ooo_misslove_ooo
New Member
Download miễn phí Khóa luận Nghiên cứu qui trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN . 1
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . 2
MỞ ĐẦU . 3
CHưƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
1.1.GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ . 4
1.1.1.Phân loại. 4
1.1.2. Giá trị của cây thuốc lá . 5
1.1.3 . Thực trạng phát triển vùng thuốc lá nguyên liệu tại Việt Nam . 6
1.2. MỘT SỐ BỆNH THưỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ . 8
1.2.1. Bệnh virus trên cây thuốc lá . 8
1.2.2. Bệnh khảm lá do virus . 10
1.3. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC . 14
1.3.1. Sử dụng giống kháng bệnh: . 14
1.3.2.Sử dụng giống sạch bệnh . 15
1.3.3. Các biện pháp canh tác. 15
1.3.4. Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học . 15
1.3.4.1. Giới thiệu chung về công nghệ RNAi trong tạo cây trồng kháng virus . 18
1.3.4.2. Cơ chế hoạt động của RNAi . 18
1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở VIỆT NAM. . 19
CHưƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP . 21
2.1. VẬT LIỆU. 21
2.1.1.Vật liệu thực vật . 21
2.1.2.Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen: . 21
2.1.3.Hóa chất và thiết bị sử dụng. 22
2.2. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 22
2.2.1.Tạo nguyên liệu thí nghiệm: . 22
2.2.1.1.Khử trùng hạt bằng khí Clo . 22
2.2.1.2. Gieo hạt. 22
2.2.2.Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua trung gian vi khu ẩn Agrobacterium tumafaciens . 23
2.2.2.1.Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium. 23
2.2.2.2. Tạo nguyên liệu chuyển gen . 23
2.2.2.3.Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy . 23
2.2.2.4.Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen. 24
2.2.2.5.Tạo rễ và cây hoàn chỉnh. 24
2.2.3.Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp nhuộm mô hóa tế bào . 24
2.2.4. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen TMV_RNAi bằng phương pháp PCR . 25
2.2.4.1. Tách chiết ADN tổng số . 25
2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR. 25
2.2.5. Phân tích khả năng kháng virus c ủa các cây chuyển gen bằng phương
pháp lây nhiễm nhân tạo . 26
CHưƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 28
3.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GENVÀO GIỐNG THUỐC
LÁ C9-1 THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMAFACIENS . 28
3.1.1. Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen . 29
3.1.2. Chuyển gen và tái sinh cây . 29
3.1.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch Agrobacterium và cảm ứng tạo cụm chồi . 29
3.1.2.2. Tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh . 32
3.1.3. Phân tích sơ bộ cây chuyển gen gus bằng nhuộm hóa mô tế bào. 35
3.2. CÁC KẾT QUẢ BưỚC ĐẦU TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN
MANG CẤU TRÚC TMV-RNAi. 35
3.2.1. Tái sinh và chuyển gen mang cấu trúc TMV-RNAi . 35
3.2.2. Phân tích cây chuyển gen TMV_RNAi kháng virus . 37
3.2.2.1. Phân tích khả năng kháng virus TMV bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo . 37
3.2.2.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây . 38
3.2.2.2.1. Kết quả tách ADN tổng số . 38
3.2.2.2.2. Kết quả phản ứng PCR . 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 42
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
số cây kiểm tra) và những siRNA đãđƣợc phát hiện trong những dòng cây chuyển gen này. Nói chung, hầu hết các
cây chuyển gen làm chậm sự tích lũy virus và làm chậm hay giảm nhẹ các
triệu chứng bệnh[19]
Cho đến nay đã có các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus
đƣợc công nhận và trồng thƣơng mại nhƣ: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm
vòng (papaya ringspot virus, PRSV) đã đƣợc công nhận và trồng ở Mỹ, Trung
Quốc, Philippine; Bí đao chuyển gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic
virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã đƣợc công
nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic
virus, đƣợc công nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại
cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo
nghiệm để đƣợc công nhận là giống cây trồng thƣơng mại nhƣ: Sắn chuyển
gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen
kháng Maize steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng
thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus),
Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro
viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyển gen kháng Sweet potato feathery
mottle virus (Potyvirus...
Các cấu trúc gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh đƣợc sử dụng chuyển vào
cây trồng để tạo tính kháng có thể là các loại khác nhau nhƣ: các cấu trúc của
virus theo chiều xuôi (sense) hay chiều ngƣợc (antisense), các cấu trúc dạng
kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) và các miRNA nhân tạo có đích là các trình
tự gen của virus gây bệnh, hay kỹ thuật RNAi “RNA interference”, đang đƣợc
quan tâm nhiều và ứng dụng rộng rãi.
18
1.3.4.1. Giới thiệu chung về công nghệ RNAi trong tạo cây trồng kháng virus
1.3.4.2. Cơ chế hoạt động của RNAi
RNAi là cơ chế ức chế sự biểu hiện vật chất di truyền ở giai đoạn RNA. Ở
thực vật có ba con đƣờng ức chế RNA trong đó con đƣờng đầu tiên là sự
ức chế gen sau phiên mã PTGS (post-transcriptional gen silencing) qua
trung gian là các RNA nhỏ có vai trò ức chế siRNA (short interfering
RNA) đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong những nghiên cứu tạo cây chuyển
gen kháng virus. Quá trình này xảy ra ở tế bào chất và là con đƣờng quan
trọng trong tế bào thực vật nhiễm virus nơi mà sợi RNA kép hay cấu trúc
thứ cấp của RNA virus sợi đơn có thể sao chép gián tiếp. Trong trƣờng
hợp virus DNA, dsRNA có thể đƣợc tạo ra nhờ quá trình phiên mã bổ sung
liên tiếp [13]. Cơ chế cũng xảy ra tƣơng tự nhƣ ở động vật. Khi có sự xâm
nhập của dsRNA, Dicer bản chất là RNaseIII đặc hiệu cho dsRNA cắt
những chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25
nucleotide, gọi là siRNA . Sau đó, các siRNA kép hình thành đƣợc tách ra
làm hai chuỗi đơn, và chỉ một chuỗi đơn RNA với đầu 5' có lực bắt cặp
base (base-pairing) nhỏ nhất tiếp tục liên kết với Argonaute trong phức hệ
RISC. Tiếp đó, phức hệ RISC đã gắn đoạn siRNA nhận biết các mRNA
của tế bào có trình tự tƣơng đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn siRNA
này. Sau khi nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp các base tƣơng đồng với
trình tự của chuỗi đơn siRNA, mRNA bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi
kép siRNA-mRNA thành những đoạn nhỏ khoảng 12 nucleotid từ đầu 3’.
Sau khi bị cắt đứt, mRNA nhanh chóng bị tiêu huỷ bởi các RNA nuclease
[16] (Hình 1.6).
19
Hình 1.6: Cơ chế hoạt động RNAi.
1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở
VIỆT NAM.
Ở Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu theo hƣớng ứng dụng kỹ
thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus
gây ra. Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học do GS.
Lê Trần Bình và PTS. Chu Hoàng Hà đứng đầu là nhóm nghiên cứu đầu tiên
ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây
chuyển gen kháng virus. Một trong những kết quả của đề tài cấp Viện
KH&CN Việt Nam đƣợc tiến hành trong 2 năm 2007-2008: “Nghiên cứu ứng
dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus”
là đã tạo đƣợc các cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dƣa chuột
(CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus
trên. Năm 2009, ứng dụng RNAi, Phạm Thị Vân và cộng sự [7] (Phòng Công
20
Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học) đã tạo đƣợc dòng thuốc
lá chuyển gen ở thế hệ T0 kháng virus CMV với tỷ lệ 64,6%, kháng TMV với
tỷ lệ 74,5% và kháng đồng thời hai loại virus TMV và CMV với tỷ lệ
70,8%[7]. Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng to lớn kỹ thuật RNAi
trong việc tạo giống cây trồng kháng virus.
Kỹ thuật RNAi cũng đã đƣợc tiếp tục nghiên cứu ứng dụng trong đề tài trọng
điểm cấp nhà nƣớc thuộc chƣơng trình phát triển công nghệ sinh học (KC04-
03/06-10) với mục đích tạo cây đu đủ và cây ăn quả có múi chuyển gen kháng
bệnh virus. Đề tài đã đƣợc nghiệm thu cấp nhà nƣớc trong tháng 9/2010. Một
trong những kết quả đạt đƣợc của đề tài là đã tạo ra đƣợc các dòng đu đủ
chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn với virus đốm vòng.
Bên cạnh cây trồng chuyển gen kháng virus cũng đã có rất nhiều thành công
trong việc tạo cây có khả năng kháng bệnh cây trồng, kháng vi khuẩn, kháng
côn trùng có hại hay cây chuyển gen chống chịu với điều kiện sinh thái bất lợi
mang lại hiểu quả kinh tế cao[6]. Tất cả đang mở ra một thời kì mới cho nền
nông nghiệp Việt Nam.
21
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1.Vật liệu thực vật
Hạt giống thuốc lá C9-1 do công ty TNHH Một thành viên KTKT thuốc lá lai
tạo.
2.1.2.Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen:
- Chủng Agrobacterium tumafaciens CV58C1 mang vector pCB_GUS
Hình 2.1. Vector pCB_GUS
- Chủng Agrobacterium tumafaciens CV58C1 mang vector TMV_RNAi
22
2.1.3.Hóa chất và thiết bị sử dụng
- Hóa chất: Bacto pepton, Yeast extract, NaCl, Agarose, Sucrose,
Glucose, Trypton, KCl, EDTA, MgCl2, NaOH. Các loại kháng sinh :
kanamycin, rifamycine, cefotaxime, streptomycine, spectinmycine. Các chất
điều hòa sinh trƣởng nhƣ: BAP, NAA, và các hóa chất thông dụng của các
hãng Fermentas, Invitrogen, Mecrck, Sigma...
- Môi trƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào và nuôi
cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm chuyển gen gồm: MS, môi trƣờng lây
nhiễm lỏng IM, môi trƣờng tạo mô sẹo, môi trƣờng tạo chồi, môi trƣờng ra rễ
và môi trƣởng nuôi khuẩn LB. Thành phần nhƣ trong phụ lục 1.
- Máy móc và thiết bị: Buồng cấy vô trùng , máy đo pH, máy đo OD, tủ
nuôi lắc, nồi khử trùng, máy ly tâm lạnh,máy điện di, cùng với các thiết bị
khác của Phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.Tạo nguyên liệu thí nghiệm:
2.2.1.1.Khử trùng hạt bằng khí Clo
Khử trùng toàn bộ công cụ trƣớc thí nghiệm
Đặt cốc thủy tinh chứa 100ml Javen vào bình khử trùng. Hạt thuốc lá đƣợc
cho bình pyrex (dung tích 100ml). Bình Pyrex mở hé 1/3 nắp lọ đặt bên cạnh
cốc thủy tinh chứa dung dịch Clo. Bổ sung vào cốc đựng Javen 3ml HCl, hỗn
hợp này sẽ tạo ra khí Clo có tác dụng khử trùng hạt thuốc lá. Đậy kín bình
khử trùng và dán parafin.
Sau 4h lấy hạt đã khử trùng ra đ