Một số kỹ thuật phân lập nấm bệnh đối kháng

ác chất dinh dưỡng, các chất có hoạt tính điều khiển sinh trưởng và sự phát triển của mẫu cấy.
Chất làm đông cứng môi trường: Là giá thể cho mẫu cấy. Thường dùng nhất là Agar agar. Đây là polysaccarit của tảo biển, hoà tan với nước khi ở nhiệt độ lớn hơn 800C thì ở dạng lỏng còn khi nhiệt độ nhỏ hơn 400C lại ở dạng rắn(gel). Agar có khả năng ngậm nước cao, chỉ cần 6-12 g có thể làm đông đặc 1l nước và khi ở trạng thái rắn thì tế bào và mô thực vật vẫn dễ dàng hấp thu được các chất dinh dưỡng từ môi trường.
III. Nguyên tắc, kỹ thuật chung trong nuôi cấy mô tế bào:
Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu khoa học đều thống nhất rằng thành công của nuôi cấy mô tế bào chỉ đạt được khi nó trải qua 5 bước sau:
Bước 0: Bước chuẩn bị
Chọn lọc cây mẹ đạt tiêu chuẩn sau:
Cây mẹ có đặc điểm di truyền, đặc điểm nông, sinh học quý ta cần.
Có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt.
Sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus.
Nếu trong tự nhiên không có những cây đạt tiêu chuẩn trên, phải trồng các cây mẹ trong điều kiện cách ly với nguồn bệnh hay tối ưu về điều kiện chăm sóc, dinh dưỡng, bảo vệ thực vật để có cây mẹ đạt tiêu chuẩn.
Bước 1: Nuôi cấy khởi động
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mẫu nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy thường sử dụng trong phòng thí nghiệm là chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra, tuỳ từng trường hợp từng đối tượng nuôi cấy người ta còn có thể sử dụng các mẫu nuôi cấy như mẩu lá, đài hoa, cánh hoa, mẩu rễ, phôi non.
Cần xác định chế độ khử trùng cho mẫu cấy trước khi tiến hành để đảm bảo mẫu sạch vi sinh vật nhưng tỉ lệ sống cao. Hiện nay sử dụng chủ yếu là phương pháp sát trùng bề mặt bằng chất hoá học, thường là HgCl2 0,1% sát trùng trong 5-10 phút. ít phổ biến hơn là các dung dịch hypoclorit như NaOCl, Ca(OCl)2 5% trong 20-30 phút. Ngoài ra còn dùng H2O2 15%,dung dịch Brom 5-10% nhưng hiệu quả không cao.
Sau khi khử trùng mẫu cấy, ta tiến hành đưa mẫu cấy vào môi trường thích hợp để mẫu cấy tạo thành chồi mầm hay phôi vô tính. Việc lựa chọn môi trường thích hợp là rất khó khăn, cần đặc biệt chú ý đến tỷ lệ, hàm lượng các chất điều khiển sinh trưởng trong môi trường để làm cho mẫu cấy phát sinh được hình thái.
Bước 2: Nhân nhanh mẫu
Toàn bộ quá trình nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng chỉ nhằm mục đích chính là tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất. Chính vì vậy giai đoạn này được coi là giai đoạn đánh giá tính ưu việt hay không ưu việt của phương pháp nuôi cấy mô tế bào.
ở giai đoạn này, môi trường dinh dưỡng nhân tạo để nuôi cấy thường được đưa thêm vào chất điều khiển sinh trưởng, các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết nâm men, dịch thuỷ phân casein...kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng nhằm đạt được hệ số nhân chồi cao nhất mà vẫn đảm bảo sức sống, bản chất di truyền, có thể tạo thành cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn cây giống ở giai đoạn sau . Tuy nhiên, tuỳ từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể đạt được hệ số nhân cao bằng việc kích thích sự hình thành các cụm chồi hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hay thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.
Bước 3: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được một kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường trong bước 2 vào môi trường tạo rễ. Thường sau 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ. ở giai đoạn này, người ta bổ sung vào môi trường các auxin vì auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Tuy nhiên, ở một số loài như chuối hay cây ngái sự hình thành rễ tốt hơn cả đạt được trong môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng.
Bước 4: Thích ứng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quy trình nuôi cấy mô tế bào.
Cây lấy ra ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc.Theo Bhojwani và Razdan(1983), quy trình này sẽ thành công hơn nếu trước khi đưa cây con ra đất ta ươm cây trên cát có độ ẩm 90% từ 10 đến 15 ngày. Trong những khoảng thời gian này, rễ mới đượcc sinh ra và bắt đầu hình thành lá mới. Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường.
Tuy nhiên vẫn còn một số các vấn đề tồn tại trong việc nuôi cấy mô tế bào.Đó là:
Sự bất định di truyền
+ Khi sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống vô tính, có xảy ra hiện tượng biến dị soma: sự sai khác về hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hoá, di truyền của những cây tái sinh nhận được ở ngay giai đoạn invitro hay giai đoạn exvitro.
+ Khắc phục: Chọn mẫu cấy là mô non ít chuyên hoá để dễ điều khiển và phát triển hình thái, giảm lượng chất điều khiển sinh trưởng sử dụng, từ đó giảm được ảnh hưởng của chúng. Đồng thời, phải hạn chế số lần cấy chuyển khi nhân nhanh (5-6 lần), để giảm sự tích luỹ, gia tăng ảnh hưởng của các chát điều khiển sinh trưởng.
Sự nhiễm mẫu cấy
+ Có một số vi sinh vật có khả năng xâm nhập và tồn tại rất sâu trong hệ thống mô dẫn của thực vật. Khi tế bào thực vật bắt đầu phát triển, phân chia, chúng làm nhiễm mẫu vào môi trường sau 2-3 tuần nuôi cấy.
+ Khắc phục: Chọn và nuôi trồng cây mẹ đúng tiêu chuẩn, nếu cây mẹ bị bệnh có thể dùng kháng sinh để khử trùng mẫu
Sự tiết độc tố từ mẫu cấy
+ Sau 1-2 ngày đưa vào môi trường, mẫu cấy tiết ra những chất màu đen, nâu làm hỏng môi trường, chết mẫu. Các chất đó có thể là tanin, polyphenol bị oxy hoá.
+ Khắc phục: Chọn mẫu non để giảm hàm lượng tanin, polyphenol ; gây vết thương cơ giới tối thiểu nhất; xử lý mẫu cấy bằng cách ngâm trong dung dịch axit hữu cơ có tính khử mạnh: axit ascorbic, axit xitric; bổ sung vào môi trường than hoạt tính để hấp phụ các chất nói trên.
Hiện tượng thuỷ tinh hoá mẫu cấy
+ Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng và bình nuôi bị hạn chế về khả năng trao đổi khí thì tế bào và mô thực vật bị mọng nước, trở nên trong suốt, có hình dạng không bình thường
+ Khắc phục: Bổ sung vào môi trường chất gây áp suất cao, chất ức chế tổng hợp etilen, tăng cường độ chiếu sáng và giảm nhiệt độ phòng nuôi .
IV. ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào trong công tác giống cây trồng:
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật có thể phục vụ rất nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong công tác giống cây trồng, nuôi cấy in vitro được ứng dụng để:
Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống.
Duy trì, bảo quản, nhân nhanh các giống và cá thể có ý nghĩa khoa học, có giá trị kinh tế cao.
Làm sạch virus, phục tráng giống bị thoái hoá vì bệnh.
Trong số đó, ứng dụng để nhân nhanh giống vô tính cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro được quan tâm hơn cả. Người ta ước tính có khoảng 300 loại cây có thể được nhân giống bằng phương pháp này. Lợi ích của nó là ở chỗ: có thể tạo ra một quần thể cây con với số lượng lớn mà vẫn giữ nguyên đặc tính cây mẹ, đó cũng là những cây giống khoẻ mạnh, sạch virus, sinh trưởng tốt và cho năng suất cao; có thể phục tráng một quần thể thực vật có nguy cơ diệt vong; có thể trao đổi quốc tế nguồn gen và lưu giữ, bỏ quản dạng cây in vitro. Chính nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, người ta có thể tạo ra được hệ số nhân giống cao, sớm phát huy được hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ chăm sóc và dễ dàng khắc phục được những điều kiện bất lợi. Phương pháp này tỏ ra đặc biệt hiệu quả với những loại cây khó nhân giống bằng con đường hữu tính, các giống quý hiếm có số lượng giống ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh.
ở Việt Nam, từ năm 1975, nhiều phòng nuôi cấy mô trong cả nước đã được thành lập và cho đến nay đã thu được một số kết quả đáng kể. Tại viện Sinh vật-Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia đã hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro một số giống cây trồng có khả năng chống chịu như lúa, thuốc lá, khoai lang, dứa sợi... Tại trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội đã hoàn thiện quy trình nhân giống khoai tây chất lượng cao, bước đầu đi vào sản xuất.Tại các tỉnh phía Nam đã xây dựng được ngân hàng cà phê với 10 dòng khác nhau, hoàn thiện quy trình nhân giống cây cao su . Ngoài ra, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào trong cả nước đã nghiên cứu thành công nhiều quy trình nhân giống cây hoa, cây ăn quả, cây rừng, cây quý hiếm...có giá trị cao.
Tóm lại, nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương trình chọn giống và nhân giống hiện đại, nó góp phần tích cực vào lý luận sinh học cây trồng, vào thực tiễn nông nghiệp, mở ra một hướng đi mới cho nghiên cứu di truyền học, hoá sinh, sinh lý thực vật..., đặc biệt nó đem lại những ứng dụng to lớn trong công tác lai tạo và nhân nhanh giống cây trồng.
V.Kết quả và thảo luận
Thực hiện nuôi cấy mô đối với loại mẫu là cây hoa cúc lấy từ vườn của viện Di truyền nông nghiệp.
- Mẫu cây được cắt bỏ lá và cắt thành những đoạn dài 5-7 cm.
- Rửa mẫu bằng nước rửa bát loãng sau đó rửa lại bằng nước sạch 3 lần.
- Rửa mẫu bằng cồn 70 độ trong 1 phút để sát trùng sơ bộ sau rửa lại bằng nước sạch 3 lần.
- Khử trùng mẫu bằng hydroperoxide trrong 10-15 phút sau đó tráng sạch bằng nước cất.
- Cắt cành thành từng đoạn ngắn, mỗi đoạn có ít nhất một mắt ngủ.
- Cấy mẫu vào môi trường nuôi cấy có nồng độ aucin-cytokinin thích hợp...