tthanhtu2702
New Member
Download miễn phí Luận văn Áp dụng phương pháp VNTR – MIRU định kiểu gene các chủng mycobacterium tuberculosis phân lập tại Việt Nam
MỤC LỤC
Trang
Lời Thank
Mục lục
Danh mục bảng
Danh mục hình
Danh mục chữviết tắt
Lời mở đầu . 1
Mục tiêu đềtài 2
Tính cấp thiết, ý nghĩa lí luận và thực tiễn của đềtài . 3
1. Tổng quan tài liệu 4
1.1. Bệnh lao 4
1.1.1. Bệnh lao xét ởmức độtoàn cầu và ởViệt Nam 4
1.1.1.1. Gánh nặng bệnh lao trên thếgiới 4
1.1.1.2. Gánh nặng bệnh lao ởViệt Nam 4
1.1.2. Phân loại bệnh lao 5
1.1.2.1. Lao phổi AFB(+) 5
1.1.2.2. Lao phổi AFB (-) 5
1.1.2.3. Lao ngoài phổi 6
1.1.3. Phân loại và đặc điểm vi khuẩn lao . 6
1.1.3.1. Phân loại . 6
1.1.3.2. Các đặc điểm sinh học cơbản của mycobacteria 10
1.1.4. Bộgene vi khuẩn lao . 15
1.1.4.1. Cấu trúc bộgene vi khuẩn lao 15
1.1.4.2. Cơchếtiến hoá chung của vi khuẩn lao và chiến lược xuất hiện đa
dạng di truyền của vi khuẩn lao 16
1.2. Các kĩthuật sinh học phân tửxác định kiểu gene vi khuẩn lao 17
1.2.1. Các kĩthuật sinh học phân tửphổbiến hiện nay trong tình hình nghiên
cứu tại Việt Nam . 17
1.2.2. Kĩthuật dựa trên Variable Number of Tandem Repeats – Mycobacterial
Interspersed Repetitive Unit 21
1.2.3. Các thông sốchung để đánh giá và kiểm định phương pháp định kiểu
gene . 23
1.2.3.1. Khảnăng thực hiện . 23
1.2.3.2. Sựtiện lợi 23
1.3. Nghiên cứu dịch tễphân tửtrên M.tuberculosis (đặc biệt kiểu gene Beijing) . 24
1.3.1. Những đặc điểm di truyền xác định M.tuberculosis họBeijing 25
1.3.2. Dịch tễhọc họBeijing . 26
1.3.3. Những kết quảban đầu trong nghiên cứu lâm sàng họBeijing . 28
2. Vật liệu và phương pháp . 29
2.1. Đối tượng nghiên cứu . 29
2.2. Kỹthuật sinh học phân tửxác định kiểu gene dựa trên VNTR – MIRU . 29
2.2.1. Khuếch đại trình tự đích 30
2.2.1.1. Nguyên tắc . 30
2.2.1.2. Tiến hành 30
2.2.2. Điện di mao quản . 31
2.2.3. Xửlí thông tin thu nhận được 33
3. Kết quả . 35
3.1. Tối ưu hóa một số điều kiện phản ứng trong phương pháp VNTR –
MIRU định kiểu gene các chủng Mycobacterium tuberculosis phân lập tại
Việt Nam . 35
3.2. Đánh giá mức độáp dụng của kỹthuật định kiểu gene dựa trên VNTRMIRU 38
3.2.1. Khảnăng định kiểu gene (Typability) . 44
3.2.2. Độlặp lại của kỹthuật (Reproducibility) . 44
3.2.3. Allelic diversity: Chỉsốphân biệt đểtính độ đa dạng kiểu gene dựa trên
từng vịtrí VNTR . 45
3.2.4. Độphân giải của kỹthuật (Discriminatory power) . 46
4. Thảo luận . 51
4.1. Áp dụng phương pháp VNTR – MIRU 51
4.2. Tính ổn định của phương pháp . 52
4.3. Giá trịcủa phương pháp trong bối cảnh dịch tễ, lâm sàng . 53
5. Kết luận và Đềnghị . 55
Danh mục công trình tác giả 57
Tài liệu tham khảo
Phụlục
Để tải bản Đầy Đủ của tài liệu, xin Trả lời bài viết này, Mods sẽ gửi Link download cho bạn sớm nhất qua hòm tin nhắn.
Ai cần download tài liệu gì mà không tìm thấy ở đây, thì đăng yêu cầu down tại đây nhé:
Nhận download tài liệu miễn phí
Tóm tắt nội dung tài liệu:
iển hình Mycobacterium tuberculosis và vi khuẩn laokhông điển hình (non-tuberculous mycobacteria), có thể có tên khác bao gồm
MOTT (mycobacteria other than tubercle) và mycobacteria trong môi trường. Nếu
xét về hình thái học, đặc điểm lâm sàng, dấu hiệu X-quang, dấu hiệu mô học thì
2 nhóm này không có gì khác nhau rõ rệt. Tuy nhiên, hai nhóm vi khuẩn lao
này lại khác nhau đáng kể khi đề cập về tình trạng nhiễm trùng, sinh hoá, sinh
học phân tử, sự nhạy cảm với thuốc điều trị lao, khả năng gây bệnh, đáp ứng điều
trị hiệu quả của điều trị dự phòng.
~ 10 ~
………………………………………………………………………………………………….
Hiện nay, chủng vi khuẩn lao được các nhà di truyền học phân loại như sau: [the
Comprehensive Microbial Resource webpage -
scripts/CMR/CmrHomePage.cgi ]
Giới Vi khuẩn
Ngành Actinobacteria
Lớp Actinobacteridae
Bộ Actinomycetales
Họ Corynebacterineae
Chi Mycobacteriaceae
Loài Mycobacterium tuberculosis
1.1.3.2. Các đặc điểm sinh học cơ bản của mycobacteria (20)
Mycobacteria thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, mặc dù chúng nhuộm màu yếu
vì cấu trúc thành tế bào đặc biệt. Chúng hiếu khí, không sinh bào tử và không di
động. Mycobacteria không có plasmid, nhiều mycobacteriophage đã được phân
lập.
M.tb là trực khuẩn dài 3-5 μm, ngang 0,3-0,5 μm, không có lông mao, hai đầu
tròn, có tính chất kháng cồn kháng toan. Trên tiêu bản nhuộm bằng phương
pháp Ziehl-Neelsen, các AFB bắt màu đỏ fuchsin, phân bố thành cụm hay
đứng riêng rẽ (hình 1.2 A,B,C).
Không chỉ như các vi khuẩn khác có peptidoglycan ở vách tế bào, vách vi khuẩn
kháng cồn kháng toan Mycobacterium chứa nhiều glycolipid, đặc biệt là các
mycolic acid. Phía ngoài màng sinh chất, vách M.tb gồm lớp peptidoglycan
gắn với arabinogalactan (D-arabinose và D-galactose) và kết hợp với các mycolic
acid. Lớp arabinogalactan/mycolic acid nằm dưới lớp polypeptide và các mycolic
acid gồm lipid tự do, các glycolipid, và các peptidoglycolipid. Các glycolipid
gồm lipoarabinomannan (LAM) và phosphatidyinositol mannoside (PIM)
(hình 1.2 D). Các peptidoglycan, mycolic acid và glycolipid ngăn cản hoá chất
thấm qua vách, vì vậy làm cho vi sinh vật sinh sản chậm và dễ kháng thuốc, khó
bị thực bào tiêu diệt hơn các vi khuẩn khác.
~ 11 ~
………………………………………………………………………………………………….
Hình 1.2: A. nhuộm Ziehl-Neelse,trực khuẩn M.tb đỏ B. nhuộm
auramine,trực khuẩn M.tb vàng-cam C. M.tb qua kính hiển vi điện tử D. Lớp vỏ
của vi khuẩn kháng cồn kháng toan
Phân tử mycolic acid và phân đoạn peptidoglycan gắn với các thụ thể đặc hiệu
trên bề mặt đại thực bào vật chủ, làm cho đại thực bào tiết ra các cytokine như
tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) gây phản ứng viêm tiêu diệt M.tb.
Điều kiện sống của vi khuẩn lao (20)
Ở điều kiện bình thường vi khuẩn lao sinh sản chậm (trung bình 20-24
giờ/chu kì). Vi khuẩn nằm ở vùng tổn thương có khi hàng tháng không bị chết,
khi gặp điều kiện thuận lợi chúng lại phát triển. Cách sinh sản của vi khuẩn
thông thường là phân đôi tế bào, nhưng M.tb có thể sinh sản theo kiểu bào tử
giống như nấm.
Trong không khí, khi không có các yếu tố bất lợi, vi khuẩn có thể tồn tại 3-4
tháng. Trong phòng thí nghiệm vi khuẩn có thể được bảo quản trong nhiều năm ở
-70oC. Dưới ánh nắng mặt trời vi khuẩn chết sau 1,5 giờ. Khi chiếu tia cực tím
chúng chỉ tồn tại được 2-3 phút. Ở 42oC, vi khuẩn ngừng phát triển và chết sau 10
phút ở 80oC. Đàm của bệnh nhân lao sau 3 tháng trong phòng tối, ẩm vẫn còn vi
~ 12 ~
………………………………………………………………………………………………….
khuẩn tồn tại và giữ được độc lực, đun sôi đàm trong 5 phút M.tb chết, với cồn
90oC vi khuẩn tồn tại được 3 phút, trong acid phenic 5% vi khuẩn chết ngay sau 1
phút.
Để vi khuẩn lao có thể phát triển thuận lợi, trong điều kiện phòng thí nghiệm, môi
trường nuôi cấy phải giàu chất dinh dưỡng như môi trường Lowenstein-Jensen.
Bên cạnh đó, M.tb phát triển tốt nhất ở môi trường có pH 6,2-7,2, chúng cũng có
thể phát triển được trong môi trường pH acid 5,5, kiềm 8,0. Vi khuẩn lao có thể
phát triển ở 29-42oC (thuận lợi nhất là 37-38oC). Sau khi nuôi cấy 4-6 tuần trong
môi trường LJ có thể quan sát được khuẩn lạc.
Cơ chế M.tb xâm nhập và gây bệnh (18)
Vi khuẩn lao tồn tại trong các hạt khí dung nhỏ lơ lửng ngoài không khí. Khi
được hít vào, vi khuẩn sẽ đi vào phổi, đến phế nang. Tại đây, vi khuẩn sẽ nhân
lên hay bị ức chế tuỳ từng trường hợp vào tình trạng hệ thống miễn dịch của cơ thể.
Trong vòng 2-10 tuần, các đại thực bào được hoạt hoá, bao quanh vi khuẩn tạo
nên lớp vỏ cứng giúp kềm hãm và kiểm soát vi khuẩn (giai đoạn lao nhiễm).
Nếu hệ thống miễn dịch của cơ thể không thể kiểm soát được vi khuẩn, vi
khuẩn sẽ nhân lên nhanh chóng và có thể theo đường máu và đường bạch huyết
tấn công vào các bộ phận khác nhau như phổi, thận, não, xương (giai đoạn lao
bệnh).
Trong lao màng não, trực khuẩn lao theo đường máu đến màng não. Sau giai
đoạn tiềm tàng, yên lặng trong nhiều tuần, nhiều tháng hay nhiều năm, trực
khuẩn lao phát triển thành các hạt lao, củ lao. Khi có kích thích như kích thích
do chấn thương, tình trạng miễn dịch thay đổi, trực khuẩn lao và các kháng
nguyên chứa trong các củ lao được giải phóng vào các khoang màng não gây
bệnh.
Các yếu tố của M.tb độc tính đối với vật chủ (18)
Mycobacterium tuberculosis không có các độc tố thường thấy như ở các vi
khuẩn khác như chất độc, vỏ ngoài (capsules fimbriae). Tuy nhiên, nhiều đặc
điểm về cấu trúc, sinh lý của loại vi khuẩn này biểu hiện độc tính vi khuẩn và khả
~ 13 ~
………………………………………………………………………………………………….
năng sinh bệnh lao.
M.tb có cơ chế đặc biệt để tấn công vào tế bào. Trực khuẩn lao có thể gắn
trực tiếp vào thụ thể mannose trên đại thực bào nhờ glycolipid đã được
mannose hoá trên vách (cell wall-associated mannosylated glycolipid), LAM
(lipoarabinomannan), hay gắn gián tiếp nhờ thụ thể bổ thể, thụ thể Fc. Thông
thường khi vật lạ bị đại thực bào bắt giữ sẽ bị cơ chế thực bào qua trung gian
chất oxy hoá tiêu diệt. M.tb biến đổi cơ chế gây độc này, ngăn cản sự kết hợp
phagosome với lysosome. Vách Mycobacterium có loại mycolic acid là lipid
chuyên biệt nhánh alpha, những phân tử kị nước mạnh, hình thành lớp vỏ lipid
bao quanh vi sinh vật , ảnh hưởng đến khả năng thấm vật chất qua bề mặt tế
bào. Cho đến nay người ta cho rằng mycolic acid là nhân tố chính quyết định
độc tính của M.tb, có thể nhờ đó mycobacteria tránh được các protein tích
điện dương, lysozyme và các gốc tự do trong các hốc thực bào, giúp
mycobacteria ngoại bào thoát khỏi sự tấn công của các bổ thể trong huyết thanh.
Một trong những sản phẩm liên kết mycolic acid với các chất lipid phức tạp là
cord factor - yếu tố gây độc đối với tế bào động vật hữu nhũ. Chủng M.tb
độc tính sinh ra rất nhiều nhân tố thừng này (Cord factor).
Yếu tố quyết định khả năng M.tb lây truyền (18)
Về mặt dịch tễ học, những bệnh nhân lao phổi khác nhau thì khả năng lây
bệnh cho người khác cũng kh...