Download miễn phí Luận văn Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số giống đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek]
MỤC LỤC
Lời cam đoan. i
Lời cảm ơn. ii
Mục lục. .iii
Những chữ viết tắt.vi
Danh mục các bảng. .vii
Danh mục các hình.viii
MỞ ĐẦU . 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
1.1.CÂY ĐẬU XANH . 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh . 3
1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây đậu xanh . 3
1.1.3. Tầm quan trọng của cây đậu xanh . 7
1.1.4. Đặc điểm hoá sinh của hạt đậu xanh . 8
1.1.4.1. Protein . 8
1.1.4.2. Lipid . 9
1.2. NGHIÊN CỨU QUAN HỆ DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT . 9
1.2.1. Một số phương pháp sinh học phân tử trong phân tích quan hệ
di truyền ở thực vật. 9
1.2.1.1. Kỹ thuật RAPD . 9
1.2.1.2. Kỹ thuật AFLP . 12
1.2.1.3. Kỹ thuật RFLP . 12
1.2.1.4. Kĩ thuật SSR . 13
1.2.1.5. Bản đồ QTL . 14
1.2.2. Nghiên cứu quan hệ di truyền ở thực vật sử dụng kỹ thuật RAPD . 14
1.2.3. Nghiên cứu quan hệ di truyền ở đậu xanh sử dụng kỹ thuật RAPD . 19
1.3. NHẬN XÉT CHUNG . 21
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 22
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU . 22
2.1.1. Vật liệu thực vật . 22
2.1.2. Hoá chất và thiết bị . 24
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu . 24
2.2. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 24
2.2.1. Phương pháp hoá sinh . 24
2.2.1.1. Định lượng lipid tổng số . 24
2.2.1.2. Định lượng protein . 25
2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử . 27
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số . 27
2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA tổng số . 28
2.2.2.3. Phương pháp RAPD . 29
2.2.2.4. Phân tích số liệu RAPD . 31
2.2.3. Phương pháp xử lý kết quả và số liệu . 31
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 32
3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HOÁ SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG
ĐẬU XANH NGHIÊN CỨU . 32
3.1.1. Đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt của 30 giống đậu xanh . 32
3.1.2. Hàm lượng protein, lipid của 30 giống đậu xanh nghiên cứu . 34
3.2. PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD . 38
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá đậu xanh . 38
3.2.2. Kết quả nghiên cứu quan hệ di truyền DNA bằng kĩ thuật RAPD . 40
3.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa các giống đậu xanh dựa trên phân
tích RAPD . 57
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 62
1. KẾT LUẬN . 62
2. ĐỀ NGHỊ . 62
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN . 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 64
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
chọn dòng bốmẹ phục vụ mục đích chọn giống [33].
21
Năm 2006, Karuppanapandian T. và cs đã xác định quan hệ di truyền của
các giống đậu xanh (Vigna radiata L.) được lựa chọn từ những vùng khác
nhau ở Nam Tamil Nadu (Ấn Độ) bằng kỹ thuật RAPD với 20 mồi ngẫu
nhiên. Kết quả thu được 200 đoạn gen khuếch đại khác nhau, trong đó có 83%
thể hiện sự đa hình [44].
1.3. NHẬN XÉT CHUNG
Đậu xanh là một loại cây đậu đỗ quan trọng có giá trị kinh tế cao được
trồng chủ yếu để lấy hạt. Ở nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam,
sản xuất và chế biến đậu xanh đã đáp ứng nhu cầu tiêu thụ lớn và đa dạng
trong nước. Hạt đậu xanh được chế biến thành nhiều thức ăn quan trọng và
thuốc chữa bệnh cho con người.
Giá trị dinh dưỡng của đậu xanh thể hiện ở thành phần, hàm lượng các
chất như protein, lipid,…các quá trình tổng hợp, tích luỹ hay phân giải các
chất như protein dự trữ, amilaza, các amino acid,…đều liên quan đến sự sinh
trưởng, phát triển và khả năng chống chịu của cây đậu xanh.
Vì vậy, việc nghiên cứu hoá sinh hạt đậu xanh nhằm tìm ra các giống
đậu xanh có năng suất cao, chất lượng tốt và chống chịu được các điều kiện
bất lợi của môi trường là góp phần chọn được các giống có năng suất và chất
lượng ổn định.
Những công trình nghiên cứu quan hệ di truyền của cây đậu xanh ở
nước ta còn ít. Sự đa dạng di truyền sẽ chỉ ra những mức độ sai khác giữa các
giống đậu xanh nghiên cứu ở mức độ phân tử và giải thích được tính đa dạng
nguồn gen của cây đậu xanh.
22
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Vật liệu thực vật
Vật liệu nghiên cứu của đề tài là hạt của 30 giống đậu xanh khác nhau,
trong đó 10 giống do Viện nghiên cứu Ngô cung cấp và 20 giống thu thập được
từ các địa phương. Nguồn gốc của các giống đậu xanh nghiên cứu được trình
bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Nguồn gốc các giống đậu xanh nghiên cứu
TT Tên
giống
Nguồn gốc TT Tên
giống
Nguồn gốc
1 T1 Bắc Sơn - Lạng Sơn 16 T16 Kim Động - Hưng Yên
2 T2 Mai Châu - Hoà Bình 17 T17 Yên Phong - Bắc Ninh
3 T3 Bát Xát - Lào Cai 18 T18 Đình Bảng - Bắc Ninh
4 T4 Mộc Châu - Sơn La 19 T19 Nam Sách - Hải Dương
5 T5 Bảo Lạc - Cao Bằng 20 T20 Yên Thế - Bắc Giang
6 T6 Xuất Hoá - Bắc Kạn 21 T21 Việt Yên - Bắc Giang
7 T7 Đồng Hỷ - Thái Nguyên 22 T22 044/DX06 - Viện NC Ngô
8 T8 Phú Lương - Thái Nguyên 23 T23 Từ Liêm - Hà Nội
9 T9 Hàm Yên - Tuyên Quang 24 T24 Long Biên - Hà Nội
10 T10 Sơn Dương - Tuyên Quang 25 T25 VN99-3 - Viện NC Ngô
11 T11 Bắc Quang - Hà Giang 26 T26 DXVN4 - Viện NC Ngô
12 T12 Hoàng Su Phì - Hà Giang 27 T27 DXVN5 - Viện NC Ngô
13 T13 Thanh Thuỷ - Phú Thọ 28 T28 VN93-1 - Viện NC Ngô
14 T14 Yên Bình - Yên Bái 29 T29 Vĩnh Bảo - Hải Phòng
15 T15 Kim Bảng - Hà Nam 30 T30 Yên Lạc - Vĩnh Phúc
23
T1 T2 T3 T4 T5
T6 T7 T8 T9 T10
T11 T12 T13 T14 T15
T16 T17 T18 19 T20
T21 T22 T23 T24 T25
T26 T27 T28 T29 T30
Hình 2.1. Hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu
24
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
Hoá chất: Sử dụng các hóa chất tinh khiết của các nước và các
hãng nổi tiếng như Taq - polymerase, buffer PCR của hãng Invitrogen
EDTA, Tris, Agarose,… của Đức.
Các loại thiết bị máy móc: Các thiết bị máy móc phục vụ sinh học phân
tử như máy PCR, máy quang phổ UV - Visible Spectrometer (cintra 40) của
Australia, máy li tâm lạnh eppendorf của Đức, nồi hấp khử trùng, máy soi gel,
bộ điện di, box cấy, máy lắc, lò vi sóng, cân điện tử, tủ sấy, tủ lạnh, bể ổn nhiệt,
pipetman, máy làm khô DNA (Speed Vac) và một số thiết bị, máy móc cần
thiết khác.
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Sinh học phân tử và Công
nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên; Phòng thí nghiệm
sinh học - Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học khoa học - Đại học Thái
Nguyên và Phòng Công nghệ Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học -
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp hoá sinh
2.2.1.1. Định lƣợng lipid tổng số
Hàm lượng lipid được xác định bằng phương pháp Soxhlet [2].
* Nguyên tắc
Dựa vào khả năng hoà tan của lipid trong dung môi hữu cơ để chiết lipid
có trong hạt đậu xanh.
Dung môi hữu cơ được sử dụng là petroleum ether.
* Tiến hành
Hạt đậu xanh được sấy khô ở 700C đến khối lượng không đổi, nghiền
mịn, cân 0,05 g bột mẫu cho vào ống eppendorf 2 ml, thêm 1,5 ml petroleum
25
ether, lắc đều trong 10 phút, bảo quản mẫu ở 40C trong 24 giờ. Sau đó mang
đi li tâm 12000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, loại bỏ dịch. Lặp lại quy trình
như trên 3 lần.
Hàm lượng lipid tính bằng hiệu số khối lượng mẫu trước và sau khi
chiết phần trăm khối lượng khô.
%100% *
a
ba
L
Trong đó: % L - % của lipid
a - khối lượng mẫu trước khi chiết
b - khối lượng mẫu sau khi chiết
2.2.1.2. Định lƣợng protein
Định lượng protein tan trong hạt đậu xanh theo phương pháp Lowry [2].
* Nguyên tắc
Dựa vào cường độ màu xanh của phức chất đồng, protein khử hỗn hợp
phosphomolipdate - phosphovonphramate (thuốc thử Foling - Ciocalteau).
Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng protein.
* Lập đồ thị chuẩn định lƣợng protein
Nguyên liệu và hoá chất:
Albumin tiêu chuẩn 100%.
Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N.
Dung dịch B: CuSO4 0,5% trong Natri, kali tactrate 1%.
Dung dịch C: 49 ml dung dịch A : 1 ml dung dịch B.
Thuốc thử Foling.
Pha dung dịch albumin 0,02% từ albumin gốc tinh khiết 100%. Lấy 6
ống nghiệm, đánh số thứ tự từ 1 đến 6, cho các chất tham gia phản ứng như
trong bảng 2.2. Sau đó đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 750 nm.
26
Bảng 2.2. Xây dựng đường chuẩn định lượng protein theo Lowry
Các ống nghiệm
Hóa chất
1 2 3 4 5 6
Protein 0,02% (ml) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Nƣớc cất (ml) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
Lƣợng protein (mg) 0,00 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20
Dung dịch C (ml) 4 4 4 4 4 4
Thuốc thử Folin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Kết quả đo OD ở 750 nm 0,00 0,11 0,20 0,31 0,39 0,49
Đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương pháp Lowry được thể
hiện như hình 2.2.
H×nh 2.2. §å thÞ chuÈn ®Þnh l•îng protein theo Lowry
0,00
0,11
0,20
0,31
0,39
0,49
0
0,1
,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 0,04 0,08 0,12 0,16 0,2
mg/ml
A
27
* Tiến hành định lƣợng
Dùng các dung dịch đệm phosphate citrate (pH = 10), NaCl 1M và
nước cất để chiết protein tan có trong hạt. Mẫu sấy khô tuyệt đối ở 1050C,
nghiền mịn, cân 0,05 g bột mẫu cho vào ống eppendorf 2 ml, thêm 1,5 ml
dung dịch đệm chiết, lắc đều trong 10 phút, bảo quản mẫu ở 40C trong 24 giờ.
Sau đó mang đi li tâm 12000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu lấy dịch. Lặp
lại quy trình như trên 3 lần nhưng lần thứ hai chỉ cần để lạnh trong 8 - 10 giờ,
lần ba là 6 - 8 giờ. Sau khi chiết bằng dung dịch đệm phosphate citrate (pH =
10), tiếp tục tiến hành chiết bằng dung dịch NaCl 1M và nước cất. Dịch chiết
chứa protein hoà tan đem xác định hàm lượng cùng protein chuẩn là albumin
huyết thanh bò theo phương pháp quang phổ hấp thụ bước sóng 750 nm với
thuốc thử Foling. Đơn vị tính hàm lượng protein là phần trăm khối lượng khô.
Hàm lượng protein được xác định dựa trên đồ th...