Download miễn phí Khóa luận Ứng dụng kỹ thuật Multiplex – PCR để phát hiện một số gen độc lực của nhóm escherichia coli sản sinh độc tố shiga (STEC) phân lập được từ phân bò, heo tiêu chảy và thịt bò
MỤC LỤC
TRANG
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Summary v
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt ix
Danh sách các bảng x
Danh sách các sơ đồ, biểu đồ, hình xi
1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu – yêu cầu 2
1.2.1. Mục tiêu 2
1.2.2. Yêu cầu 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Vi khuẩn E. coli 3
2.1.1 Đặc điểm sinh học 3
2.1.2. Yếu tố kháng nguyên 3
2.1.3. Phân loại E. coli 4
2.2. Shiga toxigenic E. coli (STEC) 5
2.2.1.Thuật ngữ 5
2.2.2. Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh của STEC 6
2.2.2.1. Độc tố Shiga (Stx) 6
2.2.2.2. Enterohemolysin 8
2.2.2.3. Yếu tố bám dính 8
2.2.3. Cách sinh bệnh 9
2.2.4. Khía cạnh lâm sàng 10
2.2.5. Dịch tễ học 11
2.2.6. Chẩn đoán 12
2.2.7. Phòng ngừa 12
2.3. Serotype O157:H7 12
2.4. Kỹ thuật PCR 14
2.4.1. Khái niệm 14
2.4.2. Nguyên tắc 14
2.4.3. Các thành phần cần thiết của phản ứng PCR 15
2.4.4. Phân tích kết quả PCR 16
2.4.5 Multiplex – PCR 16
2.4.6. Ứng dụng 16
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 18
3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện 18
3.1.1. Thời gian 18
3.1.2. Địa điểm 18
3.2. Nội dung thực hiện 18
3.3. Phương pháp thực hiện 18
3.3.1 Vật liệu thí nghiệm cơ bản . 18
3.3.2. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu 19
3.3.2. Nuôi cấy và phân lập E. coli 19
3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy 19
3.3.2.2. Qui trình phân lập, định tính 19
(1) Nuôi cấy và phân lập 19
(2) Chọn khuẩn lạc E. coli 20
(3) Thử sinh hóa 20
3.3.3. Ly trích DNA 20
3.3.4. Qui trình multiplex – PCR 22
3.3.5. Điện di, đọc kết quả 23
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
4.1. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò tiêu chảy 24
4.2. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo con cai sữa tiêu chảy 26
4.3. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bê tiêu chảy 28
4.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ bề mặt thịt bò 29
4.5 Tổng kết kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trên các mẫu khảo sát có nguồn gốc từ bò và heo 31
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34
5.1. Kết luận 34
5.2. Tồn tại và đề nghị 34
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 36
7. PHỤ LỤC 41
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
nh O:H phổ rộng. Karmali (1989) đã liệt kê 32 serogroup O (tương đương với 60 tuýp O:H khác nhau). Trên khắp thế giới, các dòng STEC thuộc serotype O157:H- là nguyên nhân chính gây bệnh cho người. Việc phân lập các serotype này thường dựa vào khả năng không lên men sorbitol nên đã góp phần đánh giá quá cao tỉ lệ mắc phải nhóm này so với các serotype khác. Khi một tuýp được phân lập là O157, có lẽ có khuynh hướng bỏ qua tầm quan trọng tiềm năng gây bệnh của các tuýp khác. Trong khi đó, các serotype STEC không thuộc O157:H7 cũng là nguyên nhân nổi bật gây bệnh cho người.Nguồn lây nhiễm: Nhiều cuộc điều tra dịch tễ đã chứng minh rằng các dòng STEC hiện diện trong đường ruột của nhiều loài vật nuôi như bò, cừu, heo, dê, chó, mèo (Beutin và ctv, 1995) và cả ngựa (Chalmer và ctv, 1997). Do đó, STEC tồn lưu trong gia súc chính là nguồn quan trọng gây bệnh cho người, và nguồn quan trọng nhất là từ trâu bò.
STEC lây truyền qua người chủ yếu bằng con đường thực phẩm, nước và từ người qua người. Cụ thể, STEC có thể xâm nhập vào chuỗi sản xuất thực phẩm cho con người từ nguồn gốc vật nuôi, vấy nhiễm thông thường nhất cho thịt là phân hay các thành phần trong ruột sau khi hạ thịt (Paton và Paton, 1998).
Truyền lây STEC giữa người và người xảy ra trong các đợt bộc phát bệnh. Thời gian bài thải O157 qua phân là 2 – 4 tuần, nhưng khoảng 13% bệnh nhân thải O157 hơn một tháng và triệu chứng bệnh không biểu hiện trong giai đoạn sau. Như vậy nguy cơ truyền lây giữa người – người là cao (Keene và ctv, 1994).
2.2.6. Chẩn đoán
Có những khó khăn liên quan đến chẩn đoán cảm nhiễm do STEC. Trong giai đoạn đầu, STEC tồn tại nhiều trong phân; có nhiều trường hợp, STEC chiếm trên 90% quần thể vi sinh vật hiếu khí (Paton và ctv, 1996). Tuy nhiên, lúc bệnh thuyên giảm, số lượng này giảm nhanh cực kỳ. Đối với những bệnh nhân HUS, triệu chứng dạ dày ruột có thể chỉ xuất hiện một tuần hay nhiều tuần, và ở thời điểm này số lượng STEC hiện diện trong phân rất ít. Trong vài trường hợp, tiêu chảy không kéo dài và nếu lấy bệnh phẩm qua trực tràng thì số lượng sẽ hạn chế. Vì những lí do này, yêu cầu của phương pháp chẩn đoán thích hợp phải nhạy, nhanh và đòi hỏi khối lượng mẫu tối thiểu. Các qui trình chẩn đoán thường tập trung vào việc phát hiện Stx, đặc biệt là Stx trong phân. Do các qui trình khác nhau về tính phức tạp, thời gian, độ nhạy, tính chuyên biệt và giá thành, vì vậy phải có chiến lược chẩn đoán thích hợp tùy hoàn cảnh và nguồn mẫu (Paton và Paton, 1998).
2.2.7. Phòng ngừa
E. coli gây bệnh theo phân ra ngoài và phát tán trong đất, nước, không khí. Ngoài ra, bệnh có thể lây truyền từ người sang người do tay bẩn, thực phẩm và nước uống bị nhiễm. Do đó, bệnh có thể gây thành dịch, đặc biệt ở nhà trẻ, khoa nhi của bệnh viện và người già.
Vì vậy, phòng bệnh chủ yếu là tuân thủ nghiêm ngặt qui chế vệ sinh, chú ý xử lý phân và công cụ của bệnh nhân. Không nên ăn những loại thực phẩm không đảm bảo chất lượng, đặc biệt là sản phẩm từ thịt chưa nấu chín vì chúng có thể là nguồn truyền nhiễm STEC. Có thể xác định chỉ số E. coli trong nước để xem nước có nhiễm bẩn hay không.
2.3. Serotype O157:H7
Theo thống kê về tình hình các ổ dịch bệnh do nhiễm phải STEC thì hầu hết các trường hợp đều do serotype O157:H7 gây ra (Nataro và Kaper, 1998). Điều này cho thấy serotype này nguy hiểm hơn, dễ lây lan bệnh hơn so với các serotype khác. Lần đầu tiên, serotype O157:H7 được phân lập và định danh vào năm 1982. E. coli O157:H7 ngày càng có tác động lớn ở Mỹ và châu Âu. Hàng năm, ở Mỹ có trên 73000 ca ngộ độc thực phẩm do nhiễm phải O157:H7, trong đó có 61 trường hợp tử vong. Nguyên nhân do ăn phải thịt bò chưa nấu chín hay đã bị vấy nhiễm, do uống sữa tươi hay do truyền lây giữa người và người sau khi đi bơi trong các hồ đã bị nhiễm (USA Department of Agriculture’s Food safety and Inspection Service, 2004). Từ đó, người ta xem O157:H7 là nguyên nhân phổ biến nhất cho HC và HUS.
Serotype này có một số đặc điểm khác biệt so với các serotype E. coli khác:
- Nhạy cảm với nhiệt độ, không phát triển được ở nhiệt độ 44 – 44,50C (Jay, 2000).
- Không có khả năng lên men D-sorbitol trong 24 giờ. Trong khi đó có đến 75 – 94% những dòng E. coli khác lại lên men sorbitol. Do đó, người ta thay thế môi trường MacConkey có lactose bằng SMAC chọn lọc chứa 1% sorbitol để phân lập (Smith và Scotland, 1993).
- Không biểu hiện hoạt tính b-D-glucuronidase (GUD): Điểm khác biệt về sinh hóa của dòng O157:H7 là không cho GUD dương tính, trong khi đó khoảng 90 – 95% chủng E. coli cho GUD dương tính. Và người ta dựa vào đặc tính này để phân biệt O157:H7 với các dòng E. coli khác (Monday và ctv, 2001).
GUD là enzyme xúc tác sự thủy phân b-D-glucuronide thành rượu và glucuronate. Mặc dù không biểu hiện GUD nhưng các serotype O157:H7 vẫn mang đoạn gen uid hoàn chỉnh (gồm cả vùng điều hòa) trên nhiễm sắc thể. Kiểu hình đặc trưng này là do đã xảy ra các đột biến trên gen uid. Hầu hết các đột biến trên uid ở O157:H7 là đột biến thoái hóa, ví dụ như đột biến điểm thay thế T bằng G ở vị trí 92 so với E. coli thuộc chủng hoang dại (wild-type) (Feng và Lampel, 1994) hay đột biến do sự chèn thêm hai base G-G ở vị trí +686 trên uid ở serotype O157:H7 (Monday và ctv, 2001). Tóm lại, những đột biến này có thể ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của GUD, O157:H7 vẫn sản sinh GUD nhưng GUD bị bất hoạt, không thực hiện chức năng thủy phân của nó được. Và điều này vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn.
- Kháng kháng sinh: cefixime, sulfivoxazol, tetracycline, streptomycine và các tác nhân ức chế khác như potassium tellurite (ức chế các VSV thông thường) (Kim và ctv, 1994).
- Tính kháng acid (acid resistance - AR) đóng vai trò quan trọng cho khả năng sống sót của vi khuẩn trong môi trường acid. E. coli O157:H7 có khả năng sống sót trong môi trường acid từ pH = 2 đến pH = 7. Chẳng hạn, O157:H7 sống đến 56 ngày ở pH >= 4 trong môi trường TBS (Tryptic Soybean Broth), ngoài ra nó không phát triển ít nhất 5 giờ ở pH 3 -2,5 khi nhiệt độ 37oC trong môi trường canh Luria có điều chỉnh pH bằng HCl (trích dẫn bởi Jay, 2000). Đặc tính kháng acid này do gen rpoS qui định. Có 3 hệ thống AR khác nhau (Foster, 2004):
(1) Hệ thống AR1: chỉ hoạt động khi tế bào tăng trưởng trong môi trường yếm khí với sự vắng mặt của glucose.
(2) Hệ thống AR2: hoạt động phụ thuộc vào sự có mặt của glutamate.
(3) Hệ thống AR3: hoạt động phụ thuộc vào sự có mặt của arginine.
Ba hệ thống này hoạt động suốt quá trình tăng trưởng ở pha cân bằng (stationery phase) của vi khuẩn.
- Khả năng chịu mặn: Trong canh khuẩn 4,5% NaCl, vi khuẩn tăng số lượng gấp 3 lần khi tăng thời gian lên 2 lần, và không phát triển khi ³8,5% NaCl (Jay, 2000).
2.4. Kỹ thuật PCR
2.4.1. Khái niệm
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 đã và đang được sử dụng rộng rãi. Đây là một phương pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào.
2.4.2. Nguyên tắc
Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA, là phản ứng gồm nhiều chu kì nối tiếp nhau. Mỗi chu kì gồm 3 bước:
Bước 1: là giai đoạn biến tí...