến năm 2020.
Do hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương ñối ñơn giản và thời gian phân
hóa từ mô ñến cây hoàn chỉnh khá ngắn nên trong những nghiên cứu về chuyển
gen các nhà khoa học thường chọn cây thuốc lá là cây mô hình. vì vậy những
nghiên cứu về chuyển gen trên cây thuốc lá ñã ñược tiến hành từ khá sớm.
Nguyên Liên Chi và cs (1989) [6] ñã chuyển thành công gen kháng
kanamycin vào mô thuốc lá (N.tabacum) bằng vi khuẩn A.tumefaciens. Trần
Phương Liên và cs (1994) [10] cũng công bố kết quả nghiên cứu biến nạp
một số gen chọn lọc vào các dòng thuốc lá bằng cách sử dụng Ti-plasmit
vector. Nguyễn ðức Thành và cs (1994) [11] ñã tiến hành nghiên cứu chuyển
gen lục lạp thuốc lá. Trần ðăng Kiên và cs (1999) [8] ñã nghiên cứu phương
pháp biến nạp gen tạo giống thuốc lá có khả năng kháng sâu bệnh, trong ñó ñã
xác ñịnh ñược mô lá là bộ phận tốt nhất biến nạp, nồng ñộ kanamycine (kan)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………24
30 - 50 mg/l là tốt nhất cho quá trình sàng lọc mẫu sau biến nạp, ñã tạo ra
vector chứa gen Bt là Ti-plasmit/cry IA(c)/NOS, ñã tạo ñược chủng A.
tumefacciens chứa plasmit vector pCAMBIA 1300:UBI - cry IA(c) NOS. Vũ
Thị Bản và cs (2007) [2] ñã tiến hành nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá
vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá) và ñã chuyển ñược gen CP
mã hóa vỏ virus gây bệnh khảm lá thuốc lá vào giống thuốc lá K326 và giống
C 9-1, thể hiện tính kháng bệnh TMV ở thế hệ T0.
Cho ñến nay chưa có công bố chính thức nào về những nghiên cứu
chuyển gen kháng sâu vip3A vào cây thuốc lá ở Việt Nam. Chính vì vậy
chúng tui tiến hành nghiên cứu tạo cây thuốc lá mang gen kháng sâu vip3A.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………25
3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị
3.1.1 Vật liệu
- Vật liệu thực vật: Giống thuốc lá K326 là giống thuốc lá nhập nội và
ñã ñược công nhận giống quốc gia, có một số ñặc ñiểm chính như sau:
Chiều cao trung bình: 160 - 175cm; thời gian sinh trưởng: 120 ngày;
thời gian ra nụ 10%: 53 ngày; năng suất khô: 1,8 - 2,3 tấn/ha; chất lượng tốt.
Hiện nay diện tích thuốc lá giống K326 chiếm khoảng 40% diện tích cây
trồng thuốc lá trên cả nước.
- Các vật liệu khác:
+ Các plasmit
Plasmit Kích thước (bp) ðặc tính Nơi cung cấp
pCR@ 2.1-TOPO 3900 Ampiciline
Kanamycine
hãng In...