Chia sẻ đồ án, luận văn ngành Khoa học Tự nhiên miễn phí
Nội quy chuyên mục: - Hiện nay có khá nhiều trang chia sẻ Tài liệu nhưng mất phí, đó là lý do ket-noi mở ra chuyên mục Tài liệu miễn phí.

- Ai có tài liệu gì hay, hãy đăng lên đây để chia sẻ với mọi người nhé! Bạn chia sẻ hôm nay, ngày mai mọi người sẽ chia sẻ với bạn!
Cách chia sẻ, Upload tài liệu trên ket-noi

- Những bạn nào tích cực chia sẻ tài liệu, sẽ được ưu tiên cung cấp tài liệu khi có yêu cầu.
Nhận download tài liệu miễn phí
By togepi_151
#975286 Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1.Keratin 3
1.2. Keratinase 5
1.3.Một số chủng biểu hiện 8
1.3.1. Chủng chủ E. coli 8
1.3.2. Chủng chủ Bacillus subtilis 10
1.4. Ứng dụng của keratinase 11
1.4.2. Ứng dụng trong công nghiệp 13
1.4.3. Đối với môi trường sinh thái 13
1.4.4.Ứng dụng trong y, dược học 13
1.5. Tình hình nghiên cứu 14
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14
1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 16
Phần II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18
2.1. Nguyên liệu 18
2.2.Phương pháp 20
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn 21
2.2.2.Phản ứng PCR 22
2.2.3. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 23
2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 23
2.2.5. Điện di protein trên gel Polyacrylamide (SDS-PAGE) 24
2.2.6. Thiết kế vector biểu hiện trong E. Coli 25
2.2.7. Biến nạp vào tế bào E.coli 25
2.2.8. Biểu hiện keratinase tái tổ hợp trong E.coli BL21 (DE3) 26
2.2.9. Tổ hợp gen ker bằng phương pháp Megaprimer 27
2.2.10. Thiết kế vector biểu hiện keratinase trong B.subtilis 168M 29
2.2.11. Biến nạp vector mang gen keratinase tái tổ hợp trong B.subtilis 168M 29
2.2.12. Biểu hiện keratinase tái hợp trong B.subtilis 168M 30
2.2.13. Thử hoạt tính keratinase 30
Phần III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
3.1. Kết quả tách ADN tổng số 32
3.2. Nhân gen keratinase bằng PCR 32
3.3. Biểu hiện gen keratinase trong E.coli 34
3.3.1. Tách dòng gen KerE trong vector pJET1.2 để biểu hiện trong E.coli 34
3.3.2. Kết quả phân tích trình tự gen 35
3.3.3. Thiết kế vector biểu hiện trong E.coli 36
3.3.4. Biểu hiện gen Ker trong E.coli BL21 38
3.4. Biểu hiện gen kerB trong tế bào B.subtilis 168M 40
3.4.1 Tái tổ hợp gen KerB bằng phương pháp Megaprimer 40
3.4.2. Tách dòng tổ hợp gen keratinase bằng vector pTZ57RT trong E.coli TOP10F’ 41
3.4.3. Thiết kế vector biểu hiện trong Bacillus subtilis 42
3.4.4 Biểu hiện keratinase trong tế bào Bacillus subtilis 168M 44
3.5. Xác định hoạt tính keratinase tái tổ hợp từ E.coli BL21 và B.subtilis 168M 46
Phần IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49
4.1. Kết luận 49
4.2. Kiến nghị 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
1.4.2. Ứng dụng trong công nghiệp
Công nghệ thuộc da và chất tẩy rửa
Enzyme thủy phân protein đã có mặt ở thành phần chất tẩy rửa từ thời cổ đại. Trong thực tế, khoảng 89% chất tẩy rửa là các protease kiềm. Tuy nhiên luôn cần nghiên cứu để đưa ra các enzyme mới để mở rộng phạm vi chất tẩy rửa có sử dụng enzyme. Keratinase có khả năng liên kết và thủy phân các hợp chất rắn cấu tạo giống như lông vũ. Đây là một đặc tính quan trọng của enzyme làm cho chúng hấp phụ các chất phụ gia có trong các chất tẩy rửa bề mặt cứng, có thể loại bỏ các loại vết bẩn thường gặp trong giặt ủi, chẳng hạn như vòng cổ áo, cổ tay của áo sơ mi.
1.4.3. Đối với môi trường sinh thái
Hiện nay, với sự phát triển của ngành chế biến gia cầm, đã kéo theo một lượng lớn rác thải lông vũ từ các khu giết mổ và trang trại chăn nuôi. Nếu không được xử lý thì lượng rác thải này sẽ gây ra những mùi hôi thối từ khí H2S làm ảnh hưởng đến cuộc sống của con người và môi trường sống. Chúng ta có thể bổ sung các chủng vi khuẩn đã được phân lập tuyển chọn vào các đống rác ủ để các chủng vi khuẩn này phân huỷ các hợp chất khó tiêu huỷ như lông vũ. Đây là ý nghĩa rất quan trọng giúp môi trường được trong sạch và giảm thiểu sự ô nhiễm một cách cần thiết.
1.4.4.Ứng dụng trong y, dược học
Prion là các hạt proteinaceous thường là nguyên nhân gây tử vong cho bệnh nhân mắc thoái hóa thần kinh được gọi là xốp truyền nhiễm encephalopathies (TSE) mà bao gồm bệnh bò điên và bệnh Creutzfeld-Jakob. Shih và cộng sự đã chỉ ra rằng keratinase có khả năng làm giảm prion từ mô não của loài bò xốp não (BSE) do bị nhiễm từ động vật [35].
Các peptide có hoạt tính sinh học từ keratin có chứa trong các vật liệu như len, da, tóc và lông là một trong những thành phần của thực phẩm chức năng có giá rẻ và phong phú từ các nguồn tự nhiên. Các chuỗi axit amin giàu prolin có hoạt tính sinh học được dùng để phòng chống các bệnh cho con người bao gồm: ngăn chặn sự hình thành khối u, kiểm soát tăng huyết áp và bệnh Alzheimer [21].
1.5. Tình hình nghiên cứu
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Keratinase đã được nghiên cứu từ những năm 90, là một dạng protease rất phổ biến trong thế giới vi sinh vật. Vi sinh vật tổng hợp keratinase đã được phân lập từ nhiều vị trí khác nhau, từ đất Nam Cực đến suối nước nóng, ở điều kiện môi trường hiếu khí và kỵ khí. Vì vậy, vi khuẩn tổng hợp keratinase có sự đa dạng rất lớn về đặc tính hóa sinh và lý sinh [53].
Đến nay, các keratinase được nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn, trong đó Bacillus spp. được nghiên cứu nhiều nhất. Nhiều chủng B. licheniformis và B. subtilis được mô tả có khả năng thủy phân keratin [10],[13],[45] những loài khác như B. pumilus và B. cereus cũng có khả năng tổng hợp keratinase [29], [20]. Sinh tổng hợp keratinase cũng được nghiên cứu ở Actinomycetes, chủ yếu là từ chi Streptomyces. Nhóm vi khuẩn này được phân lập từ các vùng đất khác nhau, có khả năng thủy phân một loạt các chất chứa keratin như tóc, len và lông. Gushterova và cộng sự [22] đã phân lập hai chủng xạ khuẩn chịu nhiệt có hoạt tính thủy phân keratin cao là Streptomyces flavis 2BG và Microbispora aerata IMBAS-11A. Các loài chịu nhiệt như Streptomyces gulbarguensis [47], Streptomyces thermoviolaceus [14] và Streptomyces thermonitrificans [38] cũng đã được phân lập từ đất. Ngoài những chủng ưa nhiệt, một số Streptomyces kém bền nhiệt đã được phân lập như Streptomyces pactum DSM 40.530 [52], Streptomyces graminofaciens [48] và Streptomyces albidoflavus K1-02 [43].
Ngoài các chủng thuộc Bacillus spp. và Actinomycetes, một số chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân keratin diễn ra ở nhiệt độ cao, pH và kiềm nhiệt hóa đã được công bố. Fervidobacterium pennavorans [20], Fervidobacterium islandicum [41], Meiothermus ruber H328 [38], Clostridium sporogenes [30] và các chủng Thermoanaerobacter sp. [49] được phân lập từ các môi trường khắc nghiệt như suối nước nóng, lỗ thông hơi nhiệt, và khu vực núi lửa. Một số vi sinh vật hoạt động ở môi trường kiềm như Nesternkonia sp. [21] và Nocardiopsis sp. TOA-1 [39] cũng có khả năng thuỷ phân keratin. Ngoài ra, các loài khác nhau của cùng một chi (chẳng hạn, Bacillus) có thể tạo ra các keratinase khác nhau [53]. Chính vì vậy, khai thác đa dạng vi sinh vật sẽ cung cấp sản phẩm keratinase phù hợp với từng công việc cụ thể.
Hiện nay trên thế giới, các kết quả nghiên cứu về keratinase cho thấy nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau có khả năng thủy phân lông vũ, chẳng hạn các chủng thuộc các nhóm Bacillus, Chryseobacterium, Actinomycetes, Vibrio [34] [36] và nấm [17] [18] [19]. Sử dụng vi sinh vật và keratinase nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm dinh dưỡng từ bột lông vũ đã và đang được quan tâm. Bột lông vũ thủy phân bằng Bacillus licheniformis có bổ sung axit amin làm thức ăn cho gà đã tạo ra sự tăng trưởng của gà tương tự như gà sử dụng nguồn thức ăn ở đậu tương [22]. Sử dụng keratinase thô từ chủng Bacillus licheniformis làm tăng khả năng phân giải nguồn lông vũ thô cũng như là bột lông vũ. Enzyme thủy phân này sẽ làm tăng khả năng tiêu hóa lông vũ tới 82% và có thể thay thế tới 7% protein ăn cho gà [21].
Một số nghiên cứu đã chứng minh được rằng vi sinh vật thủy phân keratin có thể tồn tại trong lông, móng, guốc.... Chính sự xuất hiện của vi sinh vật này đã làm tăng khả năng xử lý chất thải, giảm thiểu gây ô nhiễm môi trường. Đặc biệt keratinase của chủng vi sinh vật là thành phần quan trọng trong công nghệ sinh học liên quan tới nguồn chất thải công nghiệp lông vũ và trong chăn nuôi [24].
Đối với phân bón, keratin sau khi bị thủy phân thành các axit amin, các peptide hòa tan sẽ cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng. Các dạng phân hữu cơ này có thể được bón qua lá với một lượng nhỏ nhưng có tác dụng làm tăng quá trình phát triển của cây, giảm được lượng phân bón hoá học vào đất và có khả năng tăng chất lượng cho sản phẩm. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng đã chỉ ra rằng phun qua lá tăng hiệu quả hơn bón qua gốc từ 8-10 lần.
Ngoài ra, do nhu cầu sử dụng keratinase ngày càng cao nên các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào phân lập gen và biểu hiện keratinase tái tổ hợp. Một số nghiên cứu đã được phân lập và biểu hiện gen keratinase từ vi khuẩn Gram dương (Bacillus sp.) và xạ khuẩn (Nocardiopsis sp.) [3] hay phân lập gen và biểu hiện gen từ P.aeruginosa trong một hệ thống biểu hiện E. coli. [54]. Gần đây nhất, một số nghiên cứu trên thế giới đã tiến hành biểu hiện gen từ vi khuẩn Bacillus licheniformis trong hệ biểu hiện E. coli, B. subtilis và P. pastoris [35].
Như vậy, keratinase đã được sản xuất và bán trên thị trường với nhiều mục đích khác nhau. Sinh tổng hợp keratinase thường được cảm ứng bởi keratin [15] [7] [14] [23]. Do đó, cơ chất keratin (lông gà, bột lông, tóc) thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Hợp chất giàu keratin được tạo từ ngành công nghiệp chăn nuôi, chế biến và thường bị loại bỏ như là chất thải. Vì vậy, nhờ kỹ thuật vi sinh vật học các sản phẩm có giá trị (Keratinase, sinh khối vi sinh vật, bột đạm thủy phân) sẽ được tạo thành từ các nguyên liệu có giá trị thấp [22] [12] [17].
1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Công nghệ sinh học đang được coi là hướng đi phát triển mũi nhọn của đất nước, trong đó có sự chú trọng đầu tư cho công nghệ enzyme, đặc biệt là enzyme tái tổ hợp. Có rất nhiều loại enzyme tái tổ hợp đã được nghiên cứu rộng rãi như protease, lipase, amylase...và được sản xuất với qui mô lớn. Bên cạnh đó, keratinase cũng thu hút được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu, do những ứng dụng loại enzyme này mang lại. Tuy nhiên các nghiên cứu keratinase trong thủy phân lông vũ, cũng như các ứng dụng sử dụng nguồn lông vũ phế thải ở Việt Nam vẫn chưa nhiều. Năm 1993, Văn Thị Hạnh cùng cộng sự [2] đã nghiên cứu tạo đạm hòa tan từ lông vũ phế thải bằng phương pháp thủy phân kiềm. Nguyễn Đình Quyến và cộng sự 2001 [4], đã tiến hành phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin. Nghiên cứu này mới tiến hành đánh giá phân loại chủng vi khuẩn ở mức độ đơn giản về hình thái, chưa có đánh giá phân loại ở mức độ hóa sinh cũng như sinh học phân tử. Mặt khác, ở Việt Nam hiện nay chưa có cơ sở nào nghiên cứu về sản xuất keratinase với qui mô công nghiệp. Do đó để có thể đẩy mạnh hướng nghiên cứu sản xuất keratinase ở quy mô công nghiệp, đầu tiên chúng tui sẽ tiến hành thực hiện nhiệm vụ: “Nghiên cứu sự biểu hiện gen mã hóa keratinase trong tế bào E.coli và Bacillus”. Chúng tui mong muốn sẽ lựa chọn được chủng tái tổ hợp có khả năng sinh keratinase cao, góp phần vào qui trình sản xuất keratinase theo qui mô công nghiêp.



Phần II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu
Chủng vi khuẩn
Chủng Bacillus sp DNd 1.2 phân lập từ lò mổ được xác định có hoạt tính keratinase trong bộ chủng giống Phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen. Các chủng vi khuẩn vật chọn dòng và chủ biểu hiện: E.coli TOP10F’, BL21 (DE3); Bacillus subtilis 168M.

Link Download bản DOC
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link tải, không dùng IDM để tải:

Bấm vào đây để đăng nhập và xem link!
Hình đại diện của thành viên
By daigai
#1036405 Link mới update, mời bạn xem lại bài đầu để tải
Kết nối đề xuất:
Learn Synonym
Advertisement