rosewillow27
New Member
Link tải miễn phí Luận văn: Sử dụng một số hệ IZOZYM để nghiên cứu đa dạng di truyền ở một số loài cây dược liệu bản địa ở Việt Nam : Đề tài NCKH. QT.04.15
Nhà xuất bản: ĐHKHTN
Ngày: 2005
Chủ đề: Cây bản địa
Di truyền
Dược liệu
Miêu tả: 33 tr.
Nghiên cứu tổng quan về hình thái học, tế bào học, phân bố, thành phần hóa học, tác dụng dược lý của hai loài cây thuốc diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) và diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria) ở Việt Nam. Sử dụng kỹ thuật phân tích izozym SOD, EST và PO để đánh giá mức độ đa dạng, khoảng cách di truyền và phân loại nhanh 2 loài cây thuốc trên. Góp phần xác định đa hình di truyền, dấu chuẩn di truyền phân loại loài và mối quan hệ di truyền giữa một số loài cây dược liệu bản địa ở Việt Nam
Góp phần xác định đa hình di truyền, dấu chuẩn di truyền phân loại loài và mối quan hệ di truyền giữa một số loài cây dược liệu bản địa ở Việt Nam
2 bài báo khoa học
Có thể sử dụng kỹ thuật phân tích izozym SOD, EST và PO để đánh giá mức độ đa dạng, khoảng cách di truyền và phân loại nhanh 2 loài Phyllanthus amarus và Phyllanthus urinaria ngay từ khi cây còn nhỏ
Phát hiện quần thể Phyllanthus urinaria L. Nội Bài, Sóc Sơn có phổ izozym SOD mang 3 băng đặc trưng của loài Phyllanthus amarus
Đào tạo 1 cử nhân sinh học
SUMMARY
a) The title of subject: Using some isoenzyme systems to assess the
genetic diversity of some Vietnamese native medicinal plants.
b) Numberical code: QT- 04-15
c) The grant holder: M.Sc. Hoang Thi Hoa
d) The Participants: Dr. Dinh Doan Long
M.Sc. Pham Thanh Huyen
Tech.. Tran Thi Nhuan
e) Objectives and contents:
* Objectives: The two native medicinal plant species Phyllanthus
amarus Schum. Et. Thonn. and Phyllanthus urinaria L. are colecting
from different areas in the north of Vietnam.
* Contents: In Vietnam, Phyllanthus amarus Schum. Et. Thonn. and
Phyllanthus urinaria L. are the two most well-known medicinal plants
among the species belonging to the genus Phyllanthus, family Euphobiaceae.
These medicinal plants have been used for centuries in the traditional
medicine for treatment of sore throat, furunculosis, eczema, hematometra,
hepatitis, ophtalmia, arthralgia, snake-bite.
Recently, numerous pharmaceutical products derived from these two plant
species, e.g. Livbilnic (Traphaco Co. Ltd), VG-5 (Central pharmaceutical
company N05), Hepaphyl (Central pharmaceutical company 25), Hepamarin,
Livsin-94 (Haphaco) etc. have been commercialized and widely used in
clinical treatment of liver ailments, including the hepatitis B infection.
In order to assess the genetic diversity of these medicinal plants and to
establish a method for rapid identification of these two plant species, we
performed the analysis of some isozyme markers: Izozym Superoxide
2dismutaza (SOD), Izozym Esteraza (EST), Izozym Peroxidaza (PO). The
study revealed that the SOD, EST, PO isozymes profile of the two species are
obviously distinct. All collected samples of p. amarus accessions were
specified by electrophoretic markers of SOD isozyme at Rfs that are equal to
0.63; 0.71 and 0.75; EST isozyme at Rfs are 0,09; 0,42; PO isozyme at Rfs
are 0,85; 0,87 .Whereas, these markers were absent from most of p. urinaria
samples, except for some seemingly interspecific forms.
g) The obtained results:
In conclusion, our study indicated that the analysis of SOD, EST, PO
isozyme markers might be used as a simple and cost-effective technique for
assessment of genetic polymorphism and rapid distinction of the two
medicinal plant species - Phyllanthus amarus Schum. Et. Thonn. and
Phyllanthus urinaria L.
XÁC NHẬN CỦA BAN CHỦ NHIỆM KHOA CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI
PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa ThS. Hoàng Thị Hoà
XÁC NHẬN CỦA TRƯỜNG
PHÓ HiỆb IRƯÓNB
PŨS.Ts.dí)ù.L ^ỈẰuiL^Ối.
3
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiMỤC LỤC
Mở đầu......................................................................................................... 5
Nội dung chính của đề tài.......................................................................... 7
TThương 1. Tổng quan tài liệu................................................................. 7
1. Các nghiên cứu về Phyllanthus L.......................................................... 7
1.1. Phân loại học thực vật và tên gọi....................................................... 7
1.2. Hình thái học, tế bào học và phân b ố ................................................ 7
1.3. Phân bố và sinh thái ............................................................................ 8
1.4. Sử dụng Phylỉanthus L. trong y học cổ truyền................................... 9
1.5/Thành phẩn hoá học của Phyllanthus L.............................. ............ 9
1.6. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Phyllanthus L................. 9
1.7. Các dược phẩm được bào chế từ p. amarus và p. urinaria............... 10
2. Đại cương về izozym......................................... ............................... 11
2.1. Izozym Superoxide dismutaza (SOD. E.c.1.15.1.1)..................... 13
2.2. Izozym Esteraza (EST. E.C.3.1.1.2) ................................................ 14
2.3. Izozym Peroxidaza (PO. E.c. 1.1.1.17)........................................... 14
Chương 2. Vật liệu và phương pháp.......................................................... 16
2.1. Vật liệu thực vật.................................................................................. 16
2.2. Phương pháp phân tích đa hình izozym........................................... 18
2.2.1. Phương pháp thu m ẫu .................................................................. 18
2.2.2. Phương pháp nghiền m ẫu ............................................................ 19
2.2.3. Phương pháp điện d i ...................................................................... 19
2.2.4. Phương pháp phân tích kết quả nghiên cứ u .................................. 19
Chương 3. Kết quả và thảo luận.............................................................. 21
3.1. Phổ điện di hệ izozym SOD củ a .................................................... 21
3.2. Phổ điện di hệ izozym EST.............................................................. 25
3.3. Phổ điện di hệ izozym P O ............................................................... 27
3.4. Quan hệ di truyền giữa các quần th ể ..................... ......................... 31
Kết L uận.................................................................................................... 32
Tài liệu tham khảo.................................................................................... 33
4MỞ ĐẨU
Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et. Thonn.) và diộp hạ
châu (Phyllanthus urinaria L.) ià hai loài cây thuốc thuộc chi Phyllanthus, họ
Ẽuphorbiaceae, phân bố tương đối rộng rãi ở Việt Nam. Hai loài cây thuốc
này đã được sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền ở nước ta cũng như ở
nhiều nước khác thuộc vùng Đông và Nam Á như An độ, Malaysia, Thái
Lan, Campuchia, Lào, Trung quốc, Inđônêsia ... Tuy vậy, cho đến nay việc
sản xuất các dược phẩm từ hai loài p. amarus và p. urinaria L. chủ yếu dựa
trên các dược liệu thu hái tự nhiên, trong đó phần lớn là các dạng mọc hoang
dại, bộc lộ một số nhược điểm sau:
- Viêc thu hái không có quy hoạch dẫn đến nguy cơ mất đi các nguồn
tài nguyên di truyền,
- Việc thu hái từ các dạng hoang dại không đáp ứng được yêu cầu của
công nghiệp dược do nguồn dược liệu ban đầu thường không ổn định và
không kiểm soát được về mặt hóa học, hoạt tính sinh học.
- Dược liệu thu thập hoang dại có nguy cơ nhiễm với các dạng vi sinh
vật (nấm, vi khuẩn, virút ...), vì vậy có thể mang theo các nguồn chất độc
ngoài ý muốn.
- Các dạng nguyên liệu hoang dại có nguy cơ nhiễm độc với các nguồn
hóa chất độc khác nhau, như chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu, các chất thải công
nghiệp ... nếu cây được thu hái từ các vùng bị ô nhiễm và thực tế tình hình
này rất khổ kiểm soát.
Hình 1. Cây Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus L. (A) và
Diệp hạ châu Phyllanthus urinaria L. (B) được dùng trong nghiên cứu
5
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiNgoài ra, trong thực tế p. amarus và p. urinaria L. là hai loài cây thuốc
có đặc điểm hình thái rất giống nhau (xem Hình la,b) và giống với một số
loài Phyllanthus khác hiện đang có ở Việt nam, như p. niruri, p. reticulaĩus
... vốn ít được quan tâm hơn vì mục đích chế biến dược liệu. Việc phân loại
chính xác các loài phyllanthus hiện nay chỉ có thể thực hiện nhờ các chuyên
gia phân loại thực vật sau khi cây đã phát triển đến giai đoạn trưởng thành.
Trước thực tế như vậy, việc thu thập dược liệu tự phát từ người dân đứng
trước nhiều nguy cơ nhầm lẫn và khó có thể đảm bảo chất lượng của nguồn
dược liệu sử dụng cho sản xuất dược phẩm ở quy mô công nghiệp.
Trong hoàn cảnh đó, báo cáo đề tài này của chúng tui nhằm góp phần
cung cấp một công cụ phục vụ cho việc phân loại nhanh hai loài cây dược
liệu dẻ nhầm lẫn này. Ngoài ra, kỹ thuật này còn cho phép đánh giá mức độ
đa hình di truyền của các quần thể mẫu được thu thập từ một số địa phương
khác nhau ở miền Bắc nước ta, là dẫn liệu cơ bản cho việc chọn lọc nguồn
nguyên liệu phục vụ công tác chọn, tạo giống các loài cây thuốc này ở Việt
Nam trong tương lai.
Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam cho thấy khả năng ứng dụng các
chỉ thị phân tử (molecular fingerprintings) trong việc phân loại và định danh
nhanh các loài thảo dược ở nước ta, vốn từ trước đến nay chỉ được thực hiện
chủ yếu dựa vào các chỉ thị hình thái (là chỉ thị dễ gây nhầm lẫn trong nhiều
trường hợp) và trong một số ít trường hợp là chỉ thị hóa học.
6NỘI DUNG CHÍNH CỦA ĐỂ TÀI
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 CÁC NGHIÊN CỨU VỂ PHYLLANTHUS L.
1.1.1. Phân loại học thực vật và tên gọi
Chi Phyllanthus là một trong những chi lớn nhất của họ Thầu dầu
(Euphorbiaceae), thuộc bộ Euphorbiales, phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp
Hai lá mầm (Dicotyledons). Chi này gồm 11 phân chi: Isocladus, Kirganelia,
Cicca, Emblica, Phyllanthus, Conami, Gomphidium, Phyllanthodendron,
Xylophylỉa, Botryanthus, Eriococcus (ưnander et al., 1990) và có khoảng gần
700 loài. p. amarus và p. urinaria cùng thuộc phân chi Phyllanthus nhưng p.
amarus thuộc nhánh Phyllanthus còn p. urinaria thuộc nhánh Urinaria; trong
phân chi Phyllanthus còn có 2 nhánh khác là Lysiandra và Pentandra [25].
Trong chi Phyllanthus, nhiều loài cây trong đó có p. amarus và p.
urinaria được sử dụng làm thuốc trong y học dân tộc ở nước ta và một số nước
nhiệt đới khác trên thế giới như Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Brazil, Peru,
Tanzania,... từ cách đây hàng nghìn năm. Nhưng, phải đến năm 1738 chúng
mới được Linné mô tả và đặt tên (tại Barbados). Mặc dù vậy, những tài liệu cổ
cho thấy từ lâu những loài cây này đã từng được ghi nhận và mô tả [25].
Về tên gọi, do được sử dụng rộng rãi trong nền y học dân tộc của nhiều
quốc gia từ hàng nghìn năm, nên hai loài p. amarus và p. urinaria được gọi bằng
rất nhiều tên địa phương khác nhau, như: herbe du chagrin, petit tamarin rouge,
surette (Pháp), Chanca piedra (Peru), quebra-pedra, arranca-pedras, erva
pombinha (Braxin), pemilla del pasto (Puerto Rico), Holy Friday (Colombia),
gale of wind (Florida và Caribe thuộc Anh), Hurricane weed (Bahamas), Creole
quinine, arrebentapedra, Paraparaimè (Paraguay), Santa Maria, San Pedro, herb of
San Pablo, sampasampalkan (Philippines), zhen chu cao, ye xia zhu, Hsieh-hsia
Chu (Trung Quốc), Komikansou (Nhật Bản), Pitirishi, Budhatri (An Độ),... Đôi
khi, tại một số địa phương, các tên thường được dùng lẫn lộn để gọi tên cả hai
loài hay một số loài khác thuộc chi Phyllanthus [25].
ỏ Việt Nam, các cây thuốc p. amarus và p. urinaria cũng được gọi tên
bằng những tên địa phương khác nhau, chẳng hạn như chó đẻ răng cưa, cam
kiềm, vườn kiềm, diệp hạ châu, diệp hoè thái, lão nha châu, trân châu thảo, rút
đất, khao ham... Và cũng giống như ở một số nước, ở nước ta các tên địa phương
đôi khi cũng được dùng lẫn lộn cho cả hai loài. Nhưng phổ biến nhất p. amarus
được gọi là diệp hạ châu đắng hay chó đẻ chân chim, chó đẻ thân xanh, phân biệt
với P. urinaria được gọi là diệp hạ châu hay chó đẻ răng cưa [1],
1.1.2. Hình thái học, tê bào học
Các đặc điểm hình thái cơ bản của p. amarus và p. urinaria có thể mô
tả như sau: là những cây thân thảo, sống một năm hay nhiều năm, cao
trung bình 20-30cm, đôi khi có thể cao đến 60-70cm; Thân nhẵn, tròn; lá
7
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phimọc so le, hình bầu dục, xếp sít nhau thành hai dãy, mỗi cành như một lá
kép hình lồng chim, mặt trên xanh lục nhạt, mặt dưới màu xanh mốc;
phiến lá thuôn, dài 5-15mm, rộng 3-6mm, đầu nhọn hay hơi tù, mép
nguyên; gân - phụ mảnh, có 4-6 cặp; không có cuống lá hay cuống lá rất
ngắn. Hoa mọc ở nách lá, nhỏ, có cuống ngắn, đơn tính cùng gốc; hoa đực
b đầu cành, hoa cái ở cuối cành, tiểu nhụy 3, chỉ nhị dính nhau; Quả nang,
hình cầu đường kính khoảng 2mm, mọc rủ xuống ở dưới lá nên được gọi là
diêp hạ châu (nghĩa là hạt dưới lá); mỗi quả có 6 hạt hình tam giác, màu nâu
nhạt, có vân ngang. Cây thường ra hoa từ tháng 4 đến tháng 6 và ra quả từ
tháng 7 đến tháng 9 [1,7].
Ngoài những đặc điểm chung trên, hai loài p. amarus và p. urinaria
cũng có một số điểm khác biệt về hình thái như: p. amarus thường mọc
thẳng, thân mầu xanh, ít chia nhánh trong khi p. urinaria lại thường phân
nhánh, thân có mầu xanh xẫm hay tím; cây p. amarus thường có quả nhẫn,
không gai còn quả của cây p. urinaria thường có gai; hoa của p. amarus có 5
lá đài, còn hoa của p. urinaria có 6 lá đài (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng
Hộ, 1999). Tuy vậy, các đặc điểm phân biệt này thường chỉ rõ rệt khi cây đã
đạt đến giai đoạn trưởng thành (ra hoa, kết quả) và được phân loại bởi những
nhà phân loại học có kinh nghiêm. Trong thực tế quá trình thu thập và chế
biến dược liệu hiện nay, những khó khăn trong phân loại như vậy rất dễ dẫn
đến việc thu thập nhầm lẫn giữa hai loài này [2,5].
Cho đến nay có rất ít những nghiên cứu về tế bào học của Phyllanthus
amarus và p. urinaria. Nghiên cứu của Bancilhon và cộng sự (1971) cho
thấy bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội của p. amarus là 2n= 26 hay 2n= 52;
Nghiên cứu của Rossignol và cộng sự (1987) lại cho thấy bộ nhiễm sắc thể
lưỡng bội của p. urinaria là 2n= 50. Một dẫn liệu khác cho rằng bộ nhiễm
sắc thể lưỡng bội của p. amarus cũng là 2n=26, còn của p. urinaria là
2n=14, 2n= 52, hay 2n= 50 tuỳ theo thứ (Phạm Hoàng Hộ, 1999). Như vậy,
có thể nói, đến nay chưa có nghiên cứu hoàn chỉnh về số lượng và đặc điểm
bộ nhiễm sắc thể cơ bản của các loài Phyllanthus [5,11,17],
1.1.3. Phân bố và sinh thái
Ở Việt Nam, chi Phyllanthus L. có khoảng 40 loài. Trong đó có hai
loài là Phyllanthus amarus và Phylỉanthus urinaria L. có hình dáng gần
giống nhau, mọc rải rác ở khắp mọi nơi trừ vùng cao lạnh. Trên thế giới, các
loài này cũng được phân bố rộng rãi ở Campuchia, Lào, Malaysia, Thái lan,
Trung quốc, Ấn độ, Brazil, Florida và Texas (Mỹ). Phylỉanthus L. là cây ưa
ẩm và ưa sáng hay có thể hơi chịu bóng, thường mọc lẫn trong các bãi cỏ, ở
ruộng cao ( đất trổng màu), nương rẫy, vườn nhà và đôi khi ở vùng đồi. Cây
con mọc từ hạt vào cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh trong mùa hè và tàn lụi
vào mua thu. Do khả năng ra hoa kết quả, nhiều hạt giống phát tán gần nên
cây mọc thành đám dày đặc, đôi khi lấn át cả cỏ dại và cây trồng khác [1],
81.1.4. Sử dụng Phyllanthus L. trong y học cổ truyền
Các tác dụng điều tri được biết đến rộng rãi của hai loài Phyllanthus
amarus và Phyllanthus urinaria bao gồm điều trị một số rối loạn đường tiêu
hóa (đặc biột là các bệnh lý về gan), bệnh tiểu đường, một số bệnh về thận,
đường tiết niệu, (Calixto et al., 1998). Gần đây, một số nghiên cứu lâm sàng
và dược lý đã chứng minh dịch chiết và thành phần của hai loài cây thuốc này
có tác dụng ức chế quá trình sao chép của virút viêm gan B và nhiều
retrovirút khác (trong đó có HIV) nhờ tác dụng ức chế hoạt động của enzym
sao chép ngược reverse transcriptaza [13,21,22].
Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cho thấy các dịch chiết Phyllanthus
có hoạt tính ức chế ACE (angiotensin-converting enzym) liên quan đến một
số biến chứng của bệnh tiểu đường [24,25]
1.1.5. Thành phần hoá học của Phyllanthus L.
Các chất hoá học của cây Phylanthus L. tìm thấy ở lá, thân và rễ gồm
một số chất chính như:
Lignan : phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin.
Flavonoid : phyllanthin flavonoid FG-1, phyllanthin flavonoid FG-2.
Tannin : repandusinic acid, geraniin.
Ngoài ra còn một số thành phần hoá học như: glycoside, alkaloid,
elligitannin, phenylpropanoid, lipid, sterol, flavonol,...[12]
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ các kết nghiên cứu trên, chúng tui rút ra một số kết luận sau:
1. Có thể sử dụng kỹ thuật phân tích hệ izozym SOD, EST và PO để góp phần
phân loại hai loài cây thuốc Phyllanthus amarus Schum. et. Thonn.và
Phyllanthus urinaria L. ngay từ khi cây còn nhỏ (đặc biệt là hệ izozym
SOD).
2. Các băng điện di phổ izozym SOD đặc trưng riêng của các quần thể loài p.
amarus trong nghiên cứu này có Rf= 0,63; Rf= 0,71 và Rf= 0,75.
3. Các băng điện di phổ izozym EST đặc trưng riêng của các quần thể loài p.
amarus có Rf=0,09 và Rf=0,42.
ằ. Các băng điện di phổ izozym PO đặc trưng riêng của các quần thể loài p.
amarus có Rf= 0,85 và Rf= 0,87.
jC Phát hiện quần thể p.urinaria Nội Bài ,Sóc Sơn (UNB) có phổ điện di
izozym SOD, EST mang các băng đặc trưng của loài p. amarus. Có thể đây
là con lai giữa 2 loài p. amarus và p. urinaria.
ế. Có thể sử dụng các hệ izozym SOD, EST và PO để đánh giá mức độ đa
dạng và khoảng cách di truyền giữa 2 loài p. amarus và p. urinaria thu thập
ở miền Bắc Việt Nam, trong đó hệ izozym SOD cho độ đa dạng hơn.
ĐỀ NGHỊ
1. Tiếp rục nghiên cứu, hoàn thiện các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên
cứu đa dạng di truyền các loài Phyllanthus spp. và các đối tượng khác, nhằm
góp phần vào việc phân loại và kiểm định dược liệu.
2. Có những nghiên cứu sâu hơn vể quần thể Phyllanthus urinaria L. Nội
Bài, Sóc Sơn để khẳng định xem đây có đúng là con lai giữa 2 loài hay
không?
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Nhà xuất bản: ĐHKHTN
Ngày: 2005
Chủ đề: Cây bản địa
Di truyền
Dược liệu
Miêu tả: 33 tr.
Nghiên cứu tổng quan về hình thái học, tế bào học, phân bố, thành phần hóa học, tác dụng dược lý của hai loài cây thuốc diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) và diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria) ở Việt Nam. Sử dụng kỹ thuật phân tích izozym SOD, EST và PO để đánh giá mức độ đa dạng, khoảng cách di truyền và phân loại nhanh 2 loài cây thuốc trên. Góp phần xác định đa hình di truyền, dấu chuẩn di truyền phân loại loài và mối quan hệ di truyền giữa một số loài cây dược liệu bản địa ở Việt Nam
Góp phần xác định đa hình di truyền, dấu chuẩn di truyền phân loại loài và mối quan hệ di truyền giữa một số loài cây dược liệu bản địa ở Việt Nam
2 bài báo khoa học
Có thể sử dụng kỹ thuật phân tích izozym SOD, EST và PO để đánh giá mức độ đa dạng, khoảng cách di truyền và phân loại nhanh 2 loài Phyllanthus amarus và Phyllanthus urinaria ngay từ khi cây còn nhỏ
Phát hiện quần thể Phyllanthus urinaria L. Nội Bài, Sóc Sơn có phổ izozym SOD mang 3 băng đặc trưng của loài Phyllanthus amarus
Đào tạo 1 cử nhân sinh học
SUMMARY
a) The title of subject: Using some isoenzyme systems to assess the
genetic diversity of some Vietnamese native medicinal plants.
b) Numberical code: QT- 04-15
c) The grant holder: M.Sc. Hoang Thi Hoa
d) The Participants: Dr. Dinh Doan Long
M.Sc. Pham Thanh Huyen
Tech.. Tran Thi Nhuan
e) Objectives and contents:
* Objectives: The two native medicinal plant species Phyllanthus
amarus Schum. Et. Thonn. and Phyllanthus urinaria L. are colecting
from different areas in the north of Vietnam.
* Contents: In Vietnam, Phyllanthus amarus Schum. Et. Thonn. and
Phyllanthus urinaria L. are the two most well-known medicinal plants
among the species belonging to the genus Phyllanthus, family Euphobiaceae.
These medicinal plants have been used for centuries in the traditional
medicine for treatment of sore throat, furunculosis, eczema, hematometra,
hepatitis, ophtalmia, arthralgia, snake-bite.
Recently, numerous pharmaceutical products derived from these two plant
species, e.g. Livbilnic (Traphaco Co. Ltd), VG-5 (Central pharmaceutical
company N05), Hepaphyl (Central pharmaceutical company 25), Hepamarin,
Livsin-94 (Haphaco) etc. have been commercialized and widely used in
clinical treatment of liver ailments, including the hepatitis B infection.
In order to assess the genetic diversity of these medicinal plants and to
establish a method for rapid identification of these two plant species, we
performed the analysis of some isozyme markers: Izozym Superoxide
2dismutaza (SOD), Izozym Esteraza (EST), Izozym Peroxidaza (PO). The
study revealed that the SOD, EST, PO isozymes profile of the two species are
obviously distinct. All collected samples of p. amarus accessions were
specified by electrophoretic markers of SOD isozyme at Rfs that are equal to
0.63; 0.71 and 0.75; EST isozyme at Rfs are 0,09; 0,42; PO isozyme at Rfs
are 0,85; 0,87 .Whereas, these markers were absent from most of p. urinaria
samples, except for some seemingly interspecific forms.
g) The obtained results:
In conclusion, our study indicated that the analysis of SOD, EST, PO
isozyme markers might be used as a simple and cost-effective technique for
assessment of genetic polymorphism and rapid distinction of the two
medicinal plant species - Phyllanthus amarus Schum. Et. Thonn. and
Phyllanthus urinaria L.
XÁC NHẬN CỦA BAN CHỦ NHIỆM KHOA CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI
PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa ThS. Hoàng Thị Hoà
XÁC NHẬN CỦA TRƯỜNG
PHÓ HiỆb IRƯÓNB
PŨS.Ts.dí)ù.L ^ỈẰuiL^Ối.
3
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiMỤC LỤC
Mở đầu......................................................................................................... 5
Nội dung chính của đề tài.......................................................................... 7
TThương 1. Tổng quan tài liệu................................................................. 7
1. Các nghiên cứu về Phyllanthus L.......................................................... 7
1.1. Phân loại học thực vật và tên gọi....................................................... 7
1.2. Hình thái học, tế bào học và phân b ố ................................................ 7
1.3. Phân bố và sinh thái ............................................................................ 8
1.4. Sử dụng Phylỉanthus L. trong y học cổ truyền................................... 9
1.5/Thành phẩn hoá học của Phyllanthus L.............................. ............ 9
1.6. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Phyllanthus L................. 9
1.7. Các dược phẩm được bào chế từ p. amarus và p. urinaria............... 10
2. Đại cương về izozym......................................... ............................... 11
2.1. Izozym Superoxide dismutaza (SOD. E.c.1.15.1.1)..................... 13
2.2. Izozym Esteraza (EST. E.C.3.1.1.2) ................................................ 14
2.3. Izozym Peroxidaza (PO. E.c. 1.1.1.17)........................................... 14
Chương 2. Vật liệu và phương pháp.......................................................... 16
2.1. Vật liệu thực vật.................................................................................. 16
2.2. Phương pháp phân tích đa hình izozym........................................... 18
2.2.1. Phương pháp thu m ẫu .................................................................. 18
2.2.2. Phương pháp nghiền m ẫu ............................................................ 19
2.2.3. Phương pháp điện d i ...................................................................... 19
2.2.4. Phương pháp phân tích kết quả nghiên cứ u .................................. 19
Chương 3. Kết quả và thảo luận.............................................................. 21
3.1. Phổ điện di hệ izozym SOD củ a .................................................... 21
3.2. Phổ điện di hệ izozym EST.............................................................. 25
3.3. Phổ điện di hệ izozym P O ............................................................... 27
3.4. Quan hệ di truyền giữa các quần th ể ..................... ......................... 31
Kết L uận.................................................................................................... 32
Tài liệu tham khảo.................................................................................... 33
4MỞ ĐẨU
Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et. Thonn.) và diộp hạ
châu (Phyllanthus urinaria L.) ià hai loài cây thuốc thuộc chi Phyllanthus, họ
Ẽuphorbiaceae, phân bố tương đối rộng rãi ở Việt Nam. Hai loài cây thuốc
này đã được sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền ở nước ta cũng như ở
nhiều nước khác thuộc vùng Đông và Nam Á như An độ, Malaysia, Thái
Lan, Campuchia, Lào, Trung quốc, Inđônêsia ... Tuy vậy, cho đến nay việc
sản xuất các dược phẩm từ hai loài p. amarus và p. urinaria L. chủ yếu dựa
trên các dược liệu thu hái tự nhiên, trong đó phần lớn là các dạng mọc hoang
dại, bộc lộ một số nhược điểm sau:
- Viêc thu hái không có quy hoạch dẫn đến nguy cơ mất đi các nguồn
tài nguyên di truyền,
- Việc thu hái từ các dạng hoang dại không đáp ứng được yêu cầu của
công nghiệp dược do nguồn dược liệu ban đầu thường không ổn định và
không kiểm soát được về mặt hóa học, hoạt tính sinh học.
- Dược liệu thu thập hoang dại có nguy cơ nhiễm với các dạng vi sinh
vật (nấm, vi khuẩn, virút ...), vì vậy có thể mang theo các nguồn chất độc
ngoài ý muốn.
- Các dạng nguyên liệu hoang dại có nguy cơ nhiễm độc với các nguồn
hóa chất độc khác nhau, như chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu, các chất thải công
nghiệp ... nếu cây được thu hái từ các vùng bị ô nhiễm và thực tế tình hình
này rất khổ kiểm soát.
Hình 1. Cây Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus L. (A) và
Diệp hạ châu Phyllanthus urinaria L. (B) được dùng trong nghiên cứu
5
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phiNgoài ra, trong thực tế p. amarus và p. urinaria L. là hai loài cây thuốc
có đặc điểm hình thái rất giống nhau (xem Hình la,b) và giống với một số
loài Phyllanthus khác hiện đang có ở Việt nam, như p. niruri, p. reticulaĩus
... vốn ít được quan tâm hơn vì mục đích chế biến dược liệu. Việc phân loại
chính xác các loài phyllanthus hiện nay chỉ có thể thực hiện nhờ các chuyên
gia phân loại thực vật sau khi cây đã phát triển đến giai đoạn trưởng thành.
Trước thực tế như vậy, việc thu thập dược liệu tự phát từ người dân đứng
trước nhiều nguy cơ nhầm lẫn và khó có thể đảm bảo chất lượng của nguồn
dược liệu sử dụng cho sản xuất dược phẩm ở quy mô công nghiệp.
Trong hoàn cảnh đó, báo cáo đề tài này của chúng tui nhằm góp phần
cung cấp một công cụ phục vụ cho việc phân loại nhanh hai loài cây dược
liệu dẻ nhầm lẫn này. Ngoài ra, kỹ thuật này còn cho phép đánh giá mức độ
đa hình di truyền của các quần thể mẫu được thu thập từ một số địa phương
khác nhau ở miền Bắc nước ta, là dẫn liệu cơ bản cho việc chọn lọc nguồn
nguyên liệu phục vụ công tác chọn, tạo giống các loài cây thuốc này ở Việt
Nam trong tương lai.
Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam cho thấy khả năng ứng dụng các
chỉ thị phân tử (molecular fingerprintings) trong việc phân loại và định danh
nhanh các loài thảo dược ở nước ta, vốn từ trước đến nay chỉ được thực hiện
chủ yếu dựa vào các chỉ thị hình thái (là chỉ thị dễ gây nhầm lẫn trong nhiều
trường hợp) và trong một số ít trường hợp là chỉ thị hóa học.
6NỘI DUNG CHÍNH CỦA ĐỂ TÀI
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 CÁC NGHIÊN CỨU VỂ PHYLLANTHUS L.
1.1.1. Phân loại học thực vật và tên gọi
Chi Phyllanthus là một trong những chi lớn nhất của họ Thầu dầu
(Euphorbiaceae), thuộc bộ Euphorbiales, phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp
Hai lá mầm (Dicotyledons). Chi này gồm 11 phân chi: Isocladus, Kirganelia,
Cicca, Emblica, Phyllanthus, Conami, Gomphidium, Phyllanthodendron,
Xylophylỉa, Botryanthus, Eriococcus (ưnander et al., 1990) và có khoảng gần
700 loài. p. amarus và p. urinaria cùng thuộc phân chi Phyllanthus nhưng p.
amarus thuộc nhánh Phyllanthus còn p. urinaria thuộc nhánh Urinaria; trong
phân chi Phyllanthus còn có 2 nhánh khác là Lysiandra và Pentandra [25].
Trong chi Phyllanthus, nhiều loài cây trong đó có p. amarus và p.
urinaria được sử dụng làm thuốc trong y học dân tộc ở nước ta và một số nước
nhiệt đới khác trên thế giới như Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Brazil, Peru,
Tanzania,... từ cách đây hàng nghìn năm. Nhưng, phải đến năm 1738 chúng
mới được Linné mô tả và đặt tên (tại Barbados). Mặc dù vậy, những tài liệu cổ
cho thấy từ lâu những loài cây này đã từng được ghi nhận và mô tả [25].
Về tên gọi, do được sử dụng rộng rãi trong nền y học dân tộc của nhiều
quốc gia từ hàng nghìn năm, nên hai loài p. amarus và p. urinaria được gọi bằng
rất nhiều tên địa phương khác nhau, như: herbe du chagrin, petit tamarin rouge,
surette (Pháp), Chanca piedra (Peru), quebra-pedra, arranca-pedras, erva
pombinha (Braxin), pemilla del pasto (Puerto Rico), Holy Friday (Colombia),
gale of wind (Florida và Caribe thuộc Anh), Hurricane weed (Bahamas), Creole
quinine, arrebentapedra, Paraparaimè (Paraguay), Santa Maria, San Pedro, herb of
San Pablo, sampasampalkan (Philippines), zhen chu cao, ye xia zhu, Hsieh-hsia
Chu (Trung Quốc), Komikansou (Nhật Bản), Pitirishi, Budhatri (An Độ),... Đôi
khi, tại một số địa phương, các tên thường được dùng lẫn lộn để gọi tên cả hai
loài hay một số loài khác thuộc chi Phyllanthus [25].
ỏ Việt Nam, các cây thuốc p. amarus và p. urinaria cũng được gọi tên
bằng những tên địa phương khác nhau, chẳng hạn như chó đẻ răng cưa, cam
kiềm, vườn kiềm, diệp hạ châu, diệp hoè thái, lão nha châu, trân châu thảo, rút
đất, khao ham... Và cũng giống như ở một số nước, ở nước ta các tên địa phương
đôi khi cũng được dùng lẫn lộn cho cả hai loài. Nhưng phổ biến nhất p. amarus
được gọi là diệp hạ châu đắng hay chó đẻ chân chim, chó đẻ thân xanh, phân biệt
với P. urinaria được gọi là diệp hạ châu hay chó đẻ răng cưa [1],
1.1.2. Hình thái học, tê bào học
Các đặc điểm hình thái cơ bản của p. amarus và p. urinaria có thể mô
tả như sau: là những cây thân thảo, sống một năm hay nhiều năm, cao
trung bình 20-30cm, đôi khi có thể cao đến 60-70cm; Thân nhẵn, tròn; lá
7
Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ket-noi.com kho tai lieu mien phimọc so le, hình bầu dục, xếp sít nhau thành hai dãy, mỗi cành như một lá
kép hình lồng chim, mặt trên xanh lục nhạt, mặt dưới màu xanh mốc;
phiến lá thuôn, dài 5-15mm, rộng 3-6mm, đầu nhọn hay hơi tù, mép
nguyên; gân - phụ mảnh, có 4-6 cặp; không có cuống lá hay cuống lá rất
ngắn. Hoa mọc ở nách lá, nhỏ, có cuống ngắn, đơn tính cùng gốc; hoa đực
b đầu cành, hoa cái ở cuối cành, tiểu nhụy 3, chỉ nhị dính nhau; Quả nang,
hình cầu đường kính khoảng 2mm, mọc rủ xuống ở dưới lá nên được gọi là
diêp hạ châu (nghĩa là hạt dưới lá); mỗi quả có 6 hạt hình tam giác, màu nâu
nhạt, có vân ngang. Cây thường ra hoa từ tháng 4 đến tháng 6 và ra quả từ
tháng 7 đến tháng 9 [1,7].
Ngoài những đặc điểm chung trên, hai loài p. amarus và p. urinaria
cũng có một số điểm khác biệt về hình thái như: p. amarus thường mọc
thẳng, thân mầu xanh, ít chia nhánh trong khi p. urinaria lại thường phân
nhánh, thân có mầu xanh xẫm hay tím; cây p. amarus thường có quả nhẫn,
không gai còn quả của cây p. urinaria thường có gai; hoa của p. amarus có 5
lá đài, còn hoa của p. urinaria có 6 lá đài (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng
Hộ, 1999). Tuy vậy, các đặc điểm phân biệt này thường chỉ rõ rệt khi cây đã
đạt đến giai đoạn trưởng thành (ra hoa, kết quả) và được phân loại bởi những
nhà phân loại học có kinh nghiêm. Trong thực tế quá trình thu thập và chế
biến dược liệu hiện nay, những khó khăn trong phân loại như vậy rất dễ dẫn
đến việc thu thập nhầm lẫn giữa hai loài này [2,5].
Cho đến nay có rất ít những nghiên cứu về tế bào học của Phyllanthus
amarus và p. urinaria. Nghiên cứu của Bancilhon và cộng sự (1971) cho
thấy bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội của p. amarus là 2n= 26 hay 2n= 52;
Nghiên cứu của Rossignol và cộng sự (1987) lại cho thấy bộ nhiễm sắc thể
lưỡng bội của p. urinaria là 2n= 50. Một dẫn liệu khác cho rằng bộ nhiễm
sắc thể lưỡng bội của p. amarus cũng là 2n=26, còn của p. urinaria là
2n=14, 2n= 52, hay 2n= 50 tuỳ theo thứ (Phạm Hoàng Hộ, 1999). Như vậy,
có thể nói, đến nay chưa có nghiên cứu hoàn chỉnh về số lượng và đặc điểm
bộ nhiễm sắc thể cơ bản của các loài Phyllanthus [5,11,17],
1.1.3. Phân bố và sinh thái
Ở Việt Nam, chi Phyllanthus L. có khoảng 40 loài. Trong đó có hai
loài là Phyllanthus amarus và Phylỉanthus urinaria L. có hình dáng gần
giống nhau, mọc rải rác ở khắp mọi nơi trừ vùng cao lạnh. Trên thế giới, các
loài này cũng được phân bố rộng rãi ở Campuchia, Lào, Malaysia, Thái lan,
Trung quốc, Ấn độ, Brazil, Florida và Texas (Mỹ). Phylỉanthus L. là cây ưa
ẩm và ưa sáng hay có thể hơi chịu bóng, thường mọc lẫn trong các bãi cỏ, ở
ruộng cao ( đất trổng màu), nương rẫy, vườn nhà và đôi khi ở vùng đồi. Cây
con mọc từ hạt vào cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh trong mùa hè và tàn lụi
vào mua thu. Do khả năng ra hoa kết quả, nhiều hạt giống phát tán gần nên
cây mọc thành đám dày đặc, đôi khi lấn át cả cỏ dại và cây trồng khác [1],
81.1.4. Sử dụng Phyllanthus L. trong y học cổ truyền
Các tác dụng điều tri được biết đến rộng rãi của hai loài Phyllanthus
amarus và Phyllanthus urinaria bao gồm điều trị một số rối loạn đường tiêu
hóa (đặc biột là các bệnh lý về gan), bệnh tiểu đường, một số bệnh về thận,
đường tiết niệu, (Calixto et al., 1998). Gần đây, một số nghiên cứu lâm sàng
và dược lý đã chứng minh dịch chiết và thành phần của hai loài cây thuốc này
có tác dụng ức chế quá trình sao chép của virút viêm gan B và nhiều
retrovirút khác (trong đó có HIV) nhờ tác dụng ức chế hoạt động của enzym
sao chép ngược reverse transcriptaza [13,21,22].
Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cho thấy các dịch chiết Phyllanthus
có hoạt tính ức chế ACE (angiotensin-converting enzym) liên quan đến một
số biến chứng của bệnh tiểu đường [24,25]
1.1.5. Thành phần hoá học của Phyllanthus L.
Các chất hoá học của cây Phylanthus L. tìm thấy ở lá, thân và rễ gồm
một số chất chính như:
Lignan : phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin.
Flavonoid : phyllanthin flavonoid FG-1, phyllanthin flavonoid FG-2.
Tannin : repandusinic acid, geraniin.
Ngoài ra còn một số thành phần hoá học như: glycoside, alkaloid,
elligitannin, phenylpropanoid, lipid, sterol, flavonol,...[12]
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ các kết nghiên cứu trên, chúng tui rút ra một số kết luận sau:
1. Có thể sử dụng kỹ thuật phân tích hệ izozym SOD, EST và PO để góp phần
phân loại hai loài cây thuốc Phyllanthus amarus Schum. et. Thonn.và
Phyllanthus urinaria L. ngay từ khi cây còn nhỏ (đặc biệt là hệ izozym
SOD).
2. Các băng điện di phổ izozym SOD đặc trưng riêng của các quần thể loài p.
amarus trong nghiên cứu này có Rf= 0,63; Rf= 0,71 và Rf= 0,75.
3. Các băng điện di phổ izozym EST đặc trưng riêng của các quần thể loài p.
amarus có Rf=0,09 và Rf=0,42.
ằ. Các băng điện di phổ izozym PO đặc trưng riêng của các quần thể loài p.
amarus có Rf= 0,85 và Rf= 0,87.
jC Phát hiện quần thể p.urinaria Nội Bài ,Sóc Sơn (UNB) có phổ điện di
izozym SOD, EST mang các băng đặc trưng của loài p. amarus. Có thể đây
là con lai giữa 2 loài p. amarus và p. urinaria.
ế. Có thể sử dụng các hệ izozym SOD, EST và PO để đánh giá mức độ đa
dạng và khoảng cách di truyền giữa 2 loài p. amarus và p. urinaria thu thập
ở miền Bắc Việt Nam, trong đó hệ izozym SOD cho độ đa dạng hơn.
ĐỀ NGHỊ
1. Tiếp rục nghiên cứu, hoàn thiện các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên
cứu đa dạng di truyền các loài Phyllanthus spp. và các đối tượng khác, nhằm
góp phần vào việc phân loại và kiểm định dược liệu.
2. Có những nghiên cứu sâu hơn vể quần thể Phyllanthus urinaria L. Nội
Bài, Sóc Sơn để khẳng định xem đây có đúng là con lai giữa 2 loài hay
không?
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links
Last edited by a moderator: