Download miễn phí Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định một số loài sâm thuộc chi panax
Một loạt kỹ thuật sinh học phân tử đã được dùng để nghiên cứu đa dạng di
truyền của chi Panax như random amplified polymorphism DNA
(RAPD)(11), amplified fragment length polymorphism (AFLP)(4), PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)(3), arbitrarily
primed PCR (AP-PCR) (10), direct amplification of length polymorphism
(DALP)(5), inter-simple sequence repeat (ISSR)(6) và giải trình tự(2).
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ XÁC ĐỊNH MỘTSỐ LOÀI SÂM THUỘC CHI PANAX
TÓM TẮT
Mở đầu: Nhân sâm được dùng trong y học phương Đông hàng ngàn năm.
Rễ của nhân sâm có tác dụng tăng khả năng thích ứng của cơ thể, tăng hiệu
quả điều trị bệnh tiểu dường type II, kích thích ham muốn tình dục, tăng cường
sức khỏe và điều trị tiểu đường cũng như rối loạn tình dục ở nam giới. Sâm
thường được bán dưới dạng rễ khô hay cắt lát. Các loại sâm khác nhau thì hoạt
tính cũng khác nhau. Do đó cần một phương pháp khoa học để xác định các
loại sâm ở mức phân tử.
Mục tiêu: Xây dựng các phương pháp thuận tiện và có độ lặp lại cao để xác
định các loài sâm thuốc chi Panax và nguồn gốc của chúng.
Phương pháp: Chúng tui dùng phương pháp giải trình tự, PCR-Restriction
Fragment Length Polymorphic (PCR-RFLP) trên vùng ITS và 18S, và
Random Amplified Microsatellite (RAMS).
Kết quả: Phân tích trình tự vùng ITS có thể được dùng để xác định các loài
sâm. Ngoài ra, kỹ thuật RFLP có thể giúp phân biệt nguồn gốc của chúng.
Kết luận: Các phương pháp phân tử đã sử dụng thích hợp để xác định và
phân biệt các mẫu sâm.
Từ khóa: PCR-RFLP, sâm, RAMS, di truyền học.
ABSTRACT
AUTHENTICATION OF GINSENG SPECIES BY BIOMOLECULAR
METHODS
Nguyen Thanh Thuan, Vu Thanh Thao, Nguyen Van Thanh, Tran Cat Dong
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 1 - 2010: 129-133
Background: Ginseng has been used in folk medicine for thousands of years.
Its root is taken as adaptogens, aphrodisiacs, nourishing stimulant and in the
treatment of type II diabetes, as well as sexual dysfunction in men. The root is
most often available in dried form, either whole or sliced. Different ginsengs
have different active substances and effects. Therefore, a scientific method of
identifying ginseng cultivars at the molecular level is required.
Objectives: To develop some convenient and reproducible approaches for
differentiation between Panax species and their sources.
Methods: Using sequence analysis, PCR-Restriction Fragment Length
Polymorphic (PCR-RFLP) with primers rDNA 18S and ITS, and Random
Amplified Microsatellite (RAMS).
Results: Sequence analysis of ITS region can be used for identification at
species level. RFLP method can differentiate the origin of samples.
Conclusions: These methods were useful for identifying and differentiation
ginseng samples
Keywords: PCR-RFLP, gingseng, RAMS, genetics
M Ở ĐẦU
Nhân sâm là một loại thuốc bổ, đóng vai trò quan trọng trong việc dự phòng
và điều trị những bệnh lý mạn tính, cần điều trị dài ngày như bệnh tiểu
đường, ung thư, bệnh xơ vữa động mạch, huyết khối, cao lipid máu, cao
huyết áp, thiểu năng tuần hoàn não… do tác dụng tăng cường thể lực và gia
tăng sức tự đề kháng không dặc hiệu của cơ thể, tác dụng chống oxi hóa một
cách trực tiếp hay gián tiếp. Y học hiện đại đã chứng minh Nhân sâm duy trì
sự hằng định nội môi của hệ thần kinh trung ương, hệ nội tiết và hệ miễn
dịch. Tuy các tác dụng trị liệu không điển hình, tương đối yếu so với các
thuốc đặc trị Tây y nhưng việc ít gây tác dụng phụ khi sử dụng dài ngày,
nhất là ở những đối tượng tượng bệnh nhân cao tuổi là ưu điểm của Nhân
sâm(1).
Một loạt kỹ thuật sinh học phân tử đã được dùng để nghiên cứu đa dạng di
truyền của chi Panax như random amplified polymorphism DNA
(RAPD)(11), amplified fragment length polymorphism (AFLP)(4), PCR-
restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)(3), arbitrarily
primed PCR (AP-PCR) (10), direct amplification of length polymorphism
(DALP)(5), inter-simple sequence repeat (ISSR)(6) và giải trình tự(2).
Trong bộ gen thực vật, các gen RNA ribosome (rDNA) được sắp xếp trong
những đơn vị lặp lại nối tiếp nhau với mỗi đơn vị gồm 18S rDNA-ITS1-5.8S
rDNA-ITS2-26S rDNA. Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo tồn cao hơn
hai vùng ITS.
Một kỹ thuật khác dựa trên PCR là random amplified microsatellite (RAMS).
Kỹ thuật RAMS là sự kết hợp đặc tính phân tích RAPD và vùng vi vệ tinh.
Bản chất của kỹ thuật này là các dấu ấn được phát hiện khi khuếch đại hai
vùng vi vệ tinh ngẫu nhiên cùng với trình tự xen giữa hai vùng này. Phương
pháp này có độ lặp lại cao và cho phép phát hiện đa hình của DNA trong
cùng một loài hay giữa các loài(7).
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Các mẫu sâm
Các mẫu sâm tươi hay khô được thu mua từ các nguồn sau: các mẫu P. ginseng
được mua ở Việt Nam (Pg1, Pg2) và Hàn Quốc (Pg3, Pg4); P. quinquefolius L.
(Pq), P. notoginseng (Pn1, Pn2) và P. vietnamensis (Pv) từ Việt Nam.
Tách chiết DNA.
Tách chiết DNA từ các mẫu Panax theo phương pháp của Manian được biến
đổi (9). Thành tế bào được phá vỡ bằng cách làm lạnh trong nitơ lỏng và
nghiền mịn trong cối sứ. Màng tế bào được phá vỡ bằng cách ủ trong đệm
chiết ở 65oC trong 30 phút. Sau đó, DNA được chiết bằng hỗn hợp
chloroform-isoamyl alcohol (24:1). Tủa DNA bằng isopropanol và rửa bằng
ethanol 70%. DNA được hòa tan lại trong 100l TE.
Thực hiện PCR-RFLP.
Vùng ITS được khuếch đại với cặp mồi chung ITS_AF (5’- GGA AGG
AGA AGT CGT AAC AAG G -3’) và ITS_BR (5’- CTT TTC CTC CGC
TTA TTG ATA TG -3’) (8). Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích
là 25l gồm 1M/mồi (IDT); 1U Taq polymerase (BioLabs); 0,4mM dNTP
(BioLabs); 1X PCR buffer (BioLabs); 2mM MgCl2 (BioLabs). Chu trình
phản ứng là 1 chu kỳ: 94oC 5 phút; 30 chu kỳ: 94oC 30 giây, 45oC 1 phút,
72oC 1 phút; 1 chu kỳ: 72oC 7 phút.
Vùng 18S cũng được khuếch đại với cặp mồi chung 18SCOM_F (5’- TGC
ATG GCC GTT CTT AGT TGG TGG -3’) và 18SCOM_R (5’- CAC CTA
CGG AAA CCT TGT TAC GAC -3’) (12). Phản ứng PCR được thực hiện
với tổng thể tích là 25l gồm 0,4M/mồi (IDT); 1U Taq polymerase
(BioLabs); 0,4mM dNTP (BioLabs); 1X PCR buffer (BioLabs); 2mM
MgCl2 (BioLabs). Chu trình phản ứng là 94oC 5 phút / 35 chu kỳ 94oC 30
giây, 52oC 30 giây, 72oC 1 phút / 72oC 7 phút.
Sản phẩm PCR được tinh chế qua cột Promega Wizard® SV Gel and PCR
Clean-Up System và cắt bằng hỗn hợp enzyme HaeIII và HindIII (BioLabs)
trong 1 giờ ở 37oC. Sản phẩm cắt được điện di trên gel polyacrylamide 15%.
Giải trình tự
Các sản phẩm PCR được giải trình tự bởi công ty Macrogen (Hàn Quốc).
Kết quả được BLAST trên NCBI để tìm các trình tự tương đồng
Thực hiện RAMS
Các mồi cho phản ứng RAMS: RAMS1 (ACA)5, RAMS2 (CCA)5, RAMS3
(CGA)5, RAMS4 (GT)5G (7). Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể
tích là 25l gồm 5ng DNA khuôn; 0,5M/mồi (IDT); 1U Taq polymerase
(BioLabs); 0,2mM dNTP (BioLabs); 1X PCR buffer (BioLabs); 2mM
MgCl2 (BioLabs). Chu trình phản ứng là 95oC 5 phút / 35 chu kỳ gồm 95oC
30 giây; 38,5oC (RAMS1), 53oC (RAMS2), 53oC (RAMS3), 33,5oC
(RAMS4) 45 giây; 72oC 2 phút / 72oC 7 phút. Sản phẩm PCR được điện di
trên gel agarose 1%.
Phân tích kết quả
Sản phẩm điện di được chụp hình bằng máy Dolphin (Wealtec Corp.). Phân
tích kết quả bằng phần mềm BioNumerics 3.0 để tạo cây phát sinh loài làm căn
cứ phân biệt.
K ẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
PCR với cặp mồi ITS cho sản phẩm có kích thước phù hợp với đoán
trong khoảng 750bp. Riêng các mẫu Pg1 và Pg2 không cho sản phẩm. Còn
cặp mồi 18S cho sản phẩm khoảng 500bp nhưng mẫu Pn2 không cho sản
phẩm.
Kết quả giải trình tự và BLAST trên NCBI cho thấy các mẫu đều thuộc chi
Panax. Tuy nhiên, kết quả trên vùng 18S không thể phân biệt ở mức loài. Điều
này có thể là do sự bảo tồn cao của vùng này giữa các loài có quan hệ gần.
Dựa vào kết ...