Chia sẻ đồ án, luận văn ngành Khoa học Tự nhiên miễn phí
Nội quy chuyên mục: - Hiện nay có khá nhiều trang chia sẻ Tài liệu nhưng mất phí, đó là lý do ket-noi mở ra chuyên mục Tài liệu miễn phí.

- Ai có tài liệu gì hay, hãy đăng lên đây để chia sẻ với mọi người nhé! Bạn chia sẻ hôm nay, ngày mai mọi người sẽ chia sẻ với bạn!
Cách chia sẻ, Upload tài liệu trên ket-noi

- Những bạn nào tích cực chia sẻ tài liệu, sẽ được ưu tiên cung cấp tài liệu khi có yêu cầu.
Nhận download tài liệu miễn phí
By tron_hoc
#971358 Link tải luận văn miễn phí cho ae Kết nối

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH ALPHA THALASSEMIA.............................................3
1.1.1. Sơ lược về bệnh thalassemia ...................................................................................3
1.1.2. Cơ chế sinh bệnh.......................................................................................................3
1.1.3. Bệnh alpha thalassemia, đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng ............................5
1.1.4. Cơ sở phân tử bệnh alpha thalassemia ...................................................................8
1.1.4.1. Cấu trúc và tổ chức cụm gen globin ở người .....................................................8
1.1.4.2. Cơ chế phát sinh đột biến .....................................................................................9
1.2. SÀNG LỌC NGƯỜI MANG GEN VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH ALPHA
THALASSEMIA...............................................................................................................13
1.2.1. Chiến lược sàng lọc người mang gen bệnh thalassemia ....................................13
1.2.2. Các phương pháp sàng lọc và chẩn đoán bệnh ...................................................16
1.2.2.1. Phương pháp huyết học ......................................................................................16
1.2.2.2. Phân tích thành phần hemoglobin .....................................................................17
1.2.2.3. Phân tích tỷ lệ tổng hợp chuỗi alpha/beta-globin............................................17
1.2.2.4. Phương pháp sinh học phân tử...........................................................................18
1.3. PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ALPHA
THALASSEMIA...............................................................................................................19
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................22
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .......................................................22
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................22
2.1.2. Hóa chất ...................................................................................................................22
2.1.3. Các cặp mồi .............................................................................................................23
2.1.4. Thiết bị .....................................................................................................................24
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................25
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ....................................................................................................25
2.2.2. Phương pháp xác định nồng độ ADN bằng đo quang phổ ................................27
2.2.3. Kỹ thuật PCR đa mồi .............................................................................................27
2.2.4. Phương pháp điện di...............................................................................................28
2.2.5. Phương pháp tách dòng..........................................................................................28
2.2.5.1. Biến nạp bằng sốc nhiệt......................................................................................29
2.2.5.2. Sàng lọc khuẩn lạc và nuôi tế bào bão hòa ......................................................29
2.2.5.3. Tách plasmid ........................................................................................................30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................................31
3.1. ĐẶC ĐIỂM NHÓM BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU .............................................31
3.2. KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN ĐƠN ..............................................................32
3.2.1. Sàng lọc mất đoạn SEA .........................................................................................33
3.2.2. Sàng lọc hai mất đoạn THAI, FIL ........................................................................34
3.2.3. Sàng lọc mất đoạn -α4.2 và -α3.7 .........................................................................35
3.3. BIẾN NẠP, TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN ĐỘT BIẾN ...............37
3.3.1. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn đột biến SEA.........................................37
3.3.2. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn đột biến α4.2........................................39
3.3.3. Kết quả giải trình tự đoạn đột biến .......................................................................40
3.4. KẾT QUẢ TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG PCR ĐA MỒI...................43
3.4.1. Tối ưu PCR với cặp mồi LIS và α2 ..................................................................43
3.4.2. Tối ưu PCR với 3 cặp mồi LIS, α2 và SEA ........................................................44
3.4.3. Tối ưu PCR với 4 cặp mồi LIS, α2, SEA và α4.2 ..............................................47
3.4.4. Tối ưu PCR với 5 cặp mồi LIS, α2, SEA, α4.2 và α3.7.....................................51
3.5. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN BẰNG PCR ĐA MỒI ............................53
3.6. THẢO LUẬN ............................................................................................................54
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..............................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................62
Tiếng Việt ...........................................................................................................................62
Tiếng Anh...........................................................................................................................62
Phụ lục 1 - Kết quả giải trình tự đoạn đột biến SEA.....................................................69
Phụ lục 2 - Kết quả giải trình tự đoạn đột biến α4.2 .....................................................70
Phụ lục 3 - Kết quả phát hiện đột biến trên 100 mẫu bằng kỹ thuật PCR đa mồi.....71
Phụ lục 4 - Bảng tổng hợp kết quả xét nghiệm cận lâm sàng ......................................74
Phụ lục 5 - Những đột biến điểm gây α-thalassemia ....................................................79
Phụ lục 6 - Những đột biến alpha-thalassemia trong khu vực Đông Nam Á.............80
Hàng năm ước tính khoảng 7,9 triệu trẻ em (chiếm khoảng 6%) trên toàn thế
giới sinh ra với di tật bẩm sinh nghiêm trọng có nguồn gốc di truyền. Theo thống kê
năm 2001 có 5 dị tật bẩm sinh nghiêm trọng có nguồn gốc di truyền phổ biến nhất
là: (1) bệnh tim bẩm sinh (1.040.835 trẻ), (2) dị tật ống thần kinh (323.904 trẻ),
(3) rối loạn hemoglobin gồm thalassemia và bệnh hồng cầu hình liềm (307.897 trẻ),
(4) hội chứng Down (217.293 trẻ), (5) thiếu hụt G6PD (177.032 trẻ). Năm dị tật
bẩm sinh này chiếm 25% trong tổng số 7.000 dị tật bẩm sinh do di truyền.
Trong những năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu về mô hình bệnh
trên trẻ em Việt Nam cho thấy các bệnh ung thư và bệnh di truyền ngày càng
phát hiện nhiều và có xu hướng gia tăng. Đặc biệt nghiêm trọng là bệnh
thalassemia, ước tính khoảng 5,3 triệu người mang gen bệnh, với 2.400 trẻ sinh ra
mang gen bệnh hàng năm. Đây là nguyên nhân gây giảm chất lượng dân số và tăng
gánh nặng chi tiêu ngân sách cho y tế.
Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã xây dựng “Chương trình thalassemia
quốc gia” nhằm hạn chế sự phổ biến của gen bệnh trong cộng đồng và giảm số trẻ
sinh ra mang bệnh. Theo chương trình này, việc sàng lọc trước hôn nhân và sàng lọc
trước sinh với đối tượng nguy cơ cao là bắt buộc. Với đặc trưng dân số theo khu
vực địa lý mà phác đồ sàng lọc ở mỗi quốc gia có thể khác nhau. Trong đó,
xét nghiệm gen sẽ cho biết chính xác những đột biến và kiểu gen bệnh lý. Một trong
những trở ngại lớn nhất là việc xác định đồng thời nhiều đột biến gen rất tốn kém
chi phí và thời gian. Từ năm 2000 đến nay đã có nhiều nghiên cứu công bố về việc
phát hiện đồng thời nhiều mất đoạn lớn trên cụm gen α-globin trong một phản ứng
PCR đa mồi. Tuy nhiên những nghiên cứu này không đề cập đến cách thức tối ưu
hóa phản ứng PCR đa mồi cho vùng giàu trình tự GC như cụm gen α-globin.
Vì vậy chúng tui thực hiện đề tài “Xác định đột biến gen alpha globin gây
bệnh thalassemia bằng kỹ thuật PCR đa mồi” với mục đích tìm hiểu sâu hơn về
nguyên lý kỹ thuật như vấn đề thiết kế nhiều cặp mồi cho một phản ứng, việc tối ưu
phản ứng PCR trên những vùng trình tự giàu GC và trên cơ sở quy trình tối ưu để
đánh giá tỷ lệ đột biến trên đối tượng nghiên cứu. Đề tài nghiên cứu được thực hiện
tại Phòng thí nghiệm Sinh Y thuộc Khoa Sinh học của Trường Đại học Khoa học
Tự nhiên và Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ
Enzym và Protein.
2.2.5.1. Biến nạp bằng sốc nhiệt
Trong nghiên cứu này chúng tui sử dụng phương pháp sốc nhiệt để biến nạp
các vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli JM109. Các tế bào vi khuẩn được xử lý
với CaCl2 có màng trở nên xốp, tạo điều kiện cho ADN plasmid đi qua các lỗ
trên màng khi nhiệt độ thay đổi đột ngột. Quy trình thực hiện gồm các bước
cơ bản sau:
 Lấy tế bào khả biến E. coli JM 109 từ -80oC, để trên đá 5 phút
 Bổ sung 5 µl hỗn hợp của phản ứng nối, búng nhẹ, ủ trên đá 30 phút
 Sốc nhiệt hỗn hợp ở 42oC trong 45 giây, để lại trên đá 3 phút
 Bổ sung 1 ml môi trường LB, ủ 37oC trong 15 phút, lắc 200 vòng/phút ở
37oC trong 1 giờ
 Ly tâm hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, 3000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ
900 µl dịch phía trên
 Chuẩn bị đĩa thạch LB có bổ sung Ampicillin (50 µg/ml), X-gal (40
µg/ml) và 40 µl IPTG 100 mM, đặt đĩa LB trong tủ ấm 370C trong vòng
30 phút
 Hoà tan phần tủa bằng 100 µl dung dịch còn lại và trải trên đĩa thạch LB
đã chuẩn bị ở trên.
2.2.5.2. Sàng lọc khuẩn lạc và nuôi tế bào bão hòa
Mỗi khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch LB bổ sung ampicillin được sàng lọc
nhanh bằng kĩ thuật PCR. Khuẩn lạc cho băng ADN có kích thước phù hợp sẽ được
sàng lọc tiếp bằng cách nuôi bão hòa qua đêm trong môi trường LB bổ sung
ampicillin (50 µg/ml) lắc 200 vòng/phút ở 370C qua đêm, tách plasmid và cắt
kiểm tra với enzyme giới hạn.
2.2.5.3. Tách plasmid
ADN plasmid được tách chiết theo quy trình trong Molecular Cloning – A
Laboratory Manual gồm các bước như sau.
 Ly tâm thu cặn tế bào, 6,000 vòng/phút ở 40C trong 5 phút
 Hòa tan cặn tế bào trong 100 µl dung dịch I (Tris-HCl 25 mM pH 8,
glucose 50 mM, EDTA 10 mM pH 8) có bổ sung RNase 20 µg/ml, ủ 15
phút ở nhiệt độ phòng
 Thêm 200 µl dung dịch II (NaOH 0,2 N, SDS 1%), trộn nhẹ, ủ trên đá
trong 3 phút
 Thêm 150 µl dung dịch III (CH3COOK 3M pH 5,2), trộn nhẹ, ủ trên đá
trong 5 phút
 Ly tâm 13,000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút để thu dịch trong
 Bổ sung 1 thể tích Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 : 1), trộn nhẹ
 Ly tâm 13,000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thu dịch pha
trên
 Bổ sung 0,6 thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
 Ly tâm 13,000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu tủa
 Rửa tủa bằng 500 µl ethanol 70%, ly tâm 13,000 vòng/phút ở 40C trong 5
phút, thu tủa và làm khô tủa
 Hòa tủa trong 30 µl H2O, bảo quản ở -200C.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC ĐIỂM NHÓM BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU
Trong nghiên cứu này, chúng tui sử dụng 100 mẫu bệnh phẩm được
cung cấp bởi Viện Huyết học & Truyền máu Trung ương. Các bệnh phẩm này được
thu thập từ những bệnh nhân đến khám và điều trị tại Trung tâm Thalassemia
trực thuộc Viện. Hầu hết số bệnh nhân nghiên cứu được sàng lọc dựa trên phân tích
công thức máu ngoại vi và phân tích thành phần huyết sắc tố (Phụ lục 4).
Về đặc điểm công thức máu ngoại vi, người Việt Nam số lượng hồng cầu ở
nam và nữ lần lượt trong khoảng 3,87 - 4,91 1012/l và 4,18 - 5,42 1012/l; lượng
hemoglobin trong khoảng 117,5 - 143,9 g/l ở nam và 132,0 - 153,6 g/l ở nữ. Kết
quả phân tích tế bào máu ngoại vi trong Phụ lục 3 có 98/100 bệnh nhân có biểu
hiện thiếu máu, tức là số lượng hồng cầu hoặc/và lượng hemoglobin thấp hơn bình
thường. Phân tích máu ngoại vi có hai ch số quan trọng nhất để chẩn đoán
thalassemia là thể tích hồng cầu trung bình (MCV) và lượng huyết sắc tố trung bình
trong một hồng cầu (MCH). Các trường hợp nghi ngờ thalassemia khi thể tích hồng
cầu nhỏ (MCV < 80 fl) hay hồng cầu nhược sắc (MCH < 27 pg). Theo số liệu trong
Phụ lục 4 có 91/100 bệnh nhân nghi ngờ thalassemia hay ch số MCV < 80 fl
hoặc/và MCH < 27 pg. Cụ thể có 89/100 trường hợp có hồng cầu nhược sắc,
68/100 trường hợp hồng cầu nhỏ MCV < 80 fl và 66/100 trường hợp có hồng cầu
nhỏ, nhược sắc (MCH < 27 pg và MCV < 80 fl).
Đặc điểm về thành phần và tỷ lệ huyết sắc tố có vai trò quan trọng trong
phân loại bệnh thalassemia. Những bệnh nhân thalassemia thường có sự dao động
của một số phân tử huyết sắc tố điển hình và sự xuất hiện các huyết sắc tố
bất thường khác. Đáng chú ý trong đó là tỷ lệ huyết sắc tố HbΑ2. người trưởng
thành, giá trị bình thường của HbA2 trong khoảng 2,0 - 3,2 %, ở những bệnh nhân
β-thalassemia HbΑ2 thường lớn hơn 3,5 % và giảm nhẹ ở những bệnh nhân α-
thalassmia. Tỷ lệ HbA2 < 3,2 % thường được nghi ngờ đến α-thalassemia. Tuy nhiên
tỷ lệ này ch phân biệt được bệnh HbH với tỷ lệ HbA2 luôn nhỏ hơn 2 %.
3.2. KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN ĐƠN
Sử dụng kit tách ADN tổng số ReliaprepTM Blood gDNA MiniPrep System
(Promega), chúng tui thu được ADN từ mẫu máu ngoại vi. Nhằm đảm bảo và
kiểm soát chất lượng nghiên cứu ngay từ giai đoạn đầu, chúng tui tiến hành điện di
ADN tổng số để kiểm tra tính toàn vẹn ADN, đồng thời đo nồng độ và kiểm tra
độ tinh sạch của ADN trên máy quang phổ. Hầu hết lượng ADN thu được đều
đảm bảo chất lượng cho nghiên cứu phát hiện đột biến di truyền bằng kỹ thuật
PCR. Sau đó, chúng tui tiến hành pha loãng ADN tổng số về cùng một nồng độ là
50 ng/µl. Kết quả điện di ADN tổng số được trình bày trên Hình 8.
Hình 8. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 1%. Giếng 1 đến 6 và giếng
97 đến 100: các mẫu ADN tổng số của bệnh nhân. M thang chuẩn ADN-SY 4,6 kb.
Trong nghiên cứu này ngoài các cặp mồi phát hiện đột biến, chúng tui còn
thiết kế thêm cặp mồi LIS và α2. Cặp mồi LIS được thiết kế trên nhiễm sắc thể số
17 khuếch đại đoạn sản phẩm có kích thước 2504 bp. Đây là cặp mồi nội kiểm cho
phản ứng để kiểm tra chất lượng ADN tách chiết, kiểm tra thao tác và thành phần
trong phản ứng PCR. Cặp mồi α2 khuếch đại vùng trình tự chứa gen α2 có kích thước
1836 bp. Cả 5 mất đoạn chúng tui sàng lọc đều chứa gen α2. Do đó việc sử dụng
cặp mồi α2 giúp phân biệt trạng thái đồng hợp hay dị hợp tử của đột biến.
Thành phần và điều kiện tối ưu của từng cặp mồi đã được trình bày trong Bảng 2.
4,1 kb
4,6 kb
3,6 kb
Link Download bản DOC
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link tải, không dùng IDM để tải:

Bấm vào đây để đăng nhập và xem link!
Kết nối đề xuất:
Learn Synonym
Advertisement