o0_koyeu_tradep_bove_o0
New Member
Download miễn phí Thu nhận enzyme pectinase từ asp.niger - Tinh sạch bằng phương pháp lọc gel và lọc màng
Tiến hành tủa enzyme từ500ml dịch chiết thu được bởi ethanol 96o, nhiệt độtủa 4oC, thời
gian tủa là 1 giờ. Sau đó, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút thu enzyme thô. Hòa tan
enzyme thô này trong 500ml dung dịch đệm Mc Ilvaine pH 4,5. Tiến hành lọc 500ml dung
dịch enzyme vừa hòa tan trên bằng hệthống lọc QuixStand Benchtop Systems (hãng
Amersham Biosciences) với bộlọc màng (membrane) có khoảng phân đoạn 50kDa. Tốc độ
bơm mẫu đầu vào lần lượt là 150rPhần mềm & 200rPhần mềm và điều chỉnh sao cho áp suất trên bềmặt
màng không quá 5 Psi. Thu dịch qua lọc và xác định hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt độ
tương ứng.
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
Science & Technology Development, Vol 11, No.08 - 2008Trang 46
THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ ASP.NIGER - TINH SẠCH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP LỌC GEL & LỌC MÀNG
Huỳnh Ngọc Oanh, Trần Ngọc Hùng
Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG -HCM
(Bài nhận ngày 10 tháng 01 năm 2008, hoàn chỉnh sửa chữa ngày 12 tháng 05 năm 2008)
TÓM TẮT: Chế phẩm enzyme pectinase được sản xuất từ chủng nấm mốc Aspergillus
niger trên môi trường có chứa chất cảm ứng bột cà rốt sau 48 giờ đạt hoạt độ cao nhất
30,01(UI/g). Phân tích chế phẩm enzyme bằng phương pháp lọc gel sử dụng cột Bio Gel P 30
thu được một peak có hoạt độ pectinase và với tốc độ chảy qua cột 15ml/giờ có khả năng phân
tách tạp chất tốt hơn ở tốc độ 30 ml/giờ.
Tinh sạch chế phẩm enzyme bằng phương pháp lọc màng (cross flow membrane) với tốc
độ bơm đầu vào 150rPhần mềm thì độ tinh sạch (tăng 3,1 lần trước khi lọc) cao hơn ở tốc độ 200rmp
có độ tinh sạch (chỉ tăng 2,2 lần so với trước khi lọc).
1.GIỚI THIỆU
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự thủy phân pectin (polysaccharide dị thể).
Pectinase được sản xuất chủ yếu bởi nấm mốc Aspergillus sp., Botrytis cinerea, Fusarium
moniliforme, Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp., Neurospora crassa…
Enzyme pectinase thường được dùng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm đặc biệt
trong công nghệ sản xuất các loại nước quả và rượu vang. Người ta sử dụng enzyme pectinase
để khử pectin, tránh hiện tượng bị đục và lắng cặn trong quá trình sản xuất và bảo quản [3,5].
Trong bài báo cáo này, chúng tui trình bày kết quả nghiên cứu điều kiện thích hợp để thu
nhận và tinh sạch enzyme pectinase bằng lọc gel và lọc màng.
2. NGUYÊN LIỆU & PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu thu nhận enzyme pectinase
Nấm mốc Aspergillus niger được giữ giống trên môi trường Czapek. Bột cà rốt: cà rốt xay
nhuyễn, sấy ở nhiệt độ 60oC cho đến khi độ ẩm cà rốt đạt 4% (nguồn pectin – chất cảm ứng)
Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase gồm: cám gạo 65,5%, trấu
21,5%, bột cà rốt 11%, (NH4)2SO4 2%, độ ẩm 55%. Khử trùng 121oC trong 30 phút.
2.2. Phương pháp nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase từ phương pháp nuôi cấy bề
mặt [2]
2.3. Xác định hoạt độ enzyme pectinase [4]
Enzyme pectinase thô được xác định hoạt độ bằng phương pháp đo độ nhớt với nhớt kế
Borosil: hút 2ml dung dịch enzyme thô 5% (w/v) phản ứng với 18ml dung dịch pectin 1% ở
pH 4,5 và nhiệt độ 40oC. Một đơn vị hoạt độ pectinase (UI) là lượng enzyme cần thiết làm
giảm 10% độ nhớt của hỗn hợp chứa 180mg pectin dưới những điều kiện như trên.
2.4. Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme được xác định bằng phương pháp
Lowry[1]
2.5. Phân tích chế phẩm enzyme bằng phương pháp lọc gel Bio Gel P 30
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 11, SỐ 08 - 2008
Trang 47
Hòa tan chế phẩm enzyme thô trong đệm Mc Ilvaine pH 4,5 ly tâm bỏ cặn thu được dung
dịch enzyme sau đó hút 0,5ml cho chạy qua cột Bio Gel P 30 (0,8 x 30cm) (hãng Biorad – Mỹ)
được cân bằng với đệm Mc Ilvaine pH 4,5. Tốc độ chảy qua cột lần lượt là 30ml/giờ và
15ml/giờ. Mỗi phân đoạn thu 2ml và 1,5ml. Đo độ hấp thu A của từng phân đoạn ở bước sóng
280nm. Vẽ đồ thị ghi nhận các peak tạo thành và xác định hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt độ
tính tương ứng.
2.6. Tinh sạch enzyme pectinase bằng phương pháp lọc màng (cross flow membrane)
Tiến hành tủa enzyme từ 500ml dịch chiết thu được bởi ethanol 96o, nhiệt độ tủa 4oC, thời
gian tủa là 1 giờ. Sau đó, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút thu enzyme thô. Hòa tan
enzyme thô này trong 500ml dung dịch đệm Mc Ilvaine pH 4,5. Tiến hành lọc 500ml dung
dịch enzyme vừa hòa tan trên bằng hệ thống lọc QuixStand Benchtop Systems (hãng
Amersham Biosciences) với bộ lọc màng (membrane) có khoảng phân đoạn 50kDa. Tốc độ
bơm mẫu đầu vào lần lượt là 150rPhần mềm & 200rPhần mềm và điều chỉnh sao cho áp suất trên bề mặt
màng không quá 5 Psi. Thu dịch qua lọc và xác định hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt độ
tương ứng.
3. KẾT QUẢ & BÀN LUẬN
3.1. Hoạt độ chung và hoạt độ riêng của chế phẩm pectinase thô (CP E)
Hình 1. Đồ thị tương quan giữa thời gian nuôi cấy và hoạt độ của enzyme thô
Quá trình sinh tổng hợp pectinase trên môi trường có chất cảm ứng là pectin của bột cà rốt
bởi chủng Aspergillus niger có hoạt độ cao nhất sau 48 giờ (30,01UI/g CP E).
Hình 2. Đồ thị tương quan giữa thời gian nuôi cấy và hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme thô
Science & Technology Development, Vol 11, No.08 - 2008
Trang 48
Quá trình sinh tổng hợp pectinase trên môi trường có chất cảm ứng của chủng Aspergillus
niger có hoạt độ riêng cao nhất sau 72 giờ đạt 8,97.10-2 (UI/mg protein).
Dựa vào 2 đồ thị ta thấy, hoạt độ chung giữa thời gian nuôi cấy 48 giờ và 72 giờ chênh
lệch nhau khá nhiều (30,01 & 25,02UI/g CP E). Trong khi đó, hoạt độ riêng giữa thời gian
nuôi cấy 48 giờ và 72 giờ chênh lệch nhau không nhiều (8,26.10-2 & 8,97.10-2 UI/mg
protein). Do đó, chúng tui quyết định thu nhận enzyme pectinase sau 48 giờ nuôi cấy và sau đó
đem tiến hành tinh sạch.
3.2. Phân tích chế phẩm enzyme pectinase bằng phương pháp lọc gel Bio Gel P 30
Dung dịch enzyme xử lý theo mục 2.5, kết quả sau khi lọc gel với tốc độ chảy qua cột
30ml/giờ thu được 2 peak chính (hình 3a). Trong đó, hoạt độ pectinase tập trung chủ yếu ở
peak I, peak II không có hoạt độ. Hiệu suất thu hồi enzyme đạt 71,96% và hoạt độ cao hơn 1,1
lần so với trước khi lọc gel.
Khi giảm tốc độ chảy qua cột xuống 15ml/giờ kết quả thu được 4 peak (hình 3b). Hoạt độ
pectinase tập trung hầu hết ở peak I. Hiệu suất thu nhận hồi enzyme sau khi giảm tốc độ lọc
đạt 59,02% và hoạt độ cao hơn trước khi lọc gel 1,65 lần.
a-tốc độ: 30ml/giờ b-tốc độ: 15ml/giờ
Hình 3. Đồ thị tương quan giữa giá trị OD 280nm với các phân đoạn của dung dịch enzyme sau khi lọc
gel
Khi giảm tốc độ chảy xuống 15ml/h thì các phân tử protein nằm trong hạt gel bị rửa giải
chậm hơn. Khi đó, các phân tử khác không nằm trong hạt gel sẽ bị rửa giải ra khỏi cột nhanh
hơn và dẫn đến hàm lượng protein có hoạt độ pectinase tăng. Hiệu suất thu hồi enzyme khi lọc
với tốc độ 15ml/giờ thấp hơn hiệu suất thu hồi enzyme qua lọc với tốc độ 30ml/giờ do khả
năng tách protein tạp khi lọc với tốc độ thấp thì tốt hơn.
3.3. Tinh sạch chế phẩm enzyme pectinase bằng phương pháp lọc màng
Chúng tui sử dụng bộ lọc membrane có kích thước phân đoạn rộng 50kDa cho kết quả
như sau:
Sau khi lọc dung dịch enzyme như mục 2.6, kết quả thu được khi lọc với tốc độ bơm
150rPhần mềm thu dịch qua lọc. Kết quả thu được hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt độ đạt 27,87% và
87,98%, độ tinh sạch tăng 3,1 lần. Khi tăng tốc độ bơm lên 200rPhần mềm thì hiệu suất thu hồi
enzyme và hiệu suất hoạt độ đạt 33,33% và 73,65%, độ tinh sạch chỉ tăng 2,2 lần.
Nguyên nhân là khi tăng tốc độ bơm 200 rmp thì áp suất đầu vào tăng (5,2Psi) làm cho
dòng chảy trong bộ lọc chuyển động rối, các phân tử sẽ va đập mạnh vào nhau và đẩy chúng
vào thành bộ lọc kết quả hình thành một màng mỏng xung quanh thành bộ lọc (hay còn gọi là
lớp trở lực). Mặt khác dưới tác dụng của lực ly tâm trong dòng chảy sẽ đẩy một số phân tử
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 11, ...