Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết Nối
Đánh giá khả năng định tính nhóm Beta - Agonist trong thịt bằng Kit Beta - Agonist Elisa của hãng Randox (ANH):
ạm vi ng
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4
1.1. Lý thuyết về chất kích thích tăng trưởng họ Beta-agonist ...................... 4
1.1.1. Clenbuterol ........................................................................................ 7
1.1.2. Salbutamol ........................................................................................ 9
1.2. Tình hình nghiên cứu về nhóm Beta-agonist ở nước ngoài và trong nước .. 10
1.2.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài .................................................. 11
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước .................................................. 13
1.3. Thực trạng sử dụng Beta-agonist trong thịt ở trong nước và trên thế
giới ............................................................................................................ 15
1.4. Một số phương pháp được sử dụng để phân tích Beta-agonist ............. 16
1.4.1. Phương pháp ELISA ........................................................................ 17
1.4.2. Phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) ............. 20
1.5. Một số vấn đề cơ bản về thẩm định phương pháp phân tích sàng lọc ... 21
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ....................................................................................................... 23
2.1. Vật liệu nghiên cứu: ........................................................................... 23
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 23
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 23
2.1.3. Thời gian nghiên cứu ....................................................................... 23
2.1.4. Hóa chất và thuốc thử ...................................................................... 23
2.1.5. Thiết bị, dụng cụ.............................................................................. 23
2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 23
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 24
2.3.1. Xác định sự có mặt của Salbutamol trong thịt lợn bằng phương
pháp ELISA .............................................................................................. 26
2.3.2. Xác định sự có mặt của Clenbuterol trong thịt lợn bằng phương
pháp ELISA .............................................................................................. 26
2.3.3. Xác định sự phù hợp của kit ELISA ................................................. 27
2.3.3.1. Độ tuyến tính (Linearity) / Khoảng xác định (Working ranger) ..... 27
2.3.3.2. Độ chọn lọc (Selecsibility) ............................................................ 27
2.3.3.3. Độ nhạy (Sensitivity) .................................................................... 28
2.3.3.4. Giới hạn phát hiện nhỏ nhất LOD ................................................. 28
2.3.3.5. Độ thu hồi (Recovery) .................................................................. 29
2.3.4. Thí nghiệm đảm bảo chất lượng kết quả thử nghiệm của kit ELISA . 30
2.3.5. Khẳng định khả năng phát hiện Beta-agonist của Kit bằng phương
pháp định lượng LC/MS/MS ..................................................................... 30
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 33
3.1. Xác định sự phù hợp của kit ELISA .................................................... 33
3.1.1. Độ tuyến tính (Linearity) / Khoảng xác định (Working ranger) ........ 33
3.1.2. Độ chọn lọc (Selecsibility) ............................................................... 37
3.1.4. Độ nhạy (Sensitivity); Độ thu hồi (Recovery). ................................. 42
3.2. Khẳng định lại khả năng phát hiện Beta-agonist của Kit ELISA bằng
phương pháp Sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS .........................................43 3.3. Ứng dụng sự phù hợp của phương pháp phát hiện Beta-agonist bằng
kit ELISA trên nền mẫu thực tại thị trường. ...............................................45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 50
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................... 51 Đặt vấn đề
Ngày nay khi xã hội phát triển càng cao thì nhu cầu đời sống con người
cũng cao hơn, chất lượng an toàn thực phẩm chiếm một vị trí rất quan trọng. Các
ngành, các cơ quan quản lý Nhà nước cũng đang có những đề án, chương trình
nhằm nâng cao chất lượng quản lý và sử dụng các chất kháng sinh trong các lĩnh
vực cụ thể. Tuy nhiên, việc quản lý và hướng dẫn sử dụng thuốc kháng sinh còn
chưa được đồng bộ và triệt để, tình trạng sử dụng các chất kháng sinh còn khá
tùy tiện. Dẫn đến sự tồn dư các chất kháng sinh, gây nguy hại đến sức khỏe
người tiêu dùng.
Trong lĩnh vực dược phẩm, Beta-agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều
trong điều trị bệnh hen suyễn hay tắc nghẽn phổi mãn tính, hai chất điển hình là
Salbutamol và Clenbuterol.
Nhu cầu của người sử dụng ngày càng cao, càng thúc đẩy sự tăng trưởng
và tăng lượng nạc cho gia súc, gia cầm. Dẫn đến việc sử dụng kích thích tố tăng
trưởng, hormone tăng trọng ngày càng phổ biến từ nhà sản xuất thức ăn chăn
nuôi đến người chăn nuôi. Clenbuterol và Salbutamol được đưa vào trong thức
ăn gia súc nhằm làm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với gia súc,
gia cầm.
Ở Việt Nam, các loại dược liệu thuộc nhóm Beta-agonist trong đó có
Clenbuterol và Salbutamol được xếp vào danh mục "Thuốc, hóa chất, kháng sinh
cấm sử dụng, hạn chế sử dụng của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn"
(Bộ NN và PTNT, 2009). Kiểm soát sự hiện diện của nhóm Beta-agonist trong
thức ăn gia súc, gia cầm vào những năm gần đây đã được Nhà nước quan tâm
chú trọng, tuy nhiên chưa tập trung, triệt để. Việc định lượng chính xác dư lượng
của các Beta-agonist trong thức ăn chăn nuôi là vấn đề cần được quan tâm trong
công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm. Đồng thời, việc xác định tồn dư Beta
agonist trong thịt một số gia súc là rất cần thiết về mặt quản lý để đánh giá tình
hình mức độ sử dụng các chất này trong thức ăn chăn nuôi và đưa ra những thông báo về vệ sinh an toàn thực phấm. Phương pháp Sắc ký lỏng khối phổ (LC
MS/MS) là phương pháp đã và đang được sử dụng để kiểm tra chính xác hàm
lượng nhóm Beta-agonist tồn dư trong thực phẩm. Tuy nhiên với chi phí đầu tư
thiết bị, máy móc cao, đòi hỏi đội ngũ kiểm nghiệm có trình độ chuyên môn; việc
sàng lọc sự hiện diện nhóm Beta-agonist là công đoạn rất cần thiết trước khi tiến
hành kiểm nghiệm sâu.
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa
để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích. ELISA được
sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc
biệt là trong các quy trình sàng lọc, kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm
thực phẩm. Trên thị trường có nhiều loại kit ELISA có khả năng định tính Beta
agonist của các hãng khác nhau như: kit ELISA hãng Biooscientific
(MaxSignalTM Beta-agonist, mã 1009), kit ELISA hãng Tecna (Beta-Agonist
ELISA Kit, mã AA107), kit ELISA hãng Randox (Beta-Agonist ELISA, mã SU-
2148; Clenbuterol ELISA, mã CB-1418). Mỗi loại kit ELISA để phân tích định
tính dư lượng Beta-agonist trong thịt của các hãng khác nhau là khác nhau rất
nhiều về khả năng ứng dụng theo mục đích sử dụng và điều kiện thực tế tại
phòng thử nghiệm ở Việt Nam. Việc đánh giá loại kit ELISA phù hợp cho phân
tích định tính dư lượng Beta-agonist trong thịt lợn phải phù hợp với quy định
trong Quyết định số 2002/657/EC do Ủy ban Châu Âu thiết lập cho phương pháp
bán định lượng và cần được khẳng định bằng phương pháp định lượng Sắc ký
lỏng khối phổ (LC/MS/MS).
Để góp phần giúp cơ quan có thẩm quyền, đặc biệt là Sở Nông nghiệp và
Phát triển nông thôn Hà Nội lựa chọn loại kit ELISA phù hợp cho phân tích định
tính dư lượng Beta-agonist trong thịt lợn, góp phần xây dựng các chiến lược
phòng ngừa chất tồn dư độc hại trong thực phẩm có nguồn gốc động vật, đảm
bảo cung cấp thực phẩm an toàn cho nguời tiêu dùng. Xuất phát từ sự cấp bách
của tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên cứu về Beta
agonist được công bố trong và ngoài nước, chúng tui đã thực hiện đề tài: “Đánh
giá khả năng định tính nhóm Beta-agonist trong thịt bằng kit Beta-agonist ELISA của hãng Randox (Anh)”
Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc quản lý, bảo đảm vệ sinh an toàn
thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.
Mục đích nghiên cứu
Đánh giá sự phù hợp của kit ELISA trong việc sàng lọc định tính Beta
agonist (Clenbuterol và Salbutamol) trong thịt.
Tạo thuận lợi cho các cơ quan quản lý nhà nước trên địa bàn Hà Nội lựa
chọn kit thử nhanh, phù hợp để nâng cao chất lượng quản lý an toàn thực phẩm.
Phạm vi nghiên cứu
Beta-agonist là một nhóm các hợp chất tự nhiên, có nguồn gốc từ các
Catecholamines, hiện có khoảng hơn 20 hợp chất khác nhau. Hiện nay tại Việt
Nam, những chất thường được sử dụng trong chăn nuôi là Clenbuterol,
Sabutamol, Ractopamine, Malbutamol, Zilpatrol, Cimaterol nhưng phổ biến nhất
là Clenbuterol, Sabutamol (Dương Thanh Liêm và cs, 2002). Do vậy trong
nghiên cứu, tác giả tập trung với đối tượng nghiên cứu là Kít ELISA định tính
Clenbuterol và Salbutamol của Hãng Randox (Anh). Hình 1.4. Cấu trúc hóa học nhóm chất Beta-agonist chưa được phân loại
Trong số các chất kích thích tăng trưởng thuộc họ β2 –agonists, có 2 hợp
chất thường được sử dụng để trộn vào thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam là
clenbuterol và salbutamol.
1.1.1. Clenbuterol
Clenbuterol được dùng với tên biệt dược là broncodil, clenburol, ventolax,
protovent; nó thường tồn tại ở dưới dạng Clenbuterol Hydrochloride. Clenbuterol
được chấp nhận sử dụng trong một số quốc gia như một thuốc giãn phế quản cho
bệnh nhân. Nó có thể gây nguy hiểm nếu sử dụng ở hàm lượng nhiều hơn 0,12
mg. Clenbuterol có sự tương đồng về cấu trúc cũng như dược tính đối với
Salbutamol, tuy nhiên ảnh hưởng của nó mạnh hơn và lâu hơn. Nó làm tăng khả
năng điều khí, kích thích hệ thống thần kinh trung ương, huyết áp và vận chuyển
oxy.
Theo Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ, Clenbuterol không
phải là một thành phần của bất kỳ loại thuốc điều trị và bị cấm đối với các vận
động viên (Guest, 2007). Tại Mỹ, đối với bất kỳ động vật sử dụng làm thức ăn
cho người có sử dụng Clenbuterol đều bị cấm bởi FDA (FARAD, 2014).
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Đánh giá khả năng định tính nhóm Beta - Agonist trong thịt bằng Kit Beta - Agonist Elisa của hãng Randox (ANH):
ạm vi ng
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4
1.1. Lý thuyết về chất kích thích tăng trưởng họ Beta-agonist ...................... 4
1.1.1. Clenbuterol ........................................................................................ 7
1.1.2. Salbutamol ........................................................................................ 9
1.2. Tình hình nghiên cứu về nhóm Beta-agonist ở nước ngoài và trong nước .. 10
1.2.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài .................................................. 11
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước .................................................. 13
1.3. Thực trạng sử dụng Beta-agonist trong thịt ở trong nước và trên thế
giới ............................................................................................................ 15
1.4. Một số phương pháp được sử dụng để phân tích Beta-agonist ............. 16
1.4.1. Phương pháp ELISA ........................................................................ 17
1.4.2. Phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) ............. 20
1.5. Một số vấn đề cơ bản về thẩm định phương pháp phân tích sàng lọc ... 21
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ....................................................................................................... 23
2.1. Vật liệu nghiên cứu: ........................................................................... 23
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 23
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 23
2.1.3. Thời gian nghiên cứu ....................................................................... 23
2.1.4. Hóa chất và thuốc thử ...................................................................... 23
2.1.5. Thiết bị, dụng cụ.............................................................................. 23
2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 23
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 24
2.3.1. Xác định sự có mặt của Salbutamol trong thịt lợn bằng phương
pháp ELISA .............................................................................................. 26
2.3.2. Xác định sự có mặt của Clenbuterol trong thịt lợn bằng phương
pháp ELISA .............................................................................................. 26
2.3.3. Xác định sự phù hợp của kit ELISA ................................................. 27
2.3.3.1. Độ tuyến tính (Linearity) / Khoảng xác định (Working ranger) ..... 27
2.3.3.2. Độ chọn lọc (Selecsibility) ............................................................ 27
2.3.3.3. Độ nhạy (Sensitivity) .................................................................... 28
2.3.3.4. Giới hạn phát hiện nhỏ nhất LOD ................................................. 28
2.3.3.5. Độ thu hồi (Recovery) .................................................................. 29
2.3.4. Thí nghiệm đảm bảo chất lượng kết quả thử nghiệm của kit ELISA . 30
2.3.5. Khẳng định khả năng phát hiện Beta-agonist của Kit bằng phương
pháp định lượng LC/MS/MS ..................................................................... 30
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 33
3.1. Xác định sự phù hợp của kit ELISA .................................................... 33
3.1.1. Độ tuyến tính (Linearity) / Khoảng xác định (Working ranger) ........ 33
3.1.2. Độ chọn lọc (Selecsibility) ............................................................... 37
3.1.4. Độ nhạy (Sensitivity); Độ thu hồi (Recovery). ................................. 42
3.2. Khẳng định lại khả năng phát hiện Beta-agonist của Kit ELISA bằng
phương pháp Sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS .........................................43 3.3. Ứng dụng sự phù hợp của phương pháp phát hiện Beta-agonist bằng
kit ELISA trên nền mẫu thực tại thị trường. ...............................................45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 50
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................... 51 Đặt vấn đề
Ngày nay khi xã hội phát triển càng cao thì nhu cầu đời sống con người
cũng cao hơn, chất lượng an toàn thực phẩm chiếm một vị trí rất quan trọng. Các
ngành, các cơ quan quản lý Nhà nước cũng đang có những đề án, chương trình
nhằm nâng cao chất lượng quản lý và sử dụng các chất kháng sinh trong các lĩnh
vực cụ thể. Tuy nhiên, việc quản lý và hướng dẫn sử dụng thuốc kháng sinh còn
chưa được đồng bộ và triệt để, tình trạng sử dụng các chất kháng sinh còn khá
tùy tiện. Dẫn đến sự tồn dư các chất kháng sinh, gây nguy hại đến sức khỏe
người tiêu dùng.
Trong lĩnh vực dược phẩm, Beta-agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều
trong điều trị bệnh hen suyễn hay tắc nghẽn phổi mãn tính, hai chất điển hình là
Salbutamol và Clenbuterol.
Nhu cầu của người sử dụng ngày càng cao, càng thúc đẩy sự tăng trưởng
và tăng lượng nạc cho gia súc, gia cầm. Dẫn đến việc sử dụng kích thích tố tăng
trưởng, hormone tăng trọng ngày càng phổ biến từ nhà sản xuất thức ăn chăn
nuôi đến người chăn nuôi. Clenbuterol và Salbutamol được đưa vào trong thức
ăn gia súc nhằm làm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với gia súc,
gia cầm.
Ở Việt Nam, các loại dược liệu thuộc nhóm Beta-agonist trong đó có
Clenbuterol và Salbutamol được xếp vào danh mục "Thuốc, hóa chất, kháng sinh
cấm sử dụng, hạn chế sử dụng của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn"
(Bộ NN và PTNT, 2009). Kiểm soát sự hiện diện của nhóm Beta-agonist trong
thức ăn gia súc, gia cầm vào những năm gần đây đã được Nhà nước quan tâm
chú trọng, tuy nhiên chưa tập trung, triệt để. Việc định lượng chính xác dư lượng
của các Beta-agonist trong thức ăn chăn nuôi là vấn đề cần được quan tâm trong
công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm. Đồng thời, việc xác định tồn dư Beta
agonist trong thịt một số gia súc là rất cần thiết về mặt quản lý để đánh giá tình
hình mức độ sử dụng các chất này trong thức ăn chăn nuôi và đưa ra những thông báo về vệ sinh an toàn thực phấm. Phương pháp Sắc ký lỏng khối phổ (LC
MS/MS) là phương pháp đã và đang được sử dụng để kiểm tra chính xác hàm
lượng nhóm Beta-agonist tồn dư trong thực phẩm. Tuy nhiên với chi phí đầu tư
thiết bị, máy móc cao, đòi hỏi đội ngũ kiểm nghiệm có trình độ chuyên môn; việc
sàng lọc sự hiện diện nhóm Beta-agonist là công đoạn rất cần thiết trước khi tiến
hành kiểm nghiệm sâu.
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa
để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích. ELISA được
sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc
biệt là trong các quy trình sàng lọc, kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm
thực phẩm. Trên thị trường có nhiều loại kit ELISA có khả năng định tính Beta
agonist của các hãng khác nhau như: kit ELISA hãng Biooscientific
(MaxSignalTM Beta-agonist, mã 1009), kit ELISA hãng Tecna (Beta-Agonist
ELISA Kit, mã AA107), kit ELISA hãng Randox (Beta-Agonist ELISA, mã SU-
2148; Clenbuterol ELISA, mã CB-1418). Mỗi loại kit ELISA để phân tích định
tính dư lượng Beta-agonist trong thịt của các hãng khác nhau là khác nhau rất
nhiều về khả năng ứng dụng theo mục đích sử dụng và điều kiện thực tế tại
phòng thử nghiệm ở Việt Nam. Việc đánh giá loại kit ELISA phù hợp cho phân
tích định tính dư lượng Beta-agonist trong thịt lợn phải phù hợp với quy định
trong Quyết định số 2002/657/EC do Ủy ban Châu Âu thiết lập cho phương pháp
bán định lượng và cần được khẳng định bằng phương pháp định lượng Sắc ký
lỏng khối phổ (LC/MS/MS).
Để góp phần giúp cơ quan có thẩm quyền, đặc biệt là Sở Nông nghiệp và
Phát triển nông thôn Hà Nội lựa chọn loại kit ELISA phù hợp cho phân tích định
tính dư lượng Beta-agonist trong thịt lợn, góp phần xây dựng các chiến lược
phòng ngừa chất tồn dư độc hại trong thực phẩm có nguồn gốc động vật, đảm
bảo cung cấp thực phẩm an toàn cho nguời tiêu dùng. Xuất phát từ sự cấp bách
của tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên cứu về Beta
agonist được công bố trong và ngoài nước, chúng tui đã thực hiện đề tài: “Đánh
giá khả năng định tính nhóm Beta-agonist trong thịt bằng kit Beta-agonist ELISA của hãng Randox (Anh)”
Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc quản lý, bảo đảm vệ sinh an toàn
thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.
Mục đích nghiên cứu
Đánh giá sự phù hợp của kit ELISA trong việc sàng lọc định tính Beta
agonist (Clenbuterol và Salbutamol) trong thịt.
Tạo thuận lợi cho các cơ quan quản lý nhà nước trên địa bàn Hà Nội lựa
chọn kit thử nhanh, phù hợp để nâng cao chất lượng quản lý an toàn thực phẩm.
Phạm vi nghiên cứu
Beta-agonist là một nhóm các hợp chất tự nhiên, có nguồn gốc từ các
Catecholamines, hiện có khoảng hơn 20 hợp chất khác nhau. Hiện nay tại Việt
Nam, những chất thường được sử dụng trong chăn nuôi là Clenbuterol,
Sabutamol, Ractopamine, Malbutamol, Zilpatrol, Cimaterol nhưng phổ biến nhất
là Clenbuterol, Sabutamol (Dương Thanh Liêm và cs, 2002). Do vậy trong
nghiên cứu, tác giả tập trung với đối tượng nghiên cứu là Kít ELISA định tính
Clenbuterol và Salbutamol của Hãng Randox (Anh). Hình 1.4. Cấu trúc hóa học nhóm chất Beta-agonist chưa được phân loại
Trong số các chất kích thích tăng trưởng thuộc họ β2 –agonists, có 2 hợp
chất thường được sử dụng để trộn vào thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam là
clenbuterol và salbutamol.
1.1.1. Clenbuterol
Clenbuterol được dùng với tên biệt dược là broncodil, clenburol, ventolax,
protovent; nó thường tồn tại ở dưới dạng Clenbuterol Hydrochloride. Clenbuterol
được chấp nhận sử dụng trong một số quốc gia như một thuốc giãn phế quản cho
bệnh nhân. Nó có thể gây nguy hiểm nếu sử dụng ở hàm lượng nhiều hơn 0,12
mg. Clenbuterol có sự tương đồng về cấu trúc cũng như dược tính đối với
Salbutamol, tuy nhiên ảnh hưởng của nó mạnh hơn và lâu hơn. Nó làm tăng khả
năng điều khí, kích thích hệ thống thần kinh trung ương, huyết áp và vận chuyển
oxy.
Theo Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ, Clenbuterol không
phải là một thành phần của bất kỳ loại thuốc điều trị và bị cấm đối với các vận
động viên (Guest, 2007). Tại Mỹ, đối với bất kỳ động vật sử dụng làm thức ăn
cho người có sử dụng Clenbuterol đều bị cấm bởi FDA (FARAD, 2014).
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links