rainbow_139
New Member
Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối
Dựa vào sự đa dạng về hình thái, Fukuda (1993) và về sau nhiều nhà khoa học khác đã
thống nhất rằng, đậu tương có nguồn gốc từ Mãn Châu (Trung Quốc). Từ Trung Quốc, đậu
tương đã lan truyền đi khắp thế giới. Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản, vào khoảng 200
năm trước công nguyên, đậu tương đã được đưa vào Triều Tiên và sau đó được chuyển sang
Nhật. Đến giữa thế kỷ 17, đậu tương mới được nhà thực vật người Đức Engelbert Caemfer
đưa về Châu Âu và đến năm 1954 mới du nhập vào Mỹ. Một số tài liệu cho rằng cây đậu
tương được đưa vào trồng ở nước ta từ thời vua Hùng, cây đậu tương được trồng trước cây
đậu xanh và cây đậu đen.
1.1.2. Phân loại
Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.) Merr. Theo khóa
phân loại của Hymowitz T., C.A. Newell và căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý
và số lượng nhiễm sắc thể, cây đậu tương thuộc bộ đậu (Fabales), họ đậu (Fabaceae), phân họ
Leguminosae, chi Glycine. Đậu tương trồng có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 40 là loại cây trồng
mang lại giá trị kinh tế cũng như giá trị dinh dưỡng cao.
1.1.3. Vai trò của đậu tương
Cây đậu tương mang lại những giá trị rất toàn diện. Theo thống kê, trên toàn thế giới có
khoảng 1,2 vạn sản phẩm làm từ đậu tương. Các sản phẩm được tiêu thụ trên thị trường gồm
bột đậu nành đóng gói, đậu phụ, sữa đậu nành, sữa chua đậu nành,… Trong công nghiệp, đậu
tương được sử dụng để chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo,
chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương dùng để ép dầu.
Đậu tương là cây có khả năng cố định đạm nên được sử dụng làm cây luân canh cải tạo đất
trong hệ thống nông nghiệp. Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi
hàm lượng nitơ trong thân chiếm 0,05%, trong lá chiếm 0,19%. Ngoài ra đậu tương còn là
nguồn thức ăn tốt cho gia súc, 1kg hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn
nuôi. Các bộ phận của cây đậu tương (thân, lá, rễ, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên
các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc.
1.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen thực vật
1.2.1. Khái quát chung về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh sống trong đất, có khả năng xâm nhiễm
thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết thương của cây chủ. Trong tự nhiên, 3
Agrobacterium tumefaciens chủ yếu tấn công cây hai lá mầm, đặc biệt là nhóm thực vật có hoa.
Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thường, khối u do Agrobacterium tumefaciens sinh
ra phát triển mạnh ngay trong điều kiện thiếu hoocmon sinh trưởng (auxin và cytokinin). Đó là
do Agrobacterium tumefaciens đã chuyển một đoạn T-DNA (transfer DNA) sang tế bào thực
vật và T-DNA điều khiển quá trình sinh tổng hợp các chất đó. Ngoài ra, các khối u cũng sinh
tổng hợp các opine là các axit amin, đặc biệt là các dẫn xuất của đường. Opine được vi khuẩn sử
dụng thay cho nguồn cacbon và nitơ nhờ hoạt động của gen chuyển hóa opine trên plasmid gây khối
u thực vật. Dạng opine được tổng hợp có thể là nopanin, octopin, agrocinopin, mannozapin và
agropin, phụ thuộc vào từng chủng Agrobacterium tumefaciens. Trong đó, octopin và nopalin là hai
dạng opine phổ biến.
1.2.2. Ti-plasmid
Ti-plasmid là một phân tử DNA mạch vòng, kích thước khoảng 200kb, phân tử lượng của
nó sấp xỉ 1,2.108. Trong tế bào thực vật chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập. Ti
plasmid ở các chủng Agrobacterium khác nhau đều có bốn vùng tương đồng: vùng có liên quan
đến sự tái bản, vùng liên quan đến sự tiếp hợp, vùng gây độc hay còn gọi là vùng vir (virulent
region), vùng T-DNA. Quá trình gây tạo khối u có liên quan trực tiếp đến vùng T-DNA và
vùng vir.
Vùng T-DNA
Vùng T-DNA là vùng được chuyển vào tế bào thực vật và gây nên các khối u thực vật. Có
hai hệ gen tồn tại trên T-DNA:
- Hệ gen thứ nhất quy định quá trình sinh tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng thực vật
là auxin và cytokinin. Khi các gen này hoạt động sẽ dẫn đến sự phân chia các tế bào một cách
liên tục gây ra khối u.
- Hệ gen thứ hai quy định lên quá trình sinh tổng hợp các opine. Đây là các axit amin lạ có
nguồn gốc từ arginine và không bao giờ xuất hiện trong tế bào bình thường.
T-DNA được giới hạn bởi hai bờ phải (right border) và bờ trái (left border). Hai bờ có
cấu trúc lặp lại gồm 24 cặp bazơ nitơ chỉ những đoạn DNA nằm giữa hai bờ được chuyển vào
tế bào thực vật. Bờ phải và bờ trái là những yếu tố cần thiết cho sự chuyển DNA. Tuy nhiên,
quá trình chuyển T-DNA lại do vùng gây độc quy định.
Vùng gen vir Vùng vir dài 35kb mang các gen gây độc. Vùng này bao gồm gen virA, virB, virC, virD,
virE, virG (một số chủng còn có virF). Trong đó gen virA, virB, virD, virG cần thiết cho tạo
độc tính. Hoạt động của gen vir giúp T-DNA này tách ra khỏi vi khuẩn, xâm nhập vào tế bào
thực vật.
Sự biểu hiện của các gen vùng vir là một quá trình sinh hoá phức tạp mà các tác nhân đầu
tiên tác động đến nó là hợp chất phenolic. Với những đặc tính này A.tumafaciens được sử dụng
như một vectơ để chuyển gen vào cây.
1.2.3. Quá trình chuyển gen thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens
Chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ
hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, động
vật,...) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hay gắn vào bộ gen tế bào chủ.
Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất
hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen. Các bước chính để tạo một thực vật chuyển gen
gồm có: chọn lọc và phân lập gen, chuyển gen vào tế bào thực vật, nuôi tế bào thực vật mang
gen lạ thành cây hoàn chỉnh.
Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau như sử dụng
súng bắn gen, dùng xung điện tế bào và mô thực vật, dùng vi tiêm, chuyển gen thông qua con
đường ống phấn,… Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A. tumefaciens
là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay. Chuyển gen vào thực vật thông qua
Agrobacterium tumefaciens được xem là phương pháp có nhiều ưu điểm (nhất là đối với cây
hai lá mầm) dựa vào khả năng chuyển gen tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium .
1.2.4. Hệ thống vector chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Các Ti-plasmid chứa các gen tổng hợp hoocmon sinh trưởng thực vật và opine không
cần thiết gây khối u cho cây bị xâm nhiễm nên không được dùng trực tiếp làm vector. Các
enzym giới hạn có thể cắt DNA của plasmid ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi đó công nghệ
gen lại cần có những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzym giới hạn. Ngoài ra,
các gen one được dùng làm chỉ thị chọc lọc có tính trội, nhưng chúng lại làm cản trở quá trình
tái sinh bình thường ở thực vật. Với những lí do này, Ti-plasmid đã được nghiên cứu cải biến
như cắt bỏ các gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng tạo dòng đa năng
MCS (multicloning site- trình tự tạo dòng) tạo hai hệ thống vector chuyển gen hiệu quả: vectơ CHƢƠNG IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
Dựa trên kết quả thu được từ thí nghiệm, chúng tui rút ra những kết luận sau:
1. Đã xây dựng được quy trình tái sinh cây đậu tương giống DT2008 và ĐT26: sử dụng
H2O2 15% trong thời gian 10 phút để khử trùng mẫu, tạo cụm chồi đậu tương trên môi trường
MS-B5 có bổ sung 0,1mg/l IBA, 2 mg/l BAP, kéo dài chồi trên môi trường MS-B5 có bổ sung
0,1mg/l IAA, 0,5 mg/l GA3. Các chồi đậu tương đạt tiêu chuẩn chuyển sang môi trường ra rễ là
môi trường MS-B5 có bổ sung 0,5 mg/l α-NAA.
2. Đã xây dựng được quy trình chuyển gen CP4-EPSPS vào 2 giống đậu tương DT2008
và ĐT26 bằng cách sử dụng chủng C58C1 có OD = 0,8 lây nhiễm trên nốt lá mầm với thời gian
lây nhiễm là 60 phút, sau lây nhiễm đồng nuôi cấy trong 5 ngày. Mẫu đậu tương được khử
khuẩn bằng cefotaxim (250 mg/l) và vancomycin (250 mg/l), sau đó cho tái sinh theo quy trình
như trên để thu được cây chuyển gen.
3. Bằng kĩ thuật PCR đã xác định được 5 mẫu giống DT2008 (trong tổng số 25 mẫu thu
được sau biến nạp) và 4 mẫu đậu tương ĐT26 (trong tổng số 25 mẫu thu được sau biến nạp)
mang gen CP4-EPSPS, với kích thước xấp xỉ 1,5 kB.
Đề nghị
1.Tiếp tục tiến hành các thí nghiệm bổ sung để xác minh sự tồn tại của gen kháng thuốc
trừ cỏ trong các cây chuyển gen, đồng thời thực hiện tự thụ và chọn lọc để thu được các cây
chuyển gen đồng hợp tử làm vật liệu ổn định cho các thí nghiệm lai tạo giống kháng thuốc trừ
cỏ glyphosate tiếp theo.
2. Sau khi thu được vật liệu chuyển gen cần tiếp tục đánh khả năng kháng thuốc trừ cỏ
của cây chuyển gen ngoài đồng ruộng và theo dõi tính ổn định của gen chuyển trong cây đậu
tương đã được chuyển gen CP4-EPSPS.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Dựa vào sự đa dạng về hình thái, Fukuda (1993) và về sau nhiều nhà khoa học khác đã
thống nhất rằng, đậu tương có nguồn gốc từ Mãn Châu (Trung Quốc). Từ Trung Quốc, đậu
tương đã lan truyền đi khắp thế giới. Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản, vào khoảng 200
năm trước công nguyên, đậu tương đã được đưa vào Triều Tiên và sau đó được chuyển sang
Nhật. Đến giữa thế kỷ 17, đậu tương mới được nhà thực vật người Đức Engelbert Caemfer
đưa về Châu Âu và đến năm 1954 mới du nhập vào Mỹ. Một số tài liệu cho rằng cây đậu
tương được đưa vào trồng ở nước ta từ thời vua Hùng, cây đậu tương được trồng trước cây
đậu xanh và cây đậu đen.
1.1.2. Phân loại
Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.) Merr. Theo khóa
phân loại của Hymowitz T., C.A. Newell và căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý
và số lượng nhiễm sắc thể, cây đậu tương thuộc bộ đậu (Fabales), họ đậu (Fabaceae), phân họ
Leguminosae, chi Glycine. Đậu tương trồng có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 40 là loại cây trồng
mang lại giá trị kinh tế cũng như giá trị dinh dưỡng cao.
1.1.3. Vai trò của đậu tương
Cây đậu tương mang lại những giá trị rất toàn diện. Theo thống kê, trên toàn thế giới có
khoảng 1,2 vạn sản phẩm làm từ đậu tương. Các sản phẩm được tiêu thụ trên thị trường gồm
bột đậu nành đóng gói, đậu phụ, sữa đậu nành, sữa chua đậu nành,… Trong công nghiệp, đậu
tương được sử dụng để chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo,
chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương dùng để ép dầu.
Đậu tương là cây có khả năng cố định đạm nên được sử dụng làm cây luân canh cải tạo đất
trong hệ thống nông nghiệp. Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi
hàm lượng nitơ trong thân chiếm 0,05%, trong lá chiếm 0,19%. Ngoài ra đậu tương còn là
nguồn thức ăn tốt cho gia súc, 1kg hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn
nuôi. Các bộ phận của cây đậu tương (thân, lá, rễ, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên
các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc.
1.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen thực vật
1.2.1. Khái quát chung về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh sống trong đất, có khả năng xâm nhiễm
thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết thương của cây chủ. Trong tự nhiên, 3
Agrobacterium tumefaciens chủ yếu tấn công cây hai lá mầm, đặc biệt là nhóm thực vật có hoa.
Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thường, khối u do Agrobacterium tumefaciens sinh
ra phát triển mạnh ngay trong điều kiện thiếu hoocmon sinh trưởng (auxin và cytokinin). Đó là
do Agrobacterium tumefaciens đã chuyển một đoạn T-DNA (transfer DNA) sang tế bào thực
vật và T-DNA điều khiển quá trình sinh tổng hợp các chất đó. Ngoài ra, các khối u cũng sinh
tổng hợp các opine là các axit amin, đặc biệt là các dẫn xuất của đường. Opine được vi khuẩn sử
dụng thay cho nguồn cacbon và nitơ nhờ hoạt động của gen chuyển hóa opine trên plasmid gây khối
u thực vật. Dạng opine được tổng hợp có thể là nopanin, octopin, agrocinopin, mannozapin và
agropin, phụ thuộc vào từng chủng Agrobacterium tumefaciens. Trong đó, octopin và nopalin là hai
dạng opine phổ biến.
1.2.2. Ti-plasmid
Ti-plasmid là một phân tử DNA mạch vòng, kích thước khoảng 200kb, phân tử lượng của
nó sấp xỉ 1,2.108. Trong tế bào thực vật chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập. Ti
plasmid ở các chủng Agrobacterium khác nhau đều có bốn vùng tương đồng: vùng có liên quan
đến sự tái bản, vùng liên quan đến sự tiếp hợp, vùng gây độc hay còn gọi là vùng vir (virulent
region), vùng T-DNA. Quá trình gây tạo khối u có liên quan trực tiếp đến vùng T-DNA và
vùng vir.
Vùng T-DNA
Vùng T-DNA là vùng được chuyển vào tế bào thực vật và gây nên các khối u thực vật. Có
hai hệ gen tồn tại trên T-DNA:
- Hệ gen thứ nhất quy định quá trình sinh tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng thực vật
là auxin và cytokinin. Khi các gen này hoạt động sẽ dẫn đến sự phân chia các tế bào một cách
liên tục gây ra khối u.
- Hệ gen thứ hai quy định lên quá trình sinh tổng hợp các opine. Đây là các axit amin lạ có
nguồn gốc từ arginine và không bao giờ xuất hiện trong tế bào bình thường.
T-DNA được giới hạn bởi hai bờ phải (right border) và bờ trái (left border). Hai bờ có
cấu trúc lặp lại gồm 24 cặp bazơ nitơ chỉ những đoạn DNA nằm giữa hai bờ được chuyển vào
tế bào thực vật. Bờ phải và bờ trái là những yếu tố cần thiết cho sự chuyển DNA. Tuy nhiên,
quá trình chuyển T-DNA lại do vùng gây độc quy định.
Vùng gen vir Vùng vir dài 35kb mang các gen gây độc. Vùng này bao gồm gen virA, virB, virC, virD,
virE, virG (một số chủng còn có virF). Trong đó gen virA, virB, virD, virG cần thiết cho tạo
độc tính. Hoạt động của gen vir giúp T-DNA này tách ra khỏi vi khuẩn, xâm nhập vào tế bào
thực vật.
Sự biểu hiện của các gen vùng vir là một quá trình sinh hoá phức tạp mà các tác nhân đầu
tiên tác động đến nó là hợp chất phenolic. Với những đặc tính này A.tumafaciens được sử dụng
như một vectơ để chuyển gen vào cây.
1.2.3. Quá trình chuyển gen thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens
Chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ
hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, động
vật,...) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hay gắn vào bộ gen tế bào chủ.
Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất
hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen. Các bước chính để tạo một thực vật chuyển gen
gồm có: chọn lọc và phân lập gen, chuyển gen vào tế bào thực vật, nuôi tế bào thực vật mang
gen lạ thành cây hoàn chỉnh.
Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau như sử dụng
súng bắn gen, dùng xung điện tế bào và mô thực vật, dùng vi tiêm, chuyển gen thông qua con
đường ống phấn,… Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A. tumefaciens
là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay. Chuyển gen vào thực vật thông qua
Agrobacterium tumefaciens được xem là phương pháp có nhiều ưu điểm (nhất là đối với cây
hai lá mầm) dựa vào khả năng chuyển gen tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium .
1.2.4. Hệ thống vector chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Các Ti-plasmid chứa các gen tổng hợp hoocmon sinh trưởng thực vật và opine không
cần thiết gây khối u cho cây bị xâm nhiễm nên không được dùng trực tiếp làm vector. Các
enzym giới hạn có thể cắt DNA của plasmid ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi đó công nghệ
gen lại cần có những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzym giới hạn. Ngoài ra,
các gen one được dùng làm chỉ thị chọc lọc có tính trội, nhưng chúng lại làm cản trở quá trình
tái sinh bình thường ở thực vật. Với những lí do này, Ti-plasmid đã được nghiên cứu cải biến
như cắt bỏ các gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng tạo dòng đa năng
MCS (multicloning site- trình tự tạo dòng) tạo hai hệ thống vector chuyển gen hiệu quả: vectơ CHƢƠNG IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
Dựa trên kết quả thu được từ thí nghiệm, chúng tui rút ra những kết luận sau:
1. Đã xây dựng được quy trình tái sinh cây đậu tương giống DT2008 và ĐT26: sử dụng
H2O2 15% trong thời gian 10 phút để khử trùng mẫu, tạo cụm chồi đậu tương trên môi trường
MS-B5 có bổ sung 0,1mg/l IBA, 2 mg/l BAP, kéo dài chồi trên môi trường MS-B5 có bổ sung
0,1mg/l IAA, 0,5 mg/l GA3. Các chồi đậu tương đạt tiêu chuẩn chuyển sang môi trường ra rễ là
môi trường MS-B5 có bổ sung 0,5 mg/l α-NAA.
2. Đã xây dựng được quy trình chuyển gen CP4-EPSPS vào 2 giống đậu tương DT2008
và ĐT26 bằng cách sử dụng chủng C58C1 có OD = 0,8 lây nhiễm trên nốt lá mầm với thời gian
lây nhiễm là 60 phút, sau lây nhiễm đồng nuôi cấy trong 5 ngày. Mẫu đậu tương được khử
khuẩn bằng cefotaxim (250 mg/l) và vancomycin (250 mg/l), sau đó cho tái sinh theo quy trình
như trên để thu được cây chuyển gen.
3. Bằng kĩ thuật PCR đã xác định được 5 mẫu giống DT2008 (trong tổng số 25 mẫu thu
được sau biến nạp) và 4 mẫu đậu tương ĐT26 (trong tổng số 25 mẫu thu được sau biến nạp)
mang gen CP4-EPSPS, với kích thước xấp xỉ 1,5 kB.
Đề nghị
1.Tiếp tục tiến hành các thí nghiệm bổ sung để xác minh sự tồn tại của gen kháng thuốc
trừ cỏ trong các cây chuyển gen, đồng thời thực hiện tự thụ và chọn lọc để thu được các cây
chuyển gen đồng hợp tử làm vật liệu ổn định cho các thí nghiệm lai tạo giống kháng thuốc trừ
cỏ glyphosate tiếp theo.
2. Sau khi thu được vật liệu chuyển gen cần tiếp tục đánh khả năng kháng thuốc trừ cỏ
của cây chuyển gen ngoài đồng ruộng và theo dõi tính ổn định của gen chuyển trong cây đậu
tương đã được chuyển gen CP4-EPSPS.
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links