phamhoangquyet2007
New Member
Download Đề tài Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng
Mức độ gia tăng dân số nhanh chóng đã đẩy toàn nhân loại phải đối mặt với thách thức lớn lao, đó là khắc phục sự đói nghèo. Vấn đề làm sao để tăng sản lượng nông nghiệp, cung cấp lương thực ổn định cho con người luôn là mối quan tâm đặc biệt của nhiều quốc gia trên thế giới. Tình hình lương thực bấp bênh còn khá phổ biến ở nhiều nơi. Bên cạnh những nguyên nhân chính như nông nghiệp chưa được coi trọng đúng mức, đất đai chưa được sử dụng hợp lý, thì sâu bệnh, đặc biệt là côn trùng, là một trong những tác nhân gây thiệt hại chủ yếu cho mùa màng. Theo thống kê của Dean & Adang [65], Oerke & đtg [154], những tổn thất mùa màng nghiêm trọng trên toàn cầu do sâu bệnh gây ra ước tính chiếm từ 35 đến 42% tổng sản lượng nông nghiệp hàng năm, trong đó thiệt hại do côn trùng chiếm từ 13-16%. Mức độ thiệt hại có khi lên tới 70% nếu như cây trồng không được áp dụng các biện pháp bảo vệ.
Hiện nay, rất nhiều loại thuốc trừ sâu hoá học đang được sử dụng để phòng trừ sâu bệnh với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây độc hại cho sức khoẻ con người, vật nuôi. Để cải thiện tình hình này, chúng ta cần ứng dụng những kỹ thuật tiên tiến trong bảo vệ cây trồng nhằm xây dựng một nền nông nghiệp sạch, bền vững. Việc tạo ra các giống cây trồng biến đổi di truyền (Genetically Modified Crops, GMOs) có khả năng kháng sâu bệnh và côn trùng nói riêng nhờ kỹ thuật tạo dòng phân tử, kỹ thuật chuyển gen thực vật được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng và đem lại lợi ích tối đa cho nền nông nghiệp. Hơn nữa, các tiến bộ đạt được còn khắc phục được những hạn chế khi sử dụng các biện pháp trừ sâu hoá học cũng như các biện pháp sinh học truyền thống, nâng mức độ an toàn cho con người, vật nuôi và cải thiện môi trường sinh thái. Bằng các kỹ thuật di truyền mới này, triển vọng tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính mong muốn trong thời gian tương đối ngắn đã trở thành hiện thực. Đến nay hàng loạt gen mã hoá protein có hoạt tính diệt côn trùng gây hại (gen kháng côn trùng) như gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hoá các chất ức chế proteaza và ỏ-amylaza được chuyển vào thực vật nhờ các phương pháp thích hợp với sản phẩm là những cây trồng có khả năng tự kháng sâu bệnh.
Trên thế giới, khá nhiều phương pháp chuyển gen thực vật đã được nghiên cứu và áp dụng thành công, như phương pháp vi tiêm, sử dụng súng bắn gen, xung điện. Trong đó, phương pháp có giá trị thực tiễn cao và được sử dụng rộng rãi nhất là phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens. Với ưu điểm như ít tốn kém, dễ áp dụng trên các đối tượng cây trồng nên phương pháp này rất phù hợp với điều kiện của các nước đang phát triển như Việt Nam [1]. Nhiều nơi trên thế giới, kỹ thuật chuyển và biểu hiện gen kháng côn trùng nói riêng và gen có lợi nói chung vào cây trồng thông qua phương pháp này đã và đang là công cụ hỗ trợ chính trong chọn giống thực vật. Ở nước ta, nghiên cứu chuyển gen thực vật mới chỉ bắt đầu, chủ yếu tại các phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học và Viện Sinh học Nhiệt đới (thuộc Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia), Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằng sông Cửu Long (thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn). Hầu hết các nghiên cứu sử dụng gen chỉ thị và một số gen khác trên các vectơ plasmit được thiết kế sẵn. Tuy nhiên, phần lớn các vectơ tái tổ hợp và các kết cấu gen được các nhà sáng chế và công ty/ cơ quan đăng ký sở hữu trí tuệ dưới dạng các sáng chế hay các giải pháp hữu ích. Về khía cạnh sở hữu trí tuệ, để được quyền sử dụng mỗi thành phần trong vectơ tái tổ hợp, thông thường người nhận phải liên lạc với các nhà sáng chế, cơ quan hay công ty sở hữu để ký các hợp đồng chuyển giao nguyên liệu (Material Transfer Agreement, MTA). Qua các hợp đồng này, chúng ta thường chỉ được sử dụng nguyên liệu cho mục đích nghiên cứu với rất nhiều ràng buộc về khía cạnh xuất bản, sản phẩm nghiên cứu, sở hữu, chuyển giao. Rõ ràng, để có được những vectơ mang gen tái tổ hợp có giá trị do nước ngoài thiết kế, bên cạnh những chi phí lớn, còn có nhiều khó khăn phức tạp trong chuyển giao nguyên liệu và công nghệ. Do vậy, một yêu cầu cấp bách đặt ra là chúng ta phải tự thiết kế được các vectơ chuyển gen thực vật nói chung và vectơ mang đoạn khởi động đặc hiệu để điều khiển biểu hiện gen kháng côn trùng nhằm mục đích chuyển và biểu hiện các gen này trong các đối tượng cây trồng ở nước ta.
++ Ai muốn tải bản DOC Đầy Đủ thì Trả lời bài viết này, mình sẽ gửi Link download cho!
Mức độ gia tăng dân số nhanh chóng đã đẩy toàn nhân loại phải đối mặt với thách thức lớn lao, đó là khắc phục sự đói nghèo. Vấn đề làm sao để tăng sản lượng nông nghiệp, cung cấp lương thực ổn định cho con người luôn là mối quan tâm đặc biệt của nhiều quốc gia trên thế giới. Tình hình lương thực bấp bênh còn khá phổ biến ở nhiều nơi. Bên cạnh những nguyên nhân chính như nông nghiệp chưa được coi trọng đúng mức, đất đai chưa được sử dụng hợp lý, thì sâu bệnh, đặc biệt là côn trùng, là một trong những tác nhân gây thiệt hại chủ yếu cho mùa màng. Theo thống kê của Dean & Adang [65], Oerke & đtg [154], những tổn thất mùa màng nghiêm trọng trên toàn cầu do sâu bệnh gây ra ước tính chiếm từ 35 đến 42% tổng sản lượng nông nghiệp hàng năm, trong đó thiệt hại do côn trùng chiếm từ 13-16%. Mức độ thiệt hại có khi lên tới 70% nếu như cây trồng không được áp dụng các biện pháp bảo vệ.
Hiện nay, rất nhiều loại thuốc trừ sâu hoá học đang được sử dụng để phòng trừ sâu bệnh với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây độc hại cho sức khoẻ con người, vật nuôi. Để cải thiện tình hình này, chúng ta cần ứng dụng những kỹ thuật tiên tiến trong bảo vệ cây trồng nhằm xây dựng một nền nông nghiệp sạch, bền vững. Việc tạo ra các giống cây trồng biến đổi di truyền (Genetically Modified Crops, GMOs) có khả năng kháng sâu bệnh và côn trùng nói riêng nhờ kỹ thuật tạo dòng phân tử, kỹ thuật chuyển gen thực vật được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng và đem lại lợi ích tối đa cho nền nông nghiệp. Hơn nữa, các tiến bộ đạt được còn khắc phục được những hạn chế khi sử dụng các biện pháp trừ sâu hoá học cũng như các biện pháp sinh học truyền thống, nâng mức độ an toàn cho con người, vật nuôi và cải thiện môi trường sinh thái. Bằng các kỹ thuật di truyền mới này, triển vọng tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính mong muốn trong thời gian tương đối ngắn đã trở thành hiện thực. Đến nay hàng loạt gen mã hoá protein có hoạt tính diệt côn trùng gây hại (gen kháng côn trùng) như gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hoá các chất ức chế proteaza và ỏ-amylaza… được chuyển vào thực vật nhờ các phương pháp thích hợp với sản phẩm là những cây trồng có khả năng tự kháng sâu bệnh.
Trên thế giới, khá nhiều phương pháp chuyển gen thực vật đã được nghiên cứu và áp dụng thành công, như phương pháp vi tiêm, sử dụng súng bắn gen, xung điện. Trong đó, phương pháp có giá trị thực tiễn cao và được sử dụng rộng rãi nhất là phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens. Với ưu điểm như ít tốn kém, dễ áp dụng trên các đối tượng cây trồng nên phương pháp này rất phù hợp với điều kiện của các nước đang phát triển như Việt Nam [1]. Nhiều nơi trên thế giới, kỹ thuật chuyển và biểu hiện gen kháng côn trùng nói riêng và gen có lợi nói chung vào cây trồng thông qua phương pháp này đã và đang là công cụ hỗ trợ chính trong chọn giống thực vật. Ở nước ta, nghiên cứu chuyển gen thực vật mới chỉ bắt đầu, chủ yếu tại các phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học và Viện Sinh học Nhiệt đới (thuộc Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia), Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằng sông Cửu Long (thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn). Hầu hết các nghiên cứu sử dụng gen chỉ thị và một số gen khác trên các vectơ plasmit được thiết kế sẵn. Tuy nhiên, phần lớn các vectơ tái tổ hợp và các kết cấu gen được các nhà sáng chế và công ty/ cơ quan đăng ký sở hữu trí tuệ dưới dạng các sáng chế hay các giải pháp hữu ích. Về khía cạnh sở hữu trí tuệ, để được quyền sử dụng mỗi thành phần trong vectơ tái tổ hợp, thông thường người nhận phải liên lạc với các nhà sáng chế, cơ quan hay công ty sở hữu để ký các hợp đồng chuyển giao nguyên liệu (Material Transfer Agreement, MTA). Qua các hợp đồng này, chúng ta thường chỉ được sử dụng nguyên liệu cho mục đích nghiên cứu với rất nhiều ràng buộc về khía cạnh xuất bản, sản phẩm nghiên cứu, sở hữu, chuyển giao... Rõ ràng, để có được những vectơ mang gen tái tổ hợp có giá trị do nước ngoài thiết kế, bên cạnh những chi phí lớn, còn có nhiều khó khăn phức tạp trong chuyển giao nguyên liệu và công nghệ. Do vậy, một yêu cầu cấp bách đặt ra là chúng ta phải tự thiết kế được các vectơ chuyển gen thực vật nói chung và vectơ mang đoạn khởi động đặc hiệu để điều khiển biểu hiện gen kháng côn trùng nhằm mục đích chuyển và biểu hiện các gen này trong các đối tượng cây trồng ở nước ta.
Trên cơ sở ý nghĩa lý luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này, chúng tui đã tiến hành đề tài: “Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng”, với các mục đích và nội dung nghiên cứu chính sau đây:
Môc ®Ých nghiªn cøu
Sö dông c¸c kü thuËt sinh häc ph©n tö vµ c«ng nghÖ gen ®Ó nghiªn cøu c¸c ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt vµ gen cã ho¹t tÝnh kh¸ng c«n trïng. Trªn c¬ së ®ã, thiÕt kÕ c¸c vect¬ Ti-plasmit vµ t¹o chñng A. tumefaciens phôc vô c«ng nghÖ chuyÓn gen nh»m môc ®Ých n©ng cao tÝnh kh¸ng s©u bÖnh cña c©y trång.
Néi dung nghiªn cøu
Su tËp vµ ph©n lËp c¸c ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt vµ gen cã ho¹t tÝnh kh¸ng c«n trïng.
ThiÕt kÕ c¸c vect¬ Ti-plasmit mang gen kh¸ng c«n trïng díi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng c¬ ®Þnh hoÆc ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt trong tÕ bµo E. coli.
T¹o c¸c chñng A. tumefaciens mang c¸c vect¬ Ti-plasmit chøa gen kh¸ng c«n trïng ®Ó chuyÓn vµo c©y trång.
ThiÕt kÕ vect¬ vµ biÓu hiÖn gen kh¸ng c«n trïng trong tÕ bµo E. coli.
T¹o kh¸ng thÓ kh¸ng protein cã ho¹t tÝnh diÖt c«n trïng phôc vô cho nghiªn cøu vµ gi¸m ®Þnh c©y chuyÓn gen.
Nh÷ng ®ãng gãp míi cña luËn ¸n
B¶n luËn ¸n nµy cã nh÷ng ®ãng gãp míi vÒ khoa häc vµ thùc tiÔn nh sau:
§· nh©n, t¹o dßng vµ ®äc tr×nh tù ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza (sucrose synthase) ë gièng lóa C71 cã kh¶ n¨ng ®iÒu khiÓn sù biÓu hiÖn gen ®Æc hiÖu ë bã m¹ch. §©y lµ ®o¹n khëi ®éng gen ®Çu tiªn ®îc ph©n lËp vµ ®äc tr×nh tù tõ mét gièng lóa ViÖt Nam. Tr×nh tù cña ®o¹n khëi ®éng nµy ®· ®îc ®¨ng ký trong c¸c Ng©n hµng tr×nh tù gen quèc tÕ.
§· t¹o ®îc mét kÕt cÊu gen míi ®ã lµ gen cryIA(c) díi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu bã m¹ch C71S-P nh»m môc ®Ých chuyÓn vµo c¸c gièng lóa ViÖt Nam t¹o kh¶ n¨ng kh¸ng s©u ®ôc th©n lóa.
§· thiÕt kÕ thµnh c«ng 4 vect¬ Ti-plasmit míi, cung cÊp nguyªn liÖu cho c¸c nghiªn cøu chuyÓn gen vµo c©y trång vµ nghiªn cøu ®o¹n khëi ®éng. Trong ®ã, gen cryIA(c) díi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng Ubiquitin hoÆc ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë gièng lóa C71 ®· ®îc ®a vµo vect¬ Ti-plasmit c¶i tiÕn vµ vect¬ chuyÓn gen thÕ hÖ míi nhÊt sö dông hÖ thèng chän läc tÝch cùc (Positive Selection System).
§· hoµn thiÖn vµ sö dông ph¬ng ph¸p xung ®iÖn vµ ph¬ng ph¸p phèi ba bè mÑ ®Ó t¹o 4 chñng A. tumefaciens míi, trªn c¬ së c¸c chñng LBA4404 vµ EHA105, mang c¸c vect¬ Ti-plasmit chøa gen kh¸ng c«n trïng ®Ó chuyÓn vµo c©y trång.
LÇn ®Çu tiªn trong ®iÒu kiÖn ViÖt N...
Download Đề tài Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng miễn phí
Mức độ gia tăng dân số nhanh chóng đã đẩy toàn nhân loại phải đối mặt với thách thức lớn lao, đó là khắc phục sự đói nghèo. Vấn đề làm sao để tăng sản lượng nông nghiệp, cung cấp lương thực ổn định cho con người luôn là mối quan tâm đặc biệt của nhiều quốc gia trên thế giới. Tình hình lương thực bấp bênh còn khá phổ biến ở nhiều nơi. Bên cạnh những nguyên nhân chính như nông nghiệp chưa được coi trọng đúng mức, đất đai chưa được sử dụng hợp lý, thì sâu bệnh, đặc biệt là côn trùng, là một trong những tác nhân gây thiệt hại chủ yếu cho mùa màng. Theo thống kê của Dean & Adang [65], Oerke & đtg [154], những tổn thất mùa màng nghiêm trọng trên toàn cầu do sâu bệnh gây ra ước tính chiếm từ 35 đến 42% tổng sản lượng nông nghiệp hàng năm, trong đó thiệt hại do côn trùng chiếm từ 13-16%. Mức độ thiệt hại có khi lên tới 70% nếu như cây trồng không được áp dụng các biện pháp bảo vệ.
Hiện nay, rất nhiều loại thuốc trừ sâu hoá học đang được sử dụng để phòng trừ sâu bệnh với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây độc hại cho sức khoẻ con người, vật nuôi. Để cải thiện tình hình này, chúng ta cần ứng dụng những kỹ thuật tiên tiến trong bảo vệ cây trồng nhằm xây dựng một nền nông nghiệp sạch, bền vững. Việc tạo ra các giống cây trồng biến đổi di truyền (Genetically Modified Crops, GMOs) có khả năng kháng sâu bệnh và côn trùng nói riêng nhờ kỹ thuật tạo dòng phân tử, kỹ thuật chuyển gen thực vật được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng và đem lại lợi ích tối đa cho nền nông nghiệp. Hơn nữa, các tiến bộ đạt được còn khắc phục được những hạn chế khi sử dụng các biện pháp trừ sâu hoá học cũng như các biện pháp sinh học truyền thống, nâng mức độ an toàn cho con người, vật nuôi và cải thiện môi trường sinh thái. Bằng các kỹ thuật di truyền mới này, triển vọng tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính mong muốn trong thời gian tương đối ngắn đã trở thành hiện thực. Đến nay hàng loạt gen mã hoá protein có hoạt tính diệt côn trùng gây hại (gen kháng côn trùng) như gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hoá các chất ức chế proteaza và ỏ-amylaza được chuyển vào thực vật nhờ các phương pháp thích hợp với sản phẩm là những cây trồng có khả năng tự kháng sâu bệnh.
Trên thế giới, khá nhiều phương pháp chuyển gen thực vật đã được nghiên cứu và áp dụng thành công, như phương pháp vi tiêm, sử dụng súng bắn gen, xung điện. Trong đó, phương pháp có giá trị thực tiễn cao và được sử dụng rộng rãi nhất là phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens. Với ưu điểm như ít tốn kém, dễ áp dụng trên các đối tượng cây trồng nên phương pháp này rất phù hợp với điều kiện của các nước đang phát triển như Việt Nam [1]. Nhiều nơi trên thế giới, kỹ thuật chuyển và biểu hiện gen kháng côn trùng nói riêng và gen có lợi nói chung vào cây trồng thông qua phương pháp này đã và đang là công cụ hỗ trợ chính trong chọn giống thực vật. Ở nước ta, nghiên cứu chuyển gen thực vật mới chỉ bắt đầu, chủ yếu tại các phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học và Viện Sinh học Nhiệt đới (thuộc Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia), Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằng sông Cửu Long (thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn). Hầu hết các nghiên cứu sử dụng gen chỉ thị và một số gen khác trên các vectơ plasmit được thiết kế sẵn. Tuy nhiên, phần lớn các vectơ tái tổ hợp và các kết cấu gen được các nhà sáng chế và công ty/ cơ quan đăng ký sở hữu trí tuệ dưới dạng các sáng chế hay các giải pháp hữu ích. Về khía cạnh sở hữu trí tuệ, để được quyền sử dụng mỗi thành phần trong vectơ tái tổ hợp, thông thường người nhận phải liên lạc với các nhà sáng chế, cơ quan hay công ty sở hữu để ký các hợp đồng chuyển giao nguyên liệu (Material Transfer Agreement, MTA). Qua các hợp đồng này, chúng ta thường chỉ được sử dụng nguyên liệu cho mục đích nghiên cứu với rất nhiều ràng buộc về khía cạnh xuất bản, sản phẩm nghiên cứu, sở hữu, chuyển giao. Rõ ràng, để có được những vectơ mang gen tái tổ hợp có giá trị do nước ngoài thiết kế, bên cạnh những chi phí lớn, còn có nhiều khó khăn phức tạp trong chuyển giao nguyên liệu và công nghệ. Do vậy, một yêu cầu cấp bách đặt ra là chúng ta phải tự thiết kế được các vectơ chuyển gen thực vật nói chung và vectơ mang đoạn khởi động đặc hiệu để điều khiển biểu hiện gen kháng côn trùng nhằm mục đích chuyển và biểu hiện các gen này trong các đối tượng cây trồng ở nước ta.
++ Ai muốn tải bản DOC Đầy Đủ thì Trả lời bài viết này, mình sẽ gửi Link download cho!
Tóm tắt nội dung:
MỞ ĐẦUMức độ gia tăng dân số nhanh chóng đã đẩy toàn nhân loại phải đối mặt với thách thức lớn lao, đó là khắc phục sự đói nghèo. Vấn đề làm sao để tăng sản lượng nông nghiệp, cung cấp lương thực ổn định cho con người luôn là mối quan tâm đặc biệt của nhiều quốc gia trên thế giới. Tình hình lương thực bấp bênh còn khá phổ biến ở nhiều nơi. Bên cạnh những nguyên nhân chính như nông nghiệp chưa được coi trọng đúng mức, đất đai chưa được sử dụng hợp lý, thì sâu bệnh, đặc biệt là côn trùng, là một trong những tác nhân gây thiệt hại chủ yếu cho mùa màng. Theo thống kê của Dean & Adang [65], Oerke & đtg [154], những tổn thất mùa màng nghiêm trọng trên toàn cầu do sâu bệnh gây ra ước tính chiếm từ 35 đến 42% tổng sản lượng nông nghiệp hàng năm, trong đó thiệt hại do côn trùng chiếm từ 13-16%. Mức độ thiệt hại có khi lên tới 70% nếu như cây trồng không được áp dụng các biện pháp bảo vệ.
Hiện nay, rất nhiều loại thuốc trừ sâu hoá học đang được sử dụng để phòng trừ sâu bệnh với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây độc hại cho sức khoẻ con người, vật nuôi. Để cải thiện tình hình này, chúng ta cần ứng dụng những kỹ thuật tiên tiến trong bảo vệ cây trồng nhằm xây dựng một nền nông nghiệp sạch, bền vững. Việc tạo ra các giống cây trồng biến đổi di truyền (Genetically Modified Crops, GMOs) có khả năng kháng sâu bệnh và côn trùng nói riêng nhờ kỹ thuật tạo dòng phân tử, kỹ thuật chuyển gen thực vật được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng và đem lại lợi ích tối đa cho nền nông nghiệp. Hơn nữa, các tiến bộ đạt được còn khắc phục được những hạn chế khi sử dụng các biện pháp trừ sâu hoá học cũng như các biện pháp sinh học truyền thống, nâng mức độ an toàn cho con người, vật nuôi và cải thiện môi trường sinh thái. Bằng các kỹ thuật di truyền mới này, triển vọng tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính mong muốn trong thời gian tương đối ngắn đã trở thành hiện thực. Đến nay hàng loạt gen mã hoá protein có hoạt tính diệt côn trùng gây hại (gen kháng côn trùng) như gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hoá các chất ức chế proteaza và ỏ-amylaza… được chuyển vào thực vật nhờ các phương pháp thích hợp với sản phẩm là những cây trồng có khả năng tự kháng sâu bệnh.
Trên thế giới, khá nhiều phương pháp chuyển gen thực vật đã được nghiên cứu và áp dụng thành công, như phương pháp vi tiêm, sử dụng súng bắn gen, xung điện. Trong đó, phương pháp có giá trị thực tiễn cao và được sử dụng rộng rãi nhất là phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens. Với ưu điểm như ít tốn kém, dễ áp dụng trên các đối tượng cây trồng nên phương pháp này rất phù hợp với điều kiện của các nước đang phát triển như Việt Nam [1]. Nhiều nơi trên thế giới, kỹ thuật chuyển và biểu hiện gen kháng côn trùng nói riêng và gen có lợi nói chung vào cây trồng thông qua phương pháp này đã và đang là công cụ hỗ trợ chính trong chọn giống thực vật. Ở nước ta, nghiên cứu chuyển gen thực vật mới chỉ bắt đầu, chủ yếu tại các phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học và Viện Sinh học Nhiệt đới (thuộc Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia), Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằng sông Cửu Long (thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn). Hầu hết các nghiên cứu sử dụng gen chỉ thị và một số gen khác trên các vectơ plasmit được thiết kế sẵn. Tuy nhiên, phần lớn các vectơ tái tổ hợp và các kết cấu gen được các nhà sáng chế và công ty/ cơ quan đăng ký sở hữu trí tuệ dưới dạng các sáng chế hay các giải pháp hữu ích. Về khía cạnh sở hữu trí tuệ, để được quyền sử dụng mỗi thành phần trong vectơ tái tổ hợp, thông thường người nhận phải liên lạc với các nhà sáng chế, cơ quan hay công ty sở hữu để ký các hợp đồng chuyển giao nguyên liệu (Material Transfer Agreement, MTA). Qua các hợp đồng này, chúng ta thường chỉ được sử dụng nguyên liệu cho mục đích nghiên cứu với rất nhiều ràng buộc về khía cạnh xuất bản, sản phẩm nghiên cứu, sở hữu, chuyển giao... Rõ ràng, để có được những vectơ mang gen tái tổ hợp có giá trị do nước ngoài thiết kế, bên cạnh những chi phí lớn, còn có nhiều khó khăn phức tạp trong chuyển giao nguyên liệu và công nghệ. Do vậy, một yêu cầu cấp bách đặt ra là chúng ta phải tự thiết kế được các vectơ chuyển gen thực vật nói chung và vectơ mang đoạn khởi động đặc hiệu để điều khiển biểu hiện gen kháng côn trùng nhằm mục đích chuyển và biểu hiện các gen này trong các đối tượng cây trồng ở nước ta.
Trên cơ sở ý nghĩa lý luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này, chúng tui đã tiến hành đề tài: “Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng”, với các mục đích và nội dung nghiên cứu chính sau đây:
Môc ®Ých nghiªn cøu
Sö dông c¸c kü thuËt sinh häc ph©n tö vµ c«ng nghÖ gen ®Ó nghiªn cøu c¸c ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt vµ gen cã ho¹t tÝnh kh¸ng c«n trïng. Trªn c¬ së ®ã, thiÕt kÕ c¸c vect¬ Ti-plasmit vµ t¹o chñng A. tumefaciens phôc vô c«ng nghÖ chuyÓn gen nh»m môc ®Ých n©ng cao tÝnh kh¸ng s©u bÖnh cña c©y trång.
Néi dung nghiªn cøu
Su tËp vµ ph©n lËp c¸c ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt vµ gen cã ho¹t tÝnh kh¸ng c«n trïng.
ThiÕt kÕ c¸c vect¬ Ti-plasmit mang gen kh¸ng c«n trïng díi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng c¬ ®Þnh hoÆc ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt trong tÕ bµo E. coli.
T¹o c¸c chñng A. tumefaciens mang c¸c vect¬ Ti-plasmit chøa gen kh¸ng c«n trïng ®Ó chuyÓn vµo c©y trång.
ThiÕt kÕ vect¬ vµ biÓu hiÖn gen kh¸ng c«n trïng trong tÕ bµo E. coli.
T¹o kh¸ng thÓ kh¸ng protein cã ho¹t tÝnh diÖt c«n trïng phôc vô cho nghiªn cøu vµ gi¸m ®Þnh c©y chuyÓn gen.
Nh÷ng ®ãng gãp míi cña luËn ¸n
B¶n luËn ¸n nµy cã nh÷ng ®ãng gãp míi vÒ khoa häc vµ thùc tiÔn nh sau:
§· nh©n, t¹o dßng vµ ®äc tr×nh tù ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza (sucrose synthase) ë gièng lóa C71 cã kh¶ n¨ng ®iÒu khiÓn sù biÓu hiÖn gen ®Æc hiÖu ë bã m¹ch. §©y lµ ®o¹n khëi ®éng gen ®Çu tiªn ®îc ph©n lËp vµ ®äc tr×nh tù tõ mét gièng lóa ViÖt Nam. Tr×nh tù cña ®o¹n khëi ®éng nµy ®· ®îc ®¨ng ký trong c¸c Ng©n hµng tr×nh tù gen quèc tÕ.
§· t¹o ®îc mét kÕt cÊu gen míi ®ã lµ gen cryIA(c) díi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu bã m¹ch C71S-P nh»m môc ®Ých chuyÓn vµo c¸c gièng lóa ViÖt Nam t¹o kh¶ n¨ng kh¸ng s©u ®ôc th©n lóa.
§· thiÕt kÕ thµnh c«ng 4 vect¬ Ti-plasmit míi, cung cÊp nguyªn liÖu cho c¸c nghiªn cøu chuyÓn gen vµo c©y trång vµ nghiªn cøu ®o¹n khëi ®éng. Trong ®ã, gen cryIA(c) díi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng Ubiquitin hoÆc ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë gièng lóa C71 ®· ®îc ®a vµo vect¬ Ti-plasmit c¶i tiÕn vµ vect¬ chuyÓn gen thÕ hÖ míi nhÊt sö dông hÖ thèng chän läc tÝch cùc (Positive Selection System).
§· hoµn thiÖn vµ sö dông ph¬ng ph¸p xung ®iÖn vµ ph¬ng ph¸p phèi ba bè mÑ ®Ó t¹o 4 chñng A. tumefaciens míi, trªn c¬ së c¸c chñng LBA4404 vµ EHA105, mang c¸c vect¬ Ti-plasmit chøa gen kh¸ng c«n trïng ®Ó chuyÓn vµo c©y trång.
LÇn ®Çu tiªn trong ®iÒu kiÖn ViÖt N...