arc_ngothanhhai
New Member
Download miễn phí Sự glycosyl hóa protein ở Eukaryote
Saccharomyces cerevisae and Pichia pastoris đang ngày càng được sử dụng rộng rãi
trong việc sản xuất các glycoprotein dược phẩm bởi dễ
thao tác, dễ sản xuất với quy mô lớn, chi phí sản xuất thấp và chu kỳ
sảnxuất ngắn. Một ưu điểm khác là chúng có khả năng tạo ra các kiểu
mẫu glycosyl hóa giống nhau và đã được hiểu rõ vai trò của phần carbonhydrate
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
Sự glycosyl hóa protein ởEukaryote
Các glycoprotein chiếm thị phần
chính trên thị trường các protein
dược phẩm. Hầu hết các protein
này đều được sản xuất bởi công
nghệ protein tái tổ hợp nhờ vào
việc sử dụng các hệ thống biểu hiện
như vi khuẩn, nấm men, tế bào
động vật. Hệ thống biểu hiện của
nấm men và tế bào động vật có
nhiều ưu điểm trong sản xuất các
protein tái tổ hợp. Ở sinh vật nhân
chuẩn, các protein thường được
biến đổi sau quá trình dịch mã, điều
này có liên quan mật thiết đến hoạt
tính của các protein. Sự glycosyl
hóa là sự biến đổi thông dụng nhất
trong các hệ thống này và nó cần
thiết cho các chức năng của protein
như sự nhận diện, sự truyền tín
hiệu, sự tương tác giữa các protein
và tế bào. Vì vậy, bộ máy glycosyl
hóa của các hệ thống này là một
vấn đề rất quan trọng mà chúng ta
cần hiểu khi biểu hiện một
protein nào đó.
1. Các dạng glycosyl hóa protein
1.1. Glycosyl hóa protein ở vị trí N
Sự glycosyl hóa protein ở vị trí N là
quá trình biến đổi sau dịch mã được
bảo tồn ở nấm men và các
eukaryote khác. Glycosyl hoá ở vị
trí N bắt đầu từ mạng lưới nội chất
(ER) với sự chuyển chuỗi
oligosaccharide vào vị trí
asparagine của một protein [19,20].
Vị trí gắn bao gồm trình tự ba axit
amin là Asn-Xaa-Ser/Thr nơi mà vị
trí thứ hai không phải là Pro. Chuỗi
oligosaccharide này chứa 3 phân tử
đường glucose ở đuôi không khử
của cấu trúc lõi Man9GlcNAc2 gắn
vào protein và nó bị cắt bởi các
enzyme glucosidase của lưới nội
chất và enzyme α-1,2 mannosidase
và đi vào bộ máy Golgi .
Cơ chế glycosyl hóa ở vị trí N:
- Glc3Man9GlcNAc2 được tập hợp
ở mạng lưới nội chất nhám và được
biến đổi thành Man8GlcNAc2.
- Sự cắt bỏ bớt các phân tử đường
diễn ra trong Golgi bởi các enzyme
mannosidase tạo thành
Man5GlcNAc2 để tổng hợp các
oligosaccharide phức tạp hay hình
thành các oligomannoside.
- Sự chuyển thành dạng đa anten
phức tạp xảy ra ở thuỳ giữa của
Golgi và trans-Golgi, có hay
không có đuôi sialic acid, và từ đó
protein được tiết ra môi trường
ngoại bào.
1.2. Glycosyl hóa ở vị trí O
Sự glycosyl hóa ở vị trí O là việc
tạo liên kết cộng hóa trị giữa một
monosaccharide với axit amin Ser
hay Thr. Tính đặc hiệu của trình tự
cho thấy Glycosyl hoá ở vị trí O
không quyết định sự gấp cuộn và
tính tan của protein. Dạng phổ biến
của hiện tượng glycosyl hoá ở vị trí
O ở người thường xảy ra ở Golgi ,
liên quan tới sự chuyển GalNAc từ
UDP-GalNAc sang axit amin Ser
hay Thr thông qua hoạt động của
enzyme GalNAc transferase kéo
theo sự chuyển của hàng hoạt các
phân tử đường khác nhau như
galactose, GalNAc, and N-GlcNAc,
fucose, glucose, mannose,
hydroxyproline…
2. Sự glycosyl hóa protein ở tế
bào động vật có vú
Các tế bào động vật có vú (như tế
bào CHO, tế bào myeloma, tế bào
HEK) đang được ưa chuộng bởi vì
bộ máy glycosyl hoá của chúng rất
giống ở người, mặc dù các phân tử
đường được gắn vào protein không
hoàn toàn giống ở người, chúng
vẫn được bán trên thị trường.
Các protein được glycosyl hóa ở vị
trí N đều có cấu trúc nhánh chuẩn
bao gồm mannose, galctose, N-
acetylglucosamine (GlcNAc) và
axit neuramic. Các protein được
glycosyl hóa ở vị trí O thì bao gồm
một số lượng phân tử đường khác
nhau bao gồm galactose, N-
acetylglucosamine, N-
acetylgalactosamine, axit sialic và
axit neuramic.
Kiểu mẫu glycosyl hóa các protein
dược phẩm được sản xuất bởi hệ
thống tế bào động vật có vú là khác
nhau và thay đổi theo từng mẻ. Vì
vậy, sự đa dạng này phải được
kiểm tra lâm sàng và tiền lâm sàng.
Trong thực tế, các kiểu mẫu
glycosyl hóa này có thể được thay
đổi bằng cách tối ưu hóa quy trình
lên men, sử dụng các enzyme biến
đổi, hay tạo ra những hệ thống
biểu hiện được làm giàu hay loại
bỏ những dạng gắn phân tử đường
đặc biệt nào đó.
3. Sự glycosyl hóa protein ở hệ
thống nấm men
Saccharomyces
cerevisae and Pichia pastoris đang
ngày càng được sử dụng rộng rãi
trong việc sản xuất các
glycoprotein dược phẩm bởi dễ
thao tác, dễ sản xuất với quy mô
lớn, chi phí sản xuất thấp và chu kỳ
sản xuất ngắn. Một ưu điểm khác là
chúng có khả năng tạo ra các kiểu
mẫu glycosyl hóa giống nhau và đã
được hiểu rõ vai trò của phần
carbonhydrate.
Các protein được glycosyl hóa ở vị
trí N trong S. cerevisiae có đặc
điểm phân nhánh rất nhiều và mang
rất nhiều đường mannose. Trong
khi các protein được glycosyl hóa ở
vị trí O chỉ bao gồm nhiều nhất là 5
phân tử mannose.
Sự glycosyl hóa ở vị trí N
trong Pichia hầu hết bao gồm chuỗi
ManGlcNAc, giống với kiểu
glycosyl hóa protein điển hình
trong tế bào động vật có
vú. In Pichia, the outer
oligosaccharide chain of secreted
proteins is mostly unaltered and
consists of Man8–9GlcNAc2. Mặc
dù có nhiều sự khác nhau về số
lượng và độ phức tạp của sự kiểu
glycosyl hóa liên kết với N được
thấy, nhưng chúng vẫn có chứa
trình tự bảo tồn nhận biết cho sự
khởi đầu sự glycosyl hóa, Asn-Xaa-
Ser/Thr.
Ở Pichia có sự gắn chuỗi
oligosaccharide tại vị trí O nhưng
nó không phải là thành phần quan
trọng của các glycoprotein tan. Sự
gắn chuỗi oligosaccharide chỉ bao
gồm các phân tử mannose. Tuy
nhiên, số lượng mannose trên một
chuỗi, các liên kết tạo ra, tần số và
tính đặc hiệu của sự glycosyl hóa ở
vị trí O trong Pichia pastoris vẫn
chưa xác định được. Chúng ta
không nên thừa nhận rằng một
protein không bị glycosyl hóa ở vị
trí O trong tế bào chủ tự nhiên thì
sẽ không bị glycosyl hóa
trong Pichia.
4. Các enzyme dùng cho nghiên
cứu về glycoprotein
Các enzyme thường được sử dụng
trong những nghiên cứu về cấu trúc
đường của các glycoprotein:
Enzyme Loại enzyme Sự đặc hiệu
Endoglycosidase D
Endo Cắt các phân
tử glycan chứa
nhiều mannose
Endoglycosidase F
Endo Cắt các phân
tử glycan chứa
nhiều mannose
Endoglycosidase H
Endo Cắt các phân
tử glycan chứa
nhiều mannose
β-galactosidase
Exo Loại bỏ các
enzyme
galactosidase
khỏi Gal-β1, 5,
8, 9
3-GlcNAc;
Gal-β1,4-
GlcNAc;
Galβ1,3
GalNAc
N-glycosidase F Endo
Các
glycoprotein
giữa Asn và
GlcNAc
Stalidases
(Neuraminidases)
Exo NeuAc-α2,6-
Gal; NeuAc-
α2,6-GlcNAc;
2
or NeuAc-
α2,3-Ga
5. Kết luận
Glycosyl hóa là một quá trình phức
tạp và đa dạng trong các sinh vật
nhân chuẩn. Vì vậy, nó không thể
khái quát hóa theo những kiểu mẫu
glycosyl hóa chuẩn. Trước khi biểu
hiện một protein tái tổ hợp, chúng
ta nên hiểu rõ hệ thống biểu hiện và
phải nắm được mục đích sử dụng
của sản phẩm.
Các nhà khoa học đang cố gắng tạo
ra các chủng vi sinh vật mới có khả
năng tổng hợp các glycoprotein với
cấu trúc giống với khi chúng được
tổng hợp ở người. Gần đây, nhóm
nghiên cứu của Roland Contreras ở
trường đại học Ghent, Bỉ và
Tillman Gerngross ở trường
Glycofi, Boston, Mỹ đã báo cáo về
việc tạo ra được chủng Pichia
pastoris có khả năng sản xuất
protein với kiểu gắn mannose giống
với ở con người. Nhóm nghiên cứu
này hy vọng sẽ có thể tạo ra được
chủng Pichia pastoris có khả năng ...