anhchang_thichdua1992
New Member
Download miễn phí Luận văn Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào của một số hợp chất lignan và stilbene
MỤC LỤC
Trang phụ bìa .
Lời Cảm Ơn . I
MỤC LỤC . II
DANH MỤC CÁC BẢNG . VII
DANH MỤC CÁC HÌNH . VIII
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ . IX
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ . X
1. Giới thiệu đề tài . 1
2. Giới thiệu một số phƣơng pháp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa . 3
2.1 Khái niệm về gốc tự do . 3
2.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể . 3
2.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể . 4
2.4 Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa . 6
2.4.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH . 6
2.4.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO . 7
2.4.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA . 9
2.4.4 Phƣơng pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating
activity) . 10
2.4.5 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) . 10
2.4.5.1 Giới thiệu . 10
2.4.5.2 Cấu tạo . 10
2.4.5.3 Cơ chế hoạt động của enzyme XO . 10
2.4.5.4 Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO . 11
3. Giới thiệu phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào . 12
3.1 Nuôi cấy tế bào . 12
3.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào . 13
3.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào. 13
3.2.2 Phƣơng pháp SRB. 13
4. Tổng quan các chất nghiên cứu thuộc họ lignan và stilbene . 14
4.1 Lignan . 14
4.1.1 Isotaxiresinol (ITR) . 15
4.1.2 Secoisolariciresinol (SSR) . 15
4.2 Stilbene . 16
4.2.1 Resveratrol (RES) . 17
4.2.2 Pterostilbene (PTS) . 18
4.2.3 Piceatannol (PI) . 19
5. Kết quả và thảo luận . 21
5.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa . 21
5.1.1 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH. 21
5.1.2 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO . 25
5.1.3 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme XO . 27
5.1.4 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa . 28
5.2 Kết quả nghiên cứu độc tính tế bào . 31
5.2.1 Isotaxiresinol . 31
5.2.2 Secoisolariciresinol . 34
5.2.3 Resveratrol, Pterostilbene và Piceatannol . 37
5.2.4 Tóm tắt kết quả nghiên cứu độc tính tế bào . 42
6. Thực nghiệm . 45
6.1 Hóa chất và công cụ . 45
6.1.1 Hóa chất . 45
6.1.2 công cụ thí nghiệm . 46
6.1.3 Chuẩn bị mẫu . 47
6.1.4 IC50 và cách xác định . 48
6.1.4.1 Định nghĩa . 48
6.1.4.2 Cách xác định IC50. 48
6.2 Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa . 49
6.2.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH . 49
6.2.1.1 Nguyên tắc . 49
6.2.1.2 Quy trình thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH. 49
6.2.1.3 Chuẩn bị hóa chất . 50
6.2.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO . 51
6.2.2.1 Nguyên tắc . 51
6.2.2.2 Chuẩn bị hóa chất . 52
6.2.2.3 Sơ đồ biểu diễn quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO . 52
6.2.3 Phƣơng pháp ức chế enzyme XO . 54
6.2.3.1 Nguyên tắc . 54
6.2.3.2 Chuẩn bị hóa chất . 54
6.2.3.3 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO . 54
6.3 Nghiên cứu độc tính tế bào . 56
6.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào. 56
6.3.2 Phƣơng pháp SRB. 57
7. Tài Liệu Tham Khảo . 63
1. Giới thiệu đề tài
Mặc dù việc sử dụng các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học nhƣ
là các loại thuốc thảo dƣợc có từ cách đây vài trăm năm và thậm chí vài ngàn
năm, tuy nhiên việc cô lập và mô tả các hợp chất đóng góp vào sự phát triển và
khám phá các loại dƣợc phẩm hiện đại chỉ mới bắt đầu từ thế kỷ 19, mở đầu cho
kỷ nguyên hóa học trị liệu của các hợp chất thiên nhiên.
Hóa dƣợc ngày nay phát triển dựa trên nền tảng của sự phát triển của hóa
học các hợp chất có hoạt tính sinh học, là cầu nối của nhiều lĩnh vực khác nhau,
bao gồm sự cô lập và mô tả đặc tính của các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn
gốc thiên nhiên, sự thay đổi cấu trúc để có sự tối ƣu hóa hoạt tính và các tính chất
vật lý khác, sự tổng hợp hoàn toàn hay bán tổng hợp cho quá trình nghiên cứu
sâu mối quan hệ giữa hoạt tính và cấu trúc của các chất. Thêm vào đó, quá trình
tổng hợp các sản phẩm tự nhiên cũng đóng vai trò thiết yếu trong việc giải quyết
vấn đề cung cấp và quảng bá dƣợc phẩm.
Từ những năm 1980, sự tiến bộ vƣợt bậc trong sinh học phân tử, hóa học
tính toán, hóa học tổ hợp, và các kỹ thuật khảo sát lâm sàng nhanh đã định hình
lại ngành công nghiệp dƣợc phẩm và thay đổi cái nhìn của chúng ta vào các sản
phẩm tự nhiên. Một khi con ngƣời đã nghĩ rằng sự khám phá các sản phẩm tự
nhiên ít có giá trị vì quá trình đòi hỏi rất nhiều thời gian và do đó là không kinh
tế. Tuy nhiên, các sản phẩm tự nhiên đã vẫn tiếp tục tồn tại nhƣ là kết quả của
quá trình nghiên cứu không thành công của hóa học tổ hợp và khảo sát lâm sàng.
Từ đó, một lần nữa con ngƣời đã bắt đầu hiểu rõ giá trị của các sản phẩm tự
nhiên và làm sống lại nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên bằng cách kết hợp các
kỹ thuật tách và xác định nhanh, tổng hợp song song, tính toán và có lẽ thêm
nhiều kỹ thuật mới vào trong hóa dƣợc của các hợp chất thiên nhiên29.
Các hợp chất phenolic thay mặt cho một nhóm lớn của các phân tử với các
nhóm chức khác nhau bao gồm nhiều loại nhƣ: các phenolic đơn giản (C6),
phenolic acid và các dẫn xuất (C6-C1), acetophenone và phenylacetic acid, (C6-
C2), cinnamic acid, cinnamyl aldehyde, cinnamyl alcohol, coumarin, isocoumarin
và chromone (C6-C3), chalcone, aurone, dihydrochalcone, flavan, flavone,
anthocyanidin, anthocyanin (C15), biflavonyl (C30), benzophenon, xanthone,
2
stilbene (C6-C1-C6, C6-C2-C6), quinone (C6, C10, C14), betacyanin (C18), dimer
hay oligomer (lignan và neolignan), polymer (lignin), oligomer hay polymer
(tannin), polymer (phlobaphene)
55
.
Trong những thành phần thuộc họ phenolic đã đƣợc liệt kê ở trên, có lẽ
trans-resveratrol (RES), một hợp chất stilbene có nhiều trong quả nho, đậu
phộng, đậu nành,… đã đƣợc nghiên cứu nhiều về hoạt tính sinh học. Các công bố
khoa học cho thấy RES có các hoạt tính nhƣ kháng viêm, chống oxy hóa, ức chế
sinh trƣởng tế bào và các thuộc tính ngăn ngừa và bảo vệ tim mạch,... Ngoài ra,
RES cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn 4,13,16,20,26,30,36,37,39,46,47,48,49,58.
Các hợp chất stilbene khác, cụ thể là trans-piceatannol (PIC) và trans-
pterostilbene (TPS), cũng đƣợc báo cáo là thể hiện các hoạt tính ngăn ngừa bệnh,
kháng viêm và chống oxi hóa. Các nghiên cứu sự ức chế sinh trƣởng hay chu
trình chết apoptosis đƣợc thực hiện trên các dòng tế bào lymphocyte, tế bào
melanocyte, các tế bào dạng biểu bì 13,27,36,37,46,50.
Trong khi đó, các hợp chất lignan đƣợc biết đến nhƣ là những estrogen
thực vật, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Ngoài ra, các lignan nhƣ
secoisolariciresinol (SSR) và isotaxiresinol (ITR) đƣợc công bố có hoạt tính ức
chế chu trình chết của khối u gan 11,12,16,17,24,25.
Từ các kết quả nghiên cứu về hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào
của RES nên hiện nay hợp chất này đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các loại dƣợc
phẩm hiện có trên thị trƣờng. Trong khi đó, các hợp chất khác thuộc họ phenolic
cũng đƣợc tìm thấy có nhiều hoạt tính sinh học nhƣng ít đƣợc sử dụng. Do đó
mục tiêu của đề tài này là xác định và so sánh hoạt tính chống oxy hóa và độc
tính tế bào trên dòng tế bào DLD-1 của các hoạt chất RES, PTS, PI thuộc họ
stilbene và SSR, ITR thuộc họ lignan. Từ đó đề ra các hƣớng ứng dụng mới cho
hợp chất tiềm năng và có thể thay thế RES.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
MỤC LỤC
Trang phụ bìa .
Lời Cảm Ơn . I
MỤC LỤC . II
DANH MỤC CÁC BẢNG . VII
DANH MỤC CÁC HÌNH . VIII
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ . IX
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ . X
1. Giới thiệu đề tài . 1
2. Giới thiệu một số phƣơng pháp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa . 3
2.1 Khái niệm về gốc tự do . 3
2.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể . 3
2.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể . 4
2.4 Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa . 6
2.4.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH . 6
2.4.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO . 7
2.4.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA . 9
2.4.4 Phƣơng pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating
activity) . 10
2.4.5 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) . 10
2.4.5.1 Giới thiệu . 10
2.4.5.2 Cấu tạo . 10
2.4.5.3 Cơ chế hoạt động của enzyme XO . 10
2.4.5.4 Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO . 11
3. Giới thiệu phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào . 12
3.1 Nuôi cấy tế bào . 12
3.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào . 13
3.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào. 13
3.2.2 Phƣơng pháp SRB. 13
4. Tổng quan các chất nghiên cứu thuộc họ lignan và stilbene . 14
4.1 Lignan . 14
4.1.1 Isotaxiresinol (ITR) . 15
4.1.2 Secoisolariciresinol (SSR) . 15
4.2 Stilbene . 16
4.2.1 Resveratrol (RES) . 17
4.2.2 Pterostilbene (PTS) . 18
4.2.3 Piceatannol (PI) . 19
5. Kết quả và thảo luận . 21
5.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa . 21
5.1.1 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH. 21
5.1.2 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO . 25
5.1.3 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme XO . 27
5.1.4 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa . 28
5.2 Kết quả nghiên cứu độc tính tế bào . 31
5.2.1 Isotaxiresinol . 31
5.2.2 Secoisolariciresinol . 34
5.2.3 Resveratrol, Pterostilbene và Piceatannol . 37
5.2.4 Tóm tắt kết quả nghiên cứu độc tính tế bào . 42
6. Thực nghiệm . 45
6.1 Hóa chất và công cụ . 45
6.1.1 Hóa chất . 45
6.1.2 công cụ thí nghiệm . 46
6.1.3 Chuẩn bị mẫu . 47
6.1.4 IC50 và cách xác định . 48
6.1.4.1 Định nghĩa . 48
6.1.4.2 Cách xác định IC50. 48
6.2 Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa . 49
6.2.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH . 49
6.2.1.1 Nguyên tắc . 49
6.2.1.2 Quy trình thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH. 49
6.2.1.3 Chuẩn bị hóa chất . 50
6.2.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO . 51
6.2.2.1 Nguyên tắc . 51
6.2.2.2 Chuẩn bị hóa chất . 52
6.2.2.3 Sơ đồ biểu diễn quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO . 52
6.2.3 Phƣơng pháp ức chế enzyme XO . 54
6.2.3.1 Nguyên tắc . 54
6.2.3.2 Chuẩn bị hóa chất . 54
6.2.3.3 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO . 54
6.3 Nghiên cứu độc tính tế bào . 56
6.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào. 56
6.3.2 Phƣơng pháp SRB. 57
7. Tài Liệu Tham Khảo . 63
1. Giới thiệu đề tài
Mặc dù việc sử dụng các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học nhƣ
là các loại thuốc thảo dƣợc có từ cách đây vài trăm năm và thậm chí vài ngàn
năm, tuy nhiên việc cô lập và mô tả các hợp chất đóng góp vào sự phát triển và
khám phá các loại dƣợc phẩm hiện đại chỉ mới bắt đầu từ thế kỷ 19, mở đầu cho
kỷ nguyên hóa học trị liệu của các hợp chất thiên nhiên.
Hóa dƣợc ngày nay phát triển dựa trên nền tảng của sự phát triển của hóa
học các hợp chất có hoạt tính sinh học, là cầu nối của nhiều lĩnh vực khác nhau,
bao gồm sự cô lập và mô tả đặc tính của các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn
gốc thiên nhiên, sự thay đổi cấu trúc để có sự tối ƣu hóa hoạt tính và các tính chất
vật lý khác, sự tổng hợp hoàn toàn hay bán tổng hợp cho quá trình nghiên cứu
sâu mối quan hệ giữa hoạt tính và cấu trúc của các chất. Thêm vào đó, quá trình
tổng hợp các sản phẩm tự nhiên cũng đóng vai trò thiết yếu trong việc giải quyết
vấn đề cung cấp và quảng bá dƣợc phẩm.
Từ những năm 1980, sự tiến bộ vƣợt bậc trong sinh học phân tử, hóa học
tính toán, hóa học tổ hợp, và các kỹ thuật khảo sát lâm sàng nhanh đã định hình
lại ngành công nghiệp dƣợc phẩm và thay đổi cái nhìn của chúng ta vào các sản
phẩm tự nhiên. Một khi con ngƣời đã nghĩ rằng sự khám phá các sản phẩm tự
nhiên ít có giá trị vì quá trình đòi hỏi rất nhiều thời gian và do đó là không kinh
tế. Tuy nhiên, các sản phẩm tự nhiên đã vẫn tiếp tục tồn tại nhƣ là kết quả của
quá trình nghiên cứu không thành công của hóa học tổ hợp và khảo sát lâm sàng.
Từ đó, một lần nữa con ngƣời đã bắt đầu hiểu rõ giá trị của các sản phẩm tự
nhiên và làm sống lại nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên bằng cách kết hợp các
kỹ thuật tách và xác định nhanh, tổng hợp song song, tính toán và có lẽ thêm
nhiều kỹ thuật mới vào trong hóa dƣợc của các hợp chất thiên nhiên29.
Các hợp chất phenolic thay mặt cho một nhóm lớn của các phân tử với các
nhóm chức khác nhau bao gồm nhiều loại nhƣ: các phenolic đơn giản (C6),
phenolic acid và các dẫn xuất (C6-C1), acetophenone và phenylacetic acid, (C6-
C2), cinnamic acid, cinnamyl aldehyde, cinnamyl alcohol, coumarin, isocoumarin
và chromone (C6-C3), chalcone, aurone, dihydrochalcone, flavan, flavone,
anthocyanidin, anthocyanin (C15), biflavonyl (C30), benzophenon, xanthone,
2
stilbene (C6-C1-C6, C6-C2-C6), quinone (C6, C10, C14), betacyanin (C18), dimer
hay oligomer (lignan và neolignan), polymer (lignin), oligomer hay polymer
(tannin), polymer (phlobaphene)
55
.
Trong những thành phần thuộc họ phenolic đã đƣợc liệt kê ở trên, có lẽ
trans-resveratrol (RES), một hợp chất stilbene có nhiều trong quả nho, đậu
phộng, đậu nành,… đã đƣợc nghiên cứu nhiều về hoạt tính sinh học. Các công bố
khoa học cho thấy RES có các hoạt tính nhƣ kháng viêm, chống oxy hóa, ức chế
sinh trƣởng tế bào và các thuộc tính ngăn ngừa và bảo vệ tim mạch,... Ngoài ra,
RES cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn 4,13,16,20,26,30,36,37,39,46,47,48,49,58.
Các hợp chất stilbene khác, cụ thể là trans-piceatannol (PIC) và trans-
pterostilbene (TPS), cũng đƣợc báo cáo là thể hiện các hoạt tính ngăn ngừa bệnh,
kháng viêm và chống oxi hóa. Các nghiên cứu sự ức chế sinh trƣởng hay chu
trình chết apoptosis đƣợc thực hiện trên các dòng tế bào lymphocyte, tế bào
melanocyte, các tế bào dạng biểu bì 13,27,36,37,46,50.
Trong khi đó, các hợp chất lignan đƣợc biết đến nhƣ là những estrogen
thực vật, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Ngoài ra, các lignan nhƣ
secoisolariciresinol (SSR) và isotaxiresinol (ITR) đƣợc công bố có hoạt tính ức
chế chu trình chết của khối u gan 11,12,16,17,24,25.
Từ các kết quả nghiên cứu về hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào
của RES nên hiện nay hợp chất này đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các loại dƣợc
phẩm hiện có trên thị trƣờng. Trong khi đó, các hợp chất khác thuộc họ phenolic
cũng đƣợc tìm thấy có nhiều hoạt tính sinh học nhƣng ít đƣợc sử dụng. Do đó
mục tiêu của đề tài này là xác định và so sánh hoạt tính chống oxy hóa và độc
tính tế bào trên dòng tế bào DLD-1 của các hoạt chất RES, PTS, PI thuộc họ
stilbene và SSR, ITR thuộc họ lignan. Từ đó đề ra các hƣớng ứng dụng mới cho
hợp chất tiềm năng và có thể thay thế RES.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
-
4.pdf
-
0_2.pdf
-
1_2.pdf
-
2_2.pdf
-
3.pdf
-
5_2.pdf
-
6_4.pdf
-
7.pdf
-
8.pdf
-
9.pdf
-
10_3.pdf
You must be registered for see links